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生物技术与分离提取生物技术与分离提取第七章第七章第1页惯用分离提取技术方法：惯用分离提取技术方法：1、破碎法分离提取技术、破碎法分离提取技术2、离心分离提取技术、离心分离提取技术3、超声波萃取分离法、超声波萃取分离法4、微波萃取分离法、微波萃取分离法5、气浮分离法、气浮分离法6、色谱法（包含纸色谱、薄层色谱法）、色谱法（包含纸色谱、薄层色谱法）7、超临界流体萃取等新兴方法。、超临界流体萃取等新兴方法。8、膜分离技术、膜分离技术第2页一、惯用破碎法方法一、惯用破碎法方法作作作作用用用用方法方法方法方法机械机械机械机械液体剪切液体剪切液体剪切液体剪切超声波超声波超声波超声波 机械搅拌压力机械搅拌压力机械搅拌压力机械搅拌压力固体剪切固体剪切固体剪切固体剪切研磨研磨研磨研磨杆和臼杆和臼杆和臼杆和臼 球磨机球磨机球磨机球磨机压力压力压力压力HughesHughes压榨机压榨机压榨机压榨机XX压榨机压榨机压榨机压榨机非机械非机械非机械非机械脱水脱水脱水脱水空气干燥空气干燥空气干燥空气干燥 真空干燥真空干燥真空干燥真空干燥 冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥 溶剂干燥溶剂干燥溶剂干燥溶剂干燥溶胞作用溶胞作用溶胞作用溶胞作用物理作用物理作用物理作用物理作用渗透冲击渗透冲击渗透冲击渗透冲击 压力释放压力释放压力释放压力释放 冻结和融化冻结和融化冻结和融化冻结和融化化学作用化学作用化学作用化学作用阳阴离子洗涤剂阳阴离子洗涤剂阳阴离子洗涤剂阳阴离子洗涤剂 抗生素抗生素抗生素抗生素 甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸酶作用酶作用酶作用酶作用n n溶菌酶和相关酶噬溶菌酶和相关酶噬 菌菌体溶胞体溶胞 抗菌素抗菌素第3页二、离心分离技术二、离心分离技术 离心分离技术是借助于离心机旋转所产生离心力，离心分离技术是借助于离心机旋转所产生离心力，离心分离技术是借助于离心机旋转所产生离心力，离心分离技术是借助于离心机旋转所产生离心力，依据物质颗粒沉降系数、质量、密度及浮力等因子依据物质颗粒沉降系数、质量、密度及浮力等因子依据物质颗粒沉降系数、质量、密度及浮力等因子依据物质颗粒沉降系数、质量、密度及浮力等因子不一样，而使物质分离技术。不一样，而使物质分离技术。不一样，而使物质分离技术。不一样，而使物质分离技术。离心分离方法：离心分离方法：离心分离方法：离心分离方法：1 1、差速离心、差速离心、差速离心、差速离心2 2、密度梯度离心、密度梯度离心、密度梯度离心、密度梯度离心3 3、等密度离心、等密度离心、等密度离心、等密度离心 第4页离心分离方法 采取不一样离心速度和离心时间，使沉降速度不一样颗粒分批分离方法，称为差速离心。操作时，采取均匀悬浮液进行离心，选择好离心力和离心时间，使大颗粒先沉降，取出上清液，在加大离心力条件下再进行离心，分离较小颗粒。如此屡次离心，使不一样大小颗粒分批分离。差速离心所得到沉降物含有较多杂质，需经过重新悬浮和再离心若干次，才能取得较纯分离产物。差速离心主要用于分离大小和密度差异较大颗粒。操作简单方便，但分离效果较差。1 1差速离心差速离心第5页密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使密度不一样组分得以分离一个区带分离方法。密度梯度系统是在溶剂中加入一定梯度介质制成。梯度介质应有足够大溶解度，以形成所需密度，不与分离组分反应，而且不会引发分离组分凝聚、变性或失活，惯用有蔗糖、甘油等。使用最多是蔗糖密度梯度系统，其梯度范围是：蔗糖浓度5%60%，密度1.021.30g/cm3。2 2密度梯度离心密度梯度离心离心分离方法第6页密度梯度制备可采取梯度混合器，也可将不一样浓度蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠管底，浓度越高，形成阶梯梯度。离心前，把样品小心地铺放在预先制备好密度梯度溶液表面。离心后，不一样大小、不一样形状、有一定沉降系数差异颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚不连续区带。各区带内颗粒较均一，分离效果很好。第7页在密度梯度离心过程中，区带位置和宽度随离心时间不一样而改变。随离心时间加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当增大离心力而缩短离心时间，可降低区带扩宽。第8页将CsCl2、CsSO4等介质溶液与样品溶液混合，然后在选定离心力作用下，经足够时间离心，铯盐在离心场中沉降形成密度梯度，样品中不一样浮力密度颗粒在各自等密度点位置上形成区带。前述密度梯度离心法中，欲分离颗粒未到达其等密度位置，故分离效果不如等密度离心法好。3 3等密度离心等密度离心离心分离方法第9页应该注意是，铯盐浓度过高和离心力过大时，铯盐会沉淀管底，严重时会造成事故，故等密度梯度离心需由专业人员经严格计算确定铯盐浓度和离心机转速及离心时间。另外，铯盐对铝合金转子有很强腐蚀性，故最好使用钛合金转子，转子使用后要仔细清洗并干燥。第10页1、低速离心机，其最大转速在、低速离心机，其最大转速在8000r/min以内，以内，相对离心力在相对离心力在l0000g以下以下2、高速离心机，转速：、高速离心机，转速：l000025000r/min，相对离心力达相对离心力达l0000l00000g3、超速离心机，转速：超速离心机，转速：2500080000r/min，最大相对离心力达最大相对离心力达500000g。按照分离要求，。按照分离要求，还能够进行差速离心还能够进行差速离心、密度梯度离心、密度梯度离心和等密和等密度离心。度离心。惯用离心机种类惯用离心机种类第11页离心条件确定离心条件确定 n n离心力离心力离心力离心力 n n离心时间（与颗粒沉降时间相关）离心时间（与颗粒沉降时间相关）离心时间（与颗粒沉降时间相关）离心时间（与颗粒沉降时间相关）n n温度和温度和温度和温度和pHpH值（预防欲分离物质凝集、变性和失活）值（预防欲分离物质凝集、变性和失活）值（预防欲分离物质凝集、变性和失活）值（预防欲分离物质凝集、变性和失活）n：转子每分钟转数，r/min第12页超声波在传递过程中存在着正负压强交变周期，超声波在传递过程中存在着正负压强交变周期，超声波在传递过程中存在着正负压强交变周期，超声波在传递过程中存在着正负压强交变周期，在正相位时，对介质分子产生挤压，增加介质原来密在正相位时，对介质分子产生挤压，增加介质原来密在正相位时，对介质分子产生挤压，增加介质原来密在正相位时，对介质分子产生挤压，增加介质原来密度；负相位时，介质分子稀散，介质密度减小。度；负相位时，介质分子稀散，介质密度减小。度；负相位时，介质分子稀散，介质密度减小。度；负相位时，介质分子稀散，介质密度减小。三、超声波萃取分离法三、超声波萃取分离法超声波萃取仪超声波萃取仪第13页 超声波并不能使样品内分子产生极化，而超声波并不能使样品内分子产生极化，而是在溶剂和样品之间产生声波空化作用，造成是在溶剂和样品之间产生声波空化作用，造成溶液内气泡形成、增加和爆破压缩，从而使固溶液内气泡形成、增加和爆破压缩，从而使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间接触面体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间接触面积，提升目标物从固相转移到液相传质速率。积，提升目标物从固相转移到液相传质速率。第14页四、微波萃取分离法四、微波萃取分离法 通常，萃取溶剂和固体样品中目标物由不一样极通常，萃取溶剂和固体样品中目标物由不一样极通常，萃取溶剂和固体样品中目标物由不一样极通常，萃取溶剂和固体样品中目标物由不一样极性分子组成，萃取体系在微波电磁场作用下，含有性分子组成，萃取体系在微波电磁场作用下，含有性分子组成，萃取体系在微波电磁场作用下，含有性分子组成，萃取体系在微波电磁场作用下，含有一定极性分子从原来热运动状态转为跟随微波交变一定极性分子从原来热运动状态转为跟随微波交变一定极性分子从原来热运动状态转为跟随微波交变一定极性分子从原来热运动状态转为跟随微波交变电磁场而快速排列取向。电磁场而快速排列取向。电磁场而快速排列取向。电磁场而快速排列取向。微波萃取仪微波萃取仪第15页 在这一微观过程中，微波能量转化为样品内能量，从而降低目标物与样品结协力，其次微波所产生电磁场加速被萃取组分由样品内部向萃取溶 剂界面扩散速率。缩短萃取组分分子由样品内部扩散到萃取溶剂界面时间，从而提高萃取速率。第16页原理：表面活性剂在水溶液中易被吸附到气泡气原理：表面活性剂在水溶液中易被吸附到气泡气液界面上。表面活性剂极性一端向着水相，非极性一液界面上。表面活性剂极性一端向着水相，非极性一端向着气相，含有待分离离子、分子水溶液中表面活端向着气相，含有待分离离子、分子水溶液中表面活性剂极性端与水相中离子或其极性分子经过物理性剂极性端与水相中离子或其极性分子经过物理(如静如静电引力电引力)或化学（如配位反应）作用连接在一起。当通或化学（如配位反应）作用连接在一起。当通入气泡时，表面活性剂就将这些物质连在一起定向排入气泡时，表面活性剂就将这些物质连在一起定向排列在气列在气液界面，被气泡带到液面，形成泡沫层，从液界面，被气泡带到液面，形成泡沫层，从而到达分离目标。而到达分离目标。五、气浮分离法五、气浮分离法第17页气浮分离法气浮分离法第18页利用混合物中各组分物理化学性质利用混合物中各组分物理化学性质利用混合物中各组分物理化学性质利用混合物中各组分物理化学性质（分子形状和大（分子形状和大（分子形状和大（分子形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）不一样，使各组分以不一样程度分布在两相中，其不一样，使各组分以不一样程度分布在两相中，其不一样，使各组分以不一样程度分布在两相中，其不一样，使各组分以不一样程度分布在两相中，其中一个相是固定，称固定相，另一个相是流动，称中一个相是固定，称固定相，另一个相是流动，称中一个相是固定，称固定相，另一个相是流动，称中一个相是固定，称固定相，另一个相是流动，称为流动相，当流动相流过固定相时，各组分以不一为流动相，当流动相流过固定相时，各组分以不一为流动相，当流动相流过固定相时，各组分以不一为流动相，当流动相流过固定相时，各组分以不一样速度移动，而到达分离目标。样速度移动，而到达分离目标。样速度移动，而到达分离目标。样速度移动，而到达分离目标。六、色谱分离技术六、色谱分离技术第19页1、纸上色谱分离法、纸上色谱分离法纸上色谱分离法原理：纸上色谱分离法原理：纸上色谱分离法是依据不一样物质在固定相和流动相间分配比不一样而进行分离。固定相固定相：滤纸利用纸上吸着水分(普通纸吸着约等于本身质量20水分)流动相流动相：有机溶剂操作操作：点样、展开、干燥、显色得到色谱图、测定(定性和定量)第20页纸上色谱纸上色谱纸上色谱纸上色谱简单装置简单装置第21页展开方式：上行法：展开速度慢、轻易到达平衡，分离效果好下行法：展开速度快、适合用于易分离组分分离双向法：使用两种展开剂、90度展开、适合用于难分离混合物分离第22页比移值Rf)：Rfa/ba为斑点中心到原点距离cmb为溶剂前沿到原点距离cmRf值最大等于1，最小等于。Rf值是衡量各组分分离情况数值Rf值相差越大，分离效果越好使用Rf值定性比移值比移值第23页原理：原理：薄层色谱分离法是将固定相吸附剂薄层色谱分离法是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中各均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中各组分在固定相和作为展开剂流动相之间不组分在固定相和作为展开剂流动相之间不停地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附分停地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附分配过程。不一样物质上升距离不一样而形配过程。不一样物质上升距离不一样而形成相互分开斑点从而到达分离。成相互分开斑点从而到达分离。2、薄层色谱分离法、薄层色谱分离法第24页层析缸层析缸层析槽层析槽1.层析槽层析槽2.薄层板薄层板3.垫架垫架4.垫板展开缸和展开槽展开垫板展开缸和展开槽展开第25页3、吸附色谱、吸附色谱 利用吸附剂对不一样物质吸附力不一样、而使混利用吸附剂对不一样物质吸附力不一样、而使混利用吸附剂对不一样物质吸附力不一样、而使混利用吸附剂对不一样物质吸附力不一样、而使混合物中各组分分离方法。吸附色谱分离技术是各种合物中各组分分离方法。吸附色谱分离技术是各种合物中各组分分离方法。吸附色谱分离技术是各种合物中各组分分离方法。吸附色谱分离技术是各种色谱技术中应用得最早一类。因为吸附剂起源丰富，色谱技术中应用得最早一类。因为吸附剂起源丰富，色谱技术中应用得最早一类。因为吸附剂起源丰富，色谱技术中应用得最早一类。因为吸附剂起源丰富，价格低廉，易再生，装置简单，又含有一定分辨率价格低廉，易再生，装置简单，又含有一定分辨率价格低廉，易再生，装置简单，又含有一定分辨率价格低廉，易再生，装置简单，又含有一定分辨率等优点，故至今仍广泛应用。等优点，故至今仍广泛应用。等优点，故至今仍广泛应用。等优点，故至今仍广泛应用。第26页吸附剂与被吸附物分子之间相互作用是由范德华吸附剂与被吸附物分子之间相互作用是由范德华吸附剂与被吸附物分子之间相互作用是由范德华吸附剂与被吸附物分子之间相互作用是由范德华力所引发，其特点是可逆，即在一定条件下，被吸力所引发，其特点是可逆，即在一定条件下，被吸力所引发，其特点是可逆，即在一定条件下，被吸力所引发，其特点是可逆，即在一定条件下，被吸附物能够离开吸附剂表面，这称为解吸作用。附物能够离开吸附剂表面，这称为解吸作用。附物能够离开吸附剂表面，这称为解吸作用。附物能够离开吸附剂表面，这称为解吸作用。吸附色谱柱示意图吸附色谱柱示意图第27页n n溶剂洗脱法：加入样品溶溶剂洗脱法：加入样品溶溶剂洗脱法：加入样品溶溶剂洗脱法：加入样品溶液后，连续不停地加入洗液后，连续不停地加入洗液后，连续不停地加入洗液后，连续不停地加入洗脱剂进行冲洗，最初流出脱剂进行冲洗，最初流出脱剂进行冲洗，最初流出脱剂进行冲洗，最初流出液为纯溶剂，然后是吸附液为纯溶剂，然后是吸附液为纯溶剂，然后是吸附液为纯溶剂，然后是吸附力最弱组分，以后逐次出力最弱组分，以后逐次出力最弱组分，以后逐次出力最弱组分，以后逐次出现物质是按吸附力由弱到现物质是按吸附力由弱到现物质是按吸附力由弱到现物质是按吸附力由弱到强次序分别洗出，吸附力强次序分别洗出，吸附力强次序分别洗出，吸附力强次序分别洗出，吸附力量强物质最终洗脱出来。量强物质最终洗脱出来。量强物质最终洗脱出来。量强物质最终洗脱出来。n n置换法置换法置换法置换法n n前缘洗脱法前缘洗脱法前缘洗脱法前缘洗脱法 洗脱洗脱溶剂洗脱液曲线溶剂洗脱液曲线溶剂洗脱液曲线溶剂洗脱液曲线 第28页吸附剂与洗脱剂选择吸附剂与洗脱剂选择 吸附剂应含有性质：吸附剂应含有性质：吸附剂应含有性质：吸附剂应含有性质：(1)(1)(1)(1)吸附剂应有适当吸附力，表面积吸附剂应有适当吸附力，表面积吸附剂应有适当吸附力，表面积吸附剂应有适当吸附力，表面积大；大；大；大；(2)(2)(2)(2)吸附剂对被分离物有足够分辨力，吸附剂对被分离物有足够分辨力，吸附剂对被分离物有足够分辨力，吸附剂对被分离物有足够分辨力，即对不一样物质吸附力有所不一即对不一样物质吸附力有所不一即对不一样物质吸附力有所不一即对不一样物质吸附力有所不一样；样；样；样；(3)(3)(3)(3)吸附剂对被吸附物吸附应是可逆，吸附剂对被吸附物吸附应是可逆，吸附剂对被吸附物吸附应是可逆，吸附剂对被吸附物吸附应是可逆，即在一定条件下能够解吸，方便即在一定条件下能够解吸，方便即在一定条件下能够解吸，方便即在一定条件下能够解吸，方便洗脱；洗脱；洗脱；洗脱；(4)(4)(4)(4)吸附剂不会溶解在所采取溶剂中，吸附剂不会溶解在所采取溶剂中，吸附剂不会溶解在所采取溶剂中，吸附剂不会溶解在所采取溶剂中，也不会引发被吸附物化学改变；也不会引发被吸附物化学改变；也不会引发被吸附物化学改变；也不会引发被吸附物化学改变；(5)(5)(5)(5)吸附剂颗粒均匀，在操作时稳定，吸附剂颗粒均匀，在操作时稳定，吸附剂颗粒均匀，在操作时稳定，吸附剂颗粒均匀，在操作时稳定，不会破裂。不会破裂。不会破裂。不会破裂。洗脱剂应含有性质：洗脱剂应含有性质：洗脱剂应含有性质：洗脱剂应含有性质：(1)(1)(1)(1)洗脱剂不与吸附剂起化学反应，洗脱剂不与吸附剂起化学反应，洗脱剂不与吸附剂起化学反应，洗脱剂不与吸附剂起化学反应，不会使吸附剂溶解；不会使吸附剂溶解；不会使吸附剂溶解；不会使吸附剂溶解；(2)(2)(2)(2)洗脱剂对样品中各组分溶解度洗脱剂对样品中各组分溶解度洗脱剂对样品中各组分溶解度洗脱剂对样品中各组分溶解度大，粘度小，流动性好，轻易大，粘度小，流动性好，轻易大，粘度小，流动性好，轻易大，粘度小，流动性好，轻易与被洗脱组分分开；与被洗脱组分分开；与被洗脱组分分开；与被洗脱组分分开；(3)(3)(3)(3)洗脱剂纯度要高，免受杂质影洗脱剂纯度要高，免受杂质影洗脱剂纯度要高，免受杂质影洗脱剂纯度要高，免受杂质影响。响。响。响。惯用洗脱剂有饱和烃、醇、酚、惯用洗脱剂有饱和烃、醇、酚、惯用洗脱剂有饱和烃、醇、酚、惯用洗脱剂有饱和烃、醇、酚、酮、醚、卤代烷以及水等。极性酮、醚、卤代烷以及水等。极性酮、醚、卤代烷以及水等。极性酮、醚、卤代烷以及水等。极性较大洗脱能力较强。较大洗脱能力较强。较大洗脱能力较强。较大洗脱能力较强。第29页4 4、分配色谱、分配色谱 n n 分配色谱是利用各组分分配系数不一样而给予分离方法。分配色谱是利用各组分分配系数不一样而给予分离方法。分配色谱是利用各组分分配系数不一样而给予分离方法。分配色谱是利用各组分分配系数不一样而给予分离方法。n n 分配色谱中，通常采取一个多孔性固体支持物吸着一个溶分配色谱中，通常采取一个多孔性固体支持物吸着一个溶分配色谱中，通常采取一个多孔性固体支持物吸着一个溶分配色谱中，通常采取一个多孔性固体支持物吸着一个溶剂作为固定相，另一个与固定相溶剂互不相溶溶剂能够沿剂作为固定相，另一个与固定相溶剂互不相溶溶剂能够沿剂作为固定相，另一个与固定相溶剂互不相溶溶剂能够沿剂作为固定相，另一个与固定相溶剂互不相溶溶剂能够沿固定相流动，称为流动相。固定相流动，称为流动相。固定相流动，称为流动相。固定相流动，称为流动相。n n 当某溶质在流动相带动下流经固定相时，该溶质在两相之当某溶质在流动相带动下流经固定相时，该溶质在两相之当某溶质在流动相带动下流经固定相时，该溶质在两相之当某溶质在流动相带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续动态分配，因为各物质有不一样分配系数，移间进行连续动态分配，因为各物质有不一样分配系数，移间进行连续动态分配，因为各物质有不一样分配系数，移间进行连续动态分配，因为各物质有不一样分配系数，移动速率也就不相同，从而到达分离目标。动速率也就不相同，从而到达分离目标。动速率也就不相同，从而到达分离目标。动速率也就不相同，从而到达分离目标。第30页n n分配系数是指一个溶质在两种互不相溶溶剂中溶分配系数是指一个溶质在两种互不相溶溶剂中溶分配系数是指一个溶质在两种互不相溶溶剂中溶分配系数是指一个溶质在两种互不相溶溶剂中溶解到达平衡时，该溶质在两相溶剂中浓度比值。在解到达平衡时，该溶质在两相溶剂中浓度比值。在解到达平衡时，该溶质在两相溶剂中浓度比值。在解到达平衡时，该溶质在两相溶剂中浓度比值。在色谱条件确定后分配系数是一常数，以色谱条件确定后分配系数是一常数，以色谱条件确定后分配系数是一常数，以色谱条件确定后分配系数是一常数，以K K表示。表示。表示。表示。第31页5 5、离子交换色谱、离子交换色谱 离子交换色谱是利用离子交换剂上可解离基离子交换色谱是利用离子交换剂上可解离基离子交换色谱是利用离子交换剂上可解离基离子交换色谱是利用离子交换剂上可解离基团（活性基团），对各种离子亲和力不一样而到团（活性基团），对各种离子亲和力不一样而到团（活性基团），对各种离子亲和力不一样而到团（活性基团），对各种离子亲和力不一样而到达分离目标一个色谱分离技术，广泛应用于各种达分离目标一个色谱分离技术，广泛应用于各种达分离目标一个色谱分离技术，广泛应用于各种达分离目标一个色谱分离技术，广泛应用于各种物质分离纯化。物质分离纯化。物质分离纯化。物质分离纯化。第32页离子交换剂离子交换剂 n n含有若干活性基团不溶性高分子物质，即在不溶性母体上引入若干含有若干活性基团不溶性高分子物质，即在不溶性母体上引入若干含有若干活性基团不溶性高分子物质，即在不溶性母体上引入若干含有若干活性基团不溶性高分子物质，即在不溶性母体上引入若干可解离基团（活性基团）而成。可解离基团（活性基团）而成。可解离基团（活性基团）而成。可解离基团（活性基团）而成。n n不溶性母体高分子物质：苯乙烯树脂、酚醛树脂、纤维素、葡聚糖、不溶性母体高分子物质：苯乙烯树脂、酚醛树脂、纤维素、葡聚糖、不溶性母体高分子物质：苯乙烯树脂、酚醛树脂、纤维素、葡聚糖、不溶性母体高分子物质：苯乙烯树脂、酚醛树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖或其它聚合物。琼脂糖或其它聚合物。琼脂糖或其它聚合物。琼脂糖或其它聚合物。n n活性基团能够是酸性基团：磺酸基活性基团能够是酸性基团：磺酸基活性基团能够是酸性基团：磺酸基活性基团能够是酸性基团：磺酸基(-SO(-SO3 3H)H)，磷酸基，磷酸基，磷酸基，磷酸基(-PO(-PO3 3HH2 2)，亚磷，亚磷，亚磷，亚磷酸基酸基酸基酸基(-PO(-PO2 2H)H)，羧基，羧基，羧基，羧基(-COOH)(-COOH)，酚羟基，酚羟基，酚羟基，酚羟基(-OH)(-OH)等。引入酸性基团交换等。引入酸性基团交换等。引入酸性基团交换等。引入酸性基团交换剂可离解出剂可离解出剂可离解出剂可离解出HH+，与其它阳离子交换，这类离子交换剂属于阳离子交，与其它阳离子交换，这类离子交换剂属于阳离子交，与其它阳离子交换，这类离子交换剂属于阳离子交，与其它阳离子交换，这类离子交换剂属于阳离子交换剂。换剂。换剂。换剂。n n活性基团是碱性基团：季胺活性基团是碱性基团：季胺活性基团是碱性基团：季胺活性基团是碱性基团：季胺-N-N+(CH(CH3 3)3 3，叔胺，叔胺，叔胺，叔胺-N(CH-N(CH3 3)2 2，仲胺，仲胺，仲胺，仲胺-NHCHNHCH3 3，伯胺，伯胺，伯胺，伯胺-NH-NH2 2 等含氨基基团。引入含氨基碱性基团交换剂，等含氨基基团。引入含氨基碱性基团交换剂，等含氨基基团。引入含氨基碱性基团交换剂，等含氨基基团。引入含氨基碱性基团交换剂，可与可与可与可与OH-OH-结合后，与其它阴离子交换，这类离子交换剂属于阴离子交结合后，与其它阴离子交换，这类离子交换剂属于阴离子交结合后，与其它阴离子交换，这类离子交换剂属于阴离子交结合后，与其它阴离子交换，这类离子交换剂属于阴离子交换剂。换剂。换剂。换剂。第33页n n 强酸型阳离子交换剂（含有磺酸基强酸型阳离子交换剂（含有磺酸基强酸型阳离子交换剂（含有磺酸基强酸型阳离子交换剂（含有磺酸基-SO-SO3 3HH等）对各种等）对各种等）对各种等）对各种正离子亲和力次序为：正离子亲和力次序为：正离子亲和力次序为：正离子亲和力次序为：FeFe3+3+AlAl3+3+ZnZn2+2+CuCu2+2+NiNi2+2+CoCo2+2+FeFe2+2+BaBa2+2+CrCr2+2+CaCa2+2+MgMg2+2+CsCs+RbRb+KK+NaNa+HH+LiLi+n n 弱酸型阳离子交换剂（含有羧基弱酸型阳离子交换剂（含有羧基弱酸型阳离子交换剂（含有羧基弱酸型阳离子交换剂（含有羧基-COOH-COOH，酚羟基，酚羟基，酚羟基，酚羟基-OH-OH等）对氢离子等）对氢离子等）对氢离子等）对氢离子(H(H+)亲和力尤其高。所以转为氢型时很亲和力尤其高。所以转为氢型时很亲和力尤其高。所以转为氢型时很亲和力尤其高。所以转为氢型时很轻易，仅需极少许酸即可。轻易，仅需极少许酸即可。轻易，仅需极少许酸即可。轻易，仅需极少许酸即可。第34页弱碱性阴离子交换剂对氢氧根离子弱碱性阴离子交换剂对氢氧根离子弱碱性阴离子交换剂对氢氧根离子弱碱性阴离子交换剂对氢氧根离子(OH(OH-)有较高亲有较高亲有较高亲有较高亲和力，易于转变为羟型。和力，易于转变为羟型。和力，易于转变为羟型。和力，易于转变为羟型。阳离子只能被阳离子交换剂吸附，阴离子只能被阴阳离子只能被阳离子交换剂吸附，阴离子只能被阴阳离子只能被阳离子交换剂吸附，阴离子只能被阴阳离子只能被阳离子交换剂吸附，阴离子只能被阴离子交换剂吸附；亲和力大易于吸附，难于洗脱，离子交换剂吸附；亲和力大易于吸附，难于洗脱，离子交换剂吸附；亲和力大易于吸附，难于洗脱，离子交换剂吸附；亲和力大易于吸附，难于洗脱，亲和力小难于吸附，轻易洗脱亲和力小难于吸附，轻易洗脱亲和力小难于吸附，轻易洗脱亲和力小难于吸附，轻易洗脱；强碱性阴离子交换剂（含季胺强碱性阴离子交换剂（含季胺强碱性阴离子交换剂（含季胺强碱性阴离子交换剂（含季胺-N N+(CH(CH3 3)3 3等）对各种等）对各种等）对各种等）对各种负离子亲和力次序为：负离子亲和力次序为：负离子亲和力次序为：负离子亲和力次序为：柠檬酸根柠檬酸根柠檬酸根柠檬酸根SOSO4 42-2-CrCr2 2OO4 4-II-NONO3 3-CrOCrO4 4-BrBr-SCNSCN-ClCl-HCOOHCOO-OHOH-FF-CHCH3 3COOCOO-第35页离子交换剂选择 选择离子交换剂时应考虑以下原因：选择离子交换剂时应考虑以下原因：选择离子交换剂时应考虑以下原因：选择离子交换剂时应考虑以下原因：(1)(1)样品离子带何种电荷；样品离子带何种电荷；样品离子带何种电荷；样品离子带何种电荷；(2)(2)离子浓度；离子浓度；离子浓度；离子浓度；(3)(3)被分离物质相对分子量大小；被分离物质相对分子量大小；被分离物质相对分子量大小；被分离物质相对分子量大小；(4)(4)离子与交换剂亲和力大小；离子与交换剂亲和力大小；离子与交换剂亲和力大小；离子与交换剂亲和力大小；(5)(5)离子交换剂及欲分离物质物理化学特征等。离子交换剂及欲分离物质物理化学特征等。离子交换剂及欲分离物质物理化学特征等。离子交换剂及欲分离物质物理化学特征等。第36页离子交换色谱操作离子交换色谱操作 n n离子交换剂预处理离子交换剂预处理离子交换剂预处理离子交换剂预处理n n装柱装柱装柱装柱 n n离子交换剂转型（用适当试剂处理，便离子交换剂所带可交换离子离子交换剂转型（用适当试剂处理，便离子交换剂所带可交换离子离子交换剂转型（用适当试剂处理，便离子交换剂所带可交换离子离子交换剂转型（用适当试剂处理，便离子交换剂所带可交换离子转变为我们所需要离子，如阳离子交换剂用转变为我们所需要离子，如阳离子交换剂用转变为我们所需要离子，如阳离子交换剂用转变为我们所需要离子，如阳离子交换剂用NaOHNaOH处理，可转为处理，可转为处理，可转为处理，可转为NaNa+型，用型，用型，用型，用HClHCl处理，则转为处理，则转为处理，则转为处理，则转为HH+型；阴离子交换剂用型；阴离子交换剂用型；阴离子交换剂用型；阴离子交换剂用NaOHNaOH处理转为处理转为处理转为处理转为OHOH-型，用型，用型，用型，用HClHCl处理转为处理转为处理转为处理转为ClCl-型等）型等）型等）型等）n n溶剂或缓冲液平衡溶剂或缓冲液平衡溶剂或缓冲液平衡溶剂或缓冲液平衡n n上柱（加样）上柱（加样）上柱（加样）上柱（加样）n n洗脱和搜集（洗脱液中应含有与交换剂亲和力较大离子，方便把吸洗脱和搜集（洗脱液中应含有与交换剂亲和力较大离子，方便把吸洗脱和搜集（洗脱液中应含有与交换剂亲和力较大离子，方便把吸洗脱和搜集（洗脱液中应含有与交换剂亲和力较大离子，方便把吸附在交换剂上样品离子交换下来，样品中含有各种离子时，与交换附在交换剂上样品离子交换下来，样品中含有各种离子时，与交换附在交换剂上样品离子交换下来，样品中含有各种离子时，与交换附在交换剂上样品离子交换下来，样品中含有各种离子时，与交换剂亲和力小首先被洗脱出来）剂亲和力小首先被洗脱出来）剂亲和力小首先被洗脱出来）剂亲和力小首先被洗脱出来）n n再生（再次转型）再生（再次转型）再生（再次转型）再生（再次转型）第37页5 5、凝胶色谱、凝胶色谱 凝胶色谱，又称为凝胶过滤、分子排阻色谱或凝胶色谱，又称为凝胶过滤、分子排阻色谱或凝胶色谱，又称为凝胶过滤、分子排阻色谱或凝胶色谱，又称为凝胶过滤、分子排阻色谱或分子筛色谱。它是指以各种凝胶为固定相，利分子筛色谱。它是指以各种凝胶为固定相，利分子筛色谱。它是指以各种凝胶为固定相，利分子筛色谱。它是指以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质相对分子量不一样而到用流动相中所含各物质相对分子量不一样而到用流动相中所含各物质相对分子量不一样而到用流动相中所含各物质相对分子量不一样而到达物质分离一个色谱技术。达物质分离一个色谱技术。达物质分离一个色谱技术。达物质分离一个色谱技术。第38页凝胶色谱基本原理凝胶色谱基本原理n n 当当当当含含含含有有有有各各各各种种种种组组组组分分分分样样样样品品品品流流流流经经经经凝凝凝凝胶胶胶胶色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱时时时时，各各各各组组组组分分分分在在在在柱柱柱柱内内内内同同同同时时时时进进进进行行行行着着着着两两两两种种种种不不不不一一一一样样样样运运运运动动动动，即即即即垂垂垂垂直直直直向向向向下下下下移移移移动动动动和和和和无无无无定向分子扩散运动（布朗运动）。定向分子扩散运动（布朗运动）。定向分子扩散运动（布朗运动）。定向分子扩散运动（布朗运动）。n n大分子物质因为分子直径大，不易进入凝胶颗粒微孔，大分子物质因为分子直径大，不易进入凝胶颗粒微孔，大分子物质因为分子直径大，不易进入凝胶颗粒微孔，大分子物质因为分子直径大，不易进入凝胶颗粒微孔，只能分布于凝胶颗粒间隙中，所以以较快速度流过凝只能分布于凝胶颗粒间隙中，所以以较快速度流过凝只能分布于凝胶颗粒间隙中，所以以较快速度流过凝只能分布于凝胶颗粒间隙中，所以以较快速度流过凝胶柱；而小分子物质能够进入凝胶颗粒微孔中，不停胶柱；而小分子物质能够进入凝胶颗粒微孔中，不停胶柱；而小分子物质能够进入凝胶颗粒微孔中，不停胶柱；而小分子物质能够进入凝胶颗粒微孔中，不停地进出于一个个颗粒微孔内外，这么就使小分子物质地进出于一个个颗粒微孔内外，这么就使小分子物质地进出于一个个颗粒微孔内外，这么就使小分子物质地进出于一个个颗粒微孔内外，这么就使小分子物质向下移动速度落后于大分子物质，从而使样品中各组向下移动速度落后于大分子物质，从而使样品中各组向下移动速度落后于大分子物质，从而使样品中各组向下移动速度落后于大分子物质，从而使样品中各组分按相对分子量从大到小次序先后流出众谱柱，到达分按相对分子量从大到小次序先后流出众谱柱，到达分按相对分子量从大到小次序先后流出众谱柱，到达分按相对分子量从大到小次序先后流出众谱柱，到达分离目标。分离目标。分离目标。分离目标。第39页 Ve Ve：洗脱体积，表示某一组分物质从加进色谱柱到最高峰出现时，所：洗脱体积，表示某一组分物质从加进色谱柱到最高峰出现时，所：洗脱体积，表示某一组分物质从加进色谱柱到最高峰出现时，所：洗脱体积，表示某一组分物质从加进色谱柱到最高峰出现时，所需洗脱液体积；需洗脱液体积；需洗脱液体积；需洗脱液体积；VoVo：外体积，即为色谱柱内凝胶颗粒之间空隙体积；：外体积，即为色谱柱内凝胶颗粒之间空隙体积；：外体积，即为色谱柱内凝胶颗粒之间空隙体积；：外体积，即为色谱柱内凝胶颗粒之间空隙体积；ViVi：内体积，即为色谱柱内凝胶颗粒内部微孔体积。：内体积，即为色谱柱内凝胶颗粒内部微孔体积。：内体积，即为色谱柱内凝胶颗粒内部微孔体积。：内体积，即为色谱柱内凝胶颗粒内部微孔体积。当某组分当某组分当某组分当某组分KaKa=0=0时（即时（即时（即时（即VeVe=Vo Vo），说明该组分分子完全不进入凝胶颗粒），说明该组分分子完全不进入凝胶颗粒），说明该组分分子完全不进入凝胶颗粒），说明该组分分子完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出；若某组分微孔，洗脱时最先流出；若某组分微孔，洗脱时最先流出；若某组分微孔，洗脱时最先流出；若某组分Ka=Ka=1 1（即（即（即（即VeVe=Vo+Vi Vo+Vi）时，说明该）时，说明该）时，说明该）时，说明该组分分子可自由地扩散进入凝胶颗粒内部微孔中，洗脱时，最终流出；组分分子可自由地扩散进入凝胶颗粒内部微孔中，洗脱时，最终流出；组分分子可自由地扩散进入凝胶颗粒内部微孔中，洗脱时，最终流出；组分分子可自由地扩散进入凝胶颗粒内部微孔中，洗脱时，最终流出；若某组分若某组分若某组分若某组分KaKa在在在在0101之间，说明该组分分子介乎大分子和小分子之间，之间，说明该组分分子介乎大分子和小分子之间，之间，说明该组分分子介乎大分子和小分子之间，之间，说明该组分分子介乎大分子和小分子之间，洗脱时洗脱时洗脱时洗脱时KaKa值小先流出，值小先流出，值小先流出，值小先流出，KaKa值大后流出。值大后流出。值大后流出。值大后流出。分配系数分配系数Ka第40页6 6、亲和色谱、亲和色谱 n n亲和色谱是利用生物分子间所含有专一而又可逆亲和力亲和色谱是利用生物分子间所含有专一而又可逆亲和力亲和色谱是利用生物分子间所含有专一而又可逆亲和力亲和色谱是利用生物分子间所含有专一而又可逆亲和力而使生物分子分离纯化一个色谱技术。而使生物分子分离纯化一个色谱技术。而使生物分子分离纯化一个色谱技术。而使生物分子分离纯化一个色谱技术。n n含有专一而又可逆亲和力生物分子是成对互配，主要有含有专一而又可逆亲和力生物分子是成对互配，主要有含有专一而又可逆亲和力生物分子是成对互配，主要有含有专一而又可逆亲和力生物分子是成对互配，主要有酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶、抗原与抗体、酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶、抗原与抗体、酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶、抗原与抗体、酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶、抗原与抗体、DNADNA与与与与RNARNA、激素与其受体等。、激素与其受体等。、激素与其受体等。、激素与其受体等。n n在成对互配生物分子中，可把任何一方作为固定相，而在成对互配生物分子中，可把任何一方作为固定相，而在成对互配生物分子中，可把任何一方作为固定相，而在成对互配生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液（流动相）中另一方分子进行亲和色谱，到对样品溶液（流动相）中另一方分子进行亲和色谱，到对样品溶液（流动相）中另一方分子进行亲和色谱，到对样品溶液（流动相）中另一方分子进行亲和色谱，到达分离纯化目标。达分离纯化目标。达分离纯化目标。达分离纯化目标。n n酶与其辅酶是成对互配，既可把辅酶作为固定相，使样酶与其辅酶是成对互配，既可把辅酶作为固定相，使样酶与其辅酶是成对互配，既可把辅酶作为固定相，使样酶与其辅酶是成对互配，既可把辅酶作为固定相，使样品中酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中辅酶品中酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中辅酶品中酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中辅酶品中酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中辅酶分离纯化分离纯化分离纯化分离纯化 第41页五、超临界流体萃取技术超临界流体萃取技术原理：原理：利用超临界流体利用超临界流体(supercritical fluid,SCF)，即其温度和压力略超出或靠近临界温，即其温度和压力略超出或靠近临界温度度(Tc)和临界压力和临界压力(pc)，介于气体和液体之，介于气体和液体之间流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出间流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性成份，以到达分离和提某种高沸点或热敏性成份，以到达分离和提纯目标。纯目标。第42页纯物质压温图纯物质压温图纯物质压温图纯物质压温图 第43页超临界流体萃取与液体溶剂萃取比较超临界流体萃取与液体溶剂萃取比较 超临界流体萃取法超临界流体萃取法超临界流体萃取法超临界流体萃取法液体溶剂萃取法液体溶剂萃取法液体溶剂萃