脑科学研究的方法市公开课一等奖百校联赛获奖课件.pptx

多学科综合多学科综合第一章脑科学研究方法和伎俩神经科学神经解剖学神经生理学神经生物化学心理学.第1页多层次研究认知神经科学计算神经科学临床神经科学系统和行为神经科学发生神经科学细胞神经科学分子神经科学神经科学第2页研究水平研究水平l整体行为水平：整体行为水平：行为学，躯体感觉，视听觉，行为学，躯体感觉，视听觉，痛觉等痛觉等l细胞水平：细胞水平：神经细胞培养、生物电活动检测、神经细胞培养、生物电活动检测、通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测l分子水平试验：分子水平试验：离子通道、受体、酶、遗传离子通道、受体、酶、遗传物质等物质等第3页一、形态学方法一、形态学方法二、生理学方法二、生理学方法三、电生理学方法三、电生理学方法四、生物化学方法四、生物化学方法五、分子生物学方法五、分子生物学方法六、脑成像（六、脑成像（Brainimaging）技术）技术第4页一、形态学方法常规染色和特殊染色常规染色和特殊染色束（通）路追踪法束（通）路追踪法荧光组织化学法荧光组织化学法原位杂交法原位杂交法受体定位法受体定位法神经系功效活动形态定位法神经系功效活动形态定位法第5页1.惯用普通染色方法惯用普通染色方法TTC染色染色HE锇酸染色锇酸染色氯化金浸染氯化金浸染Cajal银浸染色银浸染色尼氏染色尼氏染色第6页HE（苏木素伊红）（苏木素伊红）第7页锇酸染色是神经科学研究一个惯用而普遍方法，它原来是用来固定脂质，因为髓鞘主要成份是脂质，所以用于有髓神经纤维染色锇酸染色锇酸染色第8页氯化金浸染氯化金浸染运动终板运动终板Ach荧光染色荧光染色氯化金浸染氯化金浸染第9页Cajal银浸染色银浸染色第10页尼氏染色尼氏染色l各种方法，HE、甲苯胺蓝，焦油紫，硫堇，天青，派洛宁，中性红以及棓花青等碱性苯胺染料均能够使尼氏体着色 第11页2、束（通）路追踪法：研究神经元之间联络第12页束路追踪束路追踪l原理：轴浆运输原理：轴浆运输l示踪物质：示踪物质：HRP，荧光染料，荧光染料，各种标识物标识葡萄糖，放射性各种标识物标识葡萄糖，放射性核素标识氨基酸等。核素标识氨基酸等。l观察：观察：依据示踪物质不一样，采依据示踪物质不一样，采取组织显色、荧光显微镜或放射取组织显色、荧光显微镜或放射自显影等方法自显影等方法。第13页l轴浆运输法轴浆运输法利用神经元轴浆运输现象追踪法利用神经元轴浆运输现象追踪法.追踪剂：辣根过氧化物酶追踪剂：辣根过氧化物酶(horseradishperoxoidase,HRP)、荧光染料包含核黄、荧光染料包含核黄(nuclearyellow)、固蓝、固蓝(fastblue)及荧光金及荧光金(fluorogold)、植物凝集素如麦芽、植物凝集素如麦芽凝集素凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)和菜豆凝集素和菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin)、细菌毒素如霍乱毒、细菌毒素如霍乱毒素、病毒如活神经病毒素、病毒如活神经病毒(胞疹病毒和弹状病毒）胞疹病毒和弹状病毒）第14页l变变性性法法：利利用用神神经经元元包包体体受受损损或或神神经经轴轴突突离离断断后后远远侧侧轴轴突突变变性性，或或轴轴突突切切断断后后细细胞胞反反应应，来研究纤维联络。来研究纤维联络。*物物理理性性方方法法：刀刀切切割割、电电凝凝、电电离离破破坏坏、超声破坏等。超声破坏等。*化学性破坏：兴奋性氨基酸（海人酸和鹅化学性破坏：兴奋性氨基酸（海人酸和鹅高蕈氨酸）、单胺类神经毒（羟多巴胺、高蕈氨酸）、单胺类神经毒（羟多巴胺、羟多巴、双羟色胺）羟多巴、双羟色胺）第15页l神经元质膜荧光染料法：神经元质膜荧光染料法：用羰花青（用羰花青（carbocynine）荧光染料，能）荧光染料，能够染出神经细胞质膜，并能够在活体或固定标够染出神经细胞质膜，并能够在活体或固定标本上追踪纤维联络。本上追踪纤维联络。第16页最新研究进展：最新研究进展：华人学者绘制小鼠大脑神经网络图华人学者绘制小鼠大脑神经网络图l不一样大脑区域必须相互沟通才能控制复杂思想和行为，但当前对于这些区域组织成为辽阔神经元网络机制却相对知之甚少。2月27日细胞（Cell）杂志上一项新研究中，南加州大学董宏伟等研究人员采取神经元示踪技术绘制出了一张小鼠全脑图谱，揭示了大脑皮质中数百条神经元通路。在显微镜下将可见荧光分子注入到整个小鼠大脑皮质不一样区域，这些小分子沿着“细胞高速公路”运输，标识了大约600个神经元通路。研究人员采取高分辨率显微镜扫描了这些大脑区域，构建出了皮质连接图像数据库。第17页l当研究人员分析这些连接时，他们发觉大脑皮质是一个高度组织化网络，由八个子网络组成，它们协调活动反应动物情感和感觉。而且，子网络之间以一个非常特殊方式来共享这一信息。“这些研究发觉挑战了流行假说：大脑皮质是一个单一网络，在这一网络中全部一切都密集连接在一起。”l接下来，研究人员可未来自这一主要哺乳动物模型系统解剖数据与大量现有分子遗传数据合并来判别神经细胞基本类型。“确定全脑结构组织将是朝着揭示脑功效以及在神经系统疾病中功效障碍结构基础迈出基本且令人兴奋一步，”董宏伟说。第18页我们真会永远不老吗？我们真会永远不老吗？从从“科学科学狂人狂人”抗衰老研究说起抗衰老研究说起lJohnCraigVenter身上从不缺乏话题。从单枪匹马与人类基因组计划展开竞争、时代杂志将他与人类基因组计划代表FrancisCollins同时选为封面人物，到宣告制造出首个能够自我复制活细胞“Synthia”，轰动了整个学术界，Venter每一个举动，在学术界都会引发波澜。前阵子，他又宣称将组建新企业HLI，组建史上最大基因组数据库，结合基因组学、生物信息学及干细胞疗法，致力于抗衰老研究，并延长人类寿命。第19页l【为何我们会追求不老和长寿为何我们会追求不老和长寿】l对于不老和长寿探索，恐怕是除了“我们是谁”“我们从哪儿来”之外，人们思索第三个问题了“我们能否一直存在下去”。l【对衰老和长寿基因研究对衰老和长寿基因研究】l有一个规律，很多问题，假如解释不了，就说它是因为基因决定，多半错不到哪里去。也所以，生物学家、医学家们纷纷开始将遗传学和分子生物学结合，从基因角度开始对长寿和衰老问题探索。第20页l当前基因方面研究主要有两个方向，长寿基因和衰老基因。这里说并不是单一基因，而是与长寿和衰老相关各种基因，它们之间相互作用带来了不老和长寿结果。衰老表现为染色体端粒长度改变、DNA损伤、甲基化等，衰老终点就是死亡，这些原因也是影响长寿原因。l有科学家认为，端粒（细胞核两端特殊DNA片段）长度决定生物寿命，端粒缩短会造成细胞分裂停顿和死亡降临。发觉端粒三位科学家取得了诺贝尔生理学或医学奖。l当前“长寿基因”和“衰老基因”还不能完全确定，但有学者认为，消除自由基一些酶类基因、与细胞生长调控相关一些基因与长寿和衰老相关。对于长寿和衰老基因，科学上还需要继续发觉更多相关基因，理清那些造成衰老、影响长寿基因群及其之间联络，才能在了解基因组基础上，处理衰老、长寿问题。第21页l【其它长寿和抗衰老方法其它长寿和抗衰老方法】l除了基因研究外，还有抗衰老制剂研究。褪黑素与微量元素是被认为有抗衰老作用物质。褪黑素自由基去除能力在众多自由基去除剂中表现尤其突出，而微量元素摄入不协调，将造成衰老。l还有一个说法，节食能够延长寿命。这背后生物学原理是：生长激素和胰岛素信号路径在起作用。科学家经过对猴子、酵母菌、果蝇等动物研究中验证了降低卡路里摄入能够延长寿命理论。l另一些科学家提出引发机体衰老和疾病是自由基增多，这也是现实生活中那些宣称“去除自由基，恢复年轻态”保健品所依赖理论基础。这些保健品疗效有限，请不要轻易尝试。l除了遗传原因之外，人生活环境、人心理情况等多方面原因都会影响到寿命。保持愉悦心情，健康生活方式，良好饮食习惯，这么即使躯体不可防止老化，但还是有年轻心态，总好过长寿但不高兴，年轻外表下，却住着一个老灵魂。第22页l对于长寿基因及衰老基因发掘，也有不赞同声音。他们认为这违反了伦理道德，假使我们不老不死，那么进化要领“生存和繁殖”，也会越来越少被考虑，我们将剥夺后代生存机会。l技术进步带来潜在社会问题，还有待深入去处理。就当前研究情况来看，长寿不意味着不会永生，科学帮助下，人们有机会将有限生命拉长，将有限生命过得更有质量，实现不老不病愿望。l此时又想到了Venter先生，据悉，Venter曾作为美国海军医疗队医院参加越战，战场残酷使他认识到生命和时间宝贵，他认为人生每一分钟都应该有所创新。撇开进化需要不谈，试想有一天，我们不再见变老，没有疾病，寿命很长，我们是否还会像出生即知将死时候那样，珍惜生命中每一天，而努力奋斗呢。第23页3、荧光组织化学法用特异性抗体显示神经组织化学成份方法。用特异性抗体显示神经组织化学成份方法。第24页基本过程有：固定、制片、反应等三步。基本过程有：固定、制片、反应等三步。l免疫组织化学反应：有直接法和免疫组织化学反应：有直接法和间接法间接法 l 双重免疫组织化学染色：主要是双重免疫组织化学染色：主要是为了研究两种物质在同一细胞或突起内为了研究两种物质在同一细胞或突起内共存现象，或含两种不一样化学物质相共存现象，或含两种不一样化学物质相互关系。互关系。第25页免疫组化免疫组化l依据二抗标识不一样（荧光素、酶、铁蛋白、荧光素、酶、铁蛋白、胶体金或银标识），胶体金或银标识），免疫组化免疫组化包含免疫荧光、免疫酶组织化学、免疫金银及铁标识技术第26页l核酸分子杂交技术，检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质基因表示。l基本原理是依据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配正确特点，应用已知碱基序列并含有标识物RNA或DNA片段即核酸探针（核酸探针（probeprobe），与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，经过标识物显示，在光镜或电镜下观察目标mRNA或DNA存在与定位。4、原位杂交法第27页l此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：利用大肝杆菌重组带有目标基因质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA)；应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录取得反义RNA探针(cDNA)；依照待测核酸核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。lcRNA和cDNA惯用标识物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。第28页l组织学应用原位杂交术主要是染色体原位杂交染色体原位杂交和细胞细胞原位杂交原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上定位与表示；后者是研究细胞某种蛋白质基因转录物mRNA在胞质内定位与表示。l核酸分子杂交术有很高敏感性和特异性，它是免疫细胞化学基础上，深入从分子水平探讨细胞功效表示及其调整机制，已成为当前神经生物学研究主要伎俩。第29页5、受体定位法：研究受体在神经系统内定位配配体体法法：主主要要在在组组织织切切片片上上进进行行，利利用用标标识识配配体和受体结合以示踪其部位体和受体结合以示踪其部位免疫组织化学法：用针对受体抗体免疫组织化学法：用针对受体抗体第30页6、神经系功效活动形态定位法l脱氧葡萄糖法：脱氧葡萄糖法：原理是：神经元活动时其能量代谢增加，而其能量原理是：神经元活动时其能量代谢增加，而其能量代谢主要依赖葡萄糖。在脑内存在脱氧葡萄糖代谢主要依赖葡萄糖。在脑内存在脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2DG)时，神经元可不加区分地将时，神经元可不加区分地将2DG与葡萄糖一起摄入细胞内，二者都是己糖激酶底与葡萄糖一起摄入细胞内，二者都是己糖激酶底物。但物。但2DG在其被磷酸化成在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被磷后，不能被磷酸己糖异构酶深入转化为果糖酸己糖异构酶深入转化为果糖-6-PO4，不能继续在糖，不能继续在糖酵解循环中代谢。如在酵解循环中代谢。如在2DG上标以同位素。神经元内上标以同位素。神经元内同位素堆积程度反应了神经元活动程度。同位素堆积程度反应了神经元活动程度。第31页lc-fos(Fos)法：法：c-fos是一个原癌基因，属于即刻早期基因类是一个原癌基因，属于即刻早期基因类(immediate-earlygene).很多刺激条件可经过第二信很多刺激条件可经过第二信使引发神经元使引发神经元c-fos表示增加，形成表示增加，形成fosmRNA。由。由fosmRNA翻译成翻译成Fos蛋白，马上转位至细胞核内，蛋白，马上转位至细胞核内，与另一即刻早基因与另一即刻早基因c-jun所产生蛋白所产生蛋白Jun组成二聚体组成二聚体（第三信使），调整其靶基因表示，引发一系列细胞（第三信使），调整其靶基因表示，引发一系列细胞反应。反应。第32页l细胞色素氧化酶法：细胞色素氧化酶法：神经元线粒体内细胞色素氧化酶是提供神神经元线粒体内细胞色素氧化酶是提供神经元能量主要酶，细胞色素氧化酶水平与神经经元能量主要酶，细胞色素氧化酶水平与神经元能量需求亲密相关，普通反应慢性刺激结果。元能量需求亲密相关，普通反应慢性刺激结果。第33页二、生理学方法l损毁法损毁法l刺激法刺激法l周身给药法周身给药法l脑室注射法脑室注射法l脑组织培养脑组织培养l亚细胞分析亚细胞分析l神经递质释放量测定神经递质释放量测定l神经递质功效测定神经递质功效测定l行为学方法行为学方法l最惯用有两种：神经行为学、电生理学最惯用有两种：神经行为学、电生理学第34页1、神经递质释放量测定（在体in vivo和离体in vitro)l推挽灌流法：推挽灌流法：在体研究中枢核团递质释放有用方法。经在体研究中枢核团递质释放有用方法。经过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，从流出液中分析神经递质改变。从流出液中分析神经递质改变。第35页第36页l脑透析术脑透析术(braindialysis)：在特定脑区内，植入透析探头，用生理溶在特定脑区内，植入透析探头，用生理溶液灌流时，细胞外液中神经递质可顺浓度递度液灌流时，细胞外液中神经递质可顺浓度递度从透析管扩散至灌流液中，搜集和测定灌流液从透析管扩散至灌流液中，搜集和测定灌流液中神经递质含量，就能监测该递质改变过程。中神经递质含量，就能监测该递质改变过程。脑透析术装置包含探头、导管、微量灌流泵、脑透析术装置包含探头、导管、微量灌流泵、样品搜集器和定量分析仪。样品搜集器和定量分析仪。第37页第38页第39页抗体微探针法：是在玻璃微电极上涂上一层神经肽抗体微探针法：是在玻璃微电极上涂上一层神经肽抗体，用于在中枢神经系统内定位神经肽释放抗体，用于在中枢神经系统内定位神经肽释放。硼硅玻璃与硼硅玻璃与r氨丙基三乙氧硅烷（氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri-etriethoxysilane）反应后在玻璃表面形成一层带有游离氨基硅氧烷反应后在玻璃表面形成一层带有游离氨基硅氧烷(siloxane)多聚体微粒。该多聚体微粒。该玻璃再用戊二醛玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)处理，使戊二醛与蛋白质处理，使戊二醛与蛋白质A以共价键方式以共价键方式偶联，蛋白质偶联，蛋白质A再与神经肽抗体结合，制成抗体微探针再与神经肽抗体结合，制成抗体微探针第40页脑片灌流法突触体灌流法第41页2、神经递质功效测定l微微电电泳泳：能能将将微微量量神神经经递递质质导导入入神神经经元元附附近近，观察其作用。观察其作用。l抗抗体体微微量量注注射射：特特异异性性抗抗体体注注射射在在一一些些部部位位，可可中中和和神神经经末末梢梢释释放放出出而而进进入入突突触触间间隙隙神神经经肽肽，预预防防其其与与受受体体结结合合。所所以以，抗抗体体微微量量注注射射所所引引发发功功效效改改变变可可解解释释为为消消除除该该神神经经肽肽生生理理效效应应结结果。果。l生生物物检检测测（Bioassay）:经经典典方方法法.如如用用水水蛭蛭背最长肌测定背最长肌测定ACh作用，灵敏度达作用，灵敏度达10-10g.第42页3、行为学方法l经典条件反射：代表了刺激与强化关系。经典条件反射：代表了刺激与强化关系。l操操作作式式条条件件反反射射：是是经经过过动动物物本本身身某某个个特特定定操操作动作而取得食物或回避有害刺激反应活动。作动作而取得食物或回避有害刺激反应活动。第43页lBehavioralneuroscienceisthestudyoftheneuralmechanismsmediatingnormalandabnormalbehaviors.l自主活动自主活动l动物焦虑检测：实施焦虑原因，如饮食或饮水剥夺，检测反应，能够用于药品筛选。l性和生殖行为：进化，神经内分泌作用机制l学习记忆学习记忆l摄食行为l惊慌反射l社会行为 .第44页自主活动箱试验自主活动箱试验l动物自主活动标志着动物中枢神经系统兴奋状态中枢神经系统兴奋状态，当中枢神经系统兴奋时，自主活动加强，抑制时则自主活动降低。观察动物自主活动是评价中枢神经兴奋状态一项主要指标。l各种作用于中枢神经系统药品都可影响动物自主活动，因而自主活动统计是研究中枢神经系统药品主要方法，而且在新药研究中，观察药品对动物自主活动影响也是评价药品是否影响中枢神经系统主要方法第45页自主活动箱试验自主活动箱试验主要技术指标：运动次数运动次数第46页洞板试验洞板试验检测小鼠自动活动，可用于新药，普通药理，神经系统研究和中枢兴奋性，抑制性研究。主要技术指标：小鼠探小鼠探洞次数洞次数。第47页学习记忆行为学检测学习记忆行为学检测学习记忆功效包含空间学习记忆功效和非空间学学习记忆功效包含空间学习记忆功效和非空间学习记忆功效。伴随对大脑学习记忆机制研究不停习记忆功效。伴随对大脑学习记忆机制研究不停深入以及寻找有效防治认知障碍类疾病方法需要，深入以及寻找有效防治认知障碍类疾病方法需要，使得动物行为学试验成为研究脑高级功效及其它使得动物行为学试验成为研究脑高级功效及其它神经科学不可缺乏主要伎俩，客观准确地评价试神经科学不可缺乏主要伎俩，客观准确地评价试验动物学习记忆水平已成为神经生物学和神经药验动物学习记忆水平已成为神经生物学和神经药理学中非常主要研究内容。理学中非常主要研究内容。第48页学习记忆功效检测惯用试验程序学习记忆功效检测惯用试验程序空间学习记忆任务空间学习记忆任务非空间学习记忆任务非空间学习记忆任务Morris水迷宫水迷宫T迷宫迷宫6或或8臂放射状水迷宫臂放射状水迷宫Lashley迷宫迷宫放射状迷宫（放射状迷宫（8臂、臂、12臂）臂）H-W迷宫迷宫Y迷宫迷宫新奇物体认知新奇物体认知环形平台环形平台嗅觉区分T迷宫迷宫穿梭箱试验跳台试验第49页Morris迷宫迷宫1981年，英国心理学家Morris首次设计应用了这种水迷宫及其程序。目标是帮助大脑学习记忆机制研究。起初试验动物主要为大鼠，今后该迷宫系统成为评定啮齿类动物空间学习和记忆能力经典程序，广泛利用于神经生物学、药学等领域基础和应用研究中。第50页Morris水迷宫水迷宫应用:判断动物空间学习记忆能力组成:观察指标观察指标:潜伏期，潜伏期，路径，不一样象限路径，不一样象限停留时间和长度，停留时间和长度，搜索策略等搜索策略等 第51页Morris水迷宫水迷宫第52页第53页Morris水迷宫水迷宫l原理原理水是啮齿类动物非常厌恶刺激或环境。鼠在水池中就水是啮齿类动物非常厌恶刺激或环境。鼠在水池中就会急于寻找逃路。它们习性为在水池四面寻找出口逃会急于寻找逃路。它们习性为在水池四面寻找出口逃避，但深而光滑垂直池壁妨碍了这种企图。试验中设避，但深而光滑垂直池壁妨碍了这种企图。试验中设置水下平台（用于小鼠常为水面下置水下平台（用于小鼠常为水面下1cm）可提供鼠栖）可提供鼠栖身场所。但在巨大水面上，强迫游泳动物不能看见平身场所。但在巨大水面上，强迫游泳动物不能看见平台。它们若要快速找到平台而防止淹没就必须利用环台。它们若要快速找到平台而防止淹没就必须利用环境中线索进行定位。从而检测了鼠记住环境中线索及境中线索进行定位。从而检测了鼠记住环境中线索及其与平台位置关系而对平台进行定位能力（学习记忆其与平台位置关系而对平台进行定位能力（学习记忆能力）。能力）。第54页Morris水迷宫优点水迷宫优点l因为对年纪相关性空间记忆损害有可靠敏感性，因为对年纪相关性空间记忆损害有可靠敏感性，Morris水迷宫是判断水迷宫是判断老年小鼠空间学习记忆能力尤其有用工具。老年小鼠空间学习记忆能力尤其有用工具。l驱动动物逃避是水刺激，而不需要食物和水剥夺。所以，防止了剥夺驱动动物逃避是水刺激，而不需要食物和水剥夺。所以，防止了剥夺食物和水后给试验动物带来新陈代谢方面问题。食物和水后给试验动物带来新陈代谢方面问题。l动物无须接收电休克，这在那些食欲促进任务（动物无须接收电休克，这在那些食欲促进任务（appetitivetasks）如辐射状迷宫和如辐射状迷宫和T迷宫中是常规要求。迷宫中是常规要求。l能提供较多试验参数，系统全方面地考查试验动物空间认知加工过程，能提供较多试验参数，系统全方面地考查试验动物空间认知加工过程，客观地反应其认知水平。客观地反应其认知水平。l将试验动物学习记忆障碍和感觉、运动缺点等分离开来，降低它们对将试验动物学习记忆障碍和感觉、运动缺点等分离开来，降低它们对学习记忆过程检测干扰。学习记忆过程检测干扰。l既能够检测空间参考记忆又能够检测空间工作记忆。在用固定平台测既能够检测空间参考记忆又能够检测空间工作记忆。在用固定平台测试小鼠空间参考记忆后再将平台位置改为不固定，就可检测它们工作试小鼠空间参考记忆后再将平台位置改为不固定，就可检测它们工作记忆能力。显然，寻找不固定平台认知过程要复杂一些，需要动物对记忆能力。显然，寻找不固定平台认知过程要复杂一些，需要动物对时间和空间上分离信息加以整合和判断。时间和空间上分离信息加以整合和判断。l操作简便，数据误差较小。操作简便，数据误差较小。第55页Morris水迷宫不足之处水迷宫不足之处l因为需要监视系统及分析软件，只有少数装备很好试验室能够实施。因为需要监视系统及分析软件，只有少数装备很好试验室能够实施。l试验程序设计需要考虑原因较多，同时需要试验者具备一定神经生理学、认试验程序设计需要考虑原因较多，同时需要试验者具备一定神经生理学、认知生理学和数理统计方面知识，给试验开展和结果解释带来困难，同时也限知生理学和数理统计方面知识，给试验开展和结果解释带来困难，同时也限制了该迷宫深入广泛应用。制了该迷宫深入广泛应用。l因为体力消耗太大，体温也丧失过多，年老体弱鼠完成任务较困难。因为体力消耗太大，体温也丧失过多，年老体弱鼠完成任务较困难。l并非全部鼠株都适合于并非全部鼠株都适合于Morris迷宫测试，如迷宫测试，如BALB/c不能学会该任务（成绩并不能学会该任务（成绩并不随天数增加而进步），不随天数增加而进步），129/SvJ学习成绩也偏差。学习成绩也偏差。l个体间成绩差异巨大。个体间成绩差异巨大。l一些株，如一些株，如129/SvJ株小鼠因为有年纪相关性视路病变株小鼠因为有年纪相关性视路病变(visualpathology)，在衰老时完成以视觉为基础学习记忆任务时就会出现困难。在在衰老时完成以视觉为基础学习记忆任务时就会出现困难。在C57BL/6株，株，因为严重秃头症（因为严重秃头症（alopecia）存在，可能使一些小鼠产生抑郁，加上溃疡性）存在，可能使一些小鼠产生抑郁，加上溃疡性皮炎，最终可能影响小鼠游泳能力而影响试验成绩。皮炎，最终可能影响小鼠游泳能力而影响试验成绩。l对轻微学习记忆能力减退，该迷宫程序可能不敏感。对轻微学习记忆能力减退，该迷宫程序可能不敏感。l所占试验场地过大。所占试验场地过大。第56页LashleyIII水迷宫水迷宫第57页LashleyIII水迷宫水迷宫是一个相对复杂迷宫。它含有动物必须学会防止是一个相对复杂迷宫。它含有动物必须学会防止盲端（盲端（culs-de-sac）和动物必须做出正确左或右拐）和动物必须做出正确左或右拐弯弯T选择。试验进行选择。试验进行5天，天天进行天，天天进行2次测试（上下午次测试（上下午各各1次）。天天次）。天天2次测试被平均。指标包含：学习指次测试被平均。指标包含：学习指数（正确进入数数（正确进入数/进入总数）、游向目标时盲端进入进入总数）、游向目标时盲端进入数及数及T选择错误数、向后进入总数、逃生所用时间等。选择错误数、向后进入总数、逃生所用时间等。第58页八臂放射状旱迷宫八臂放射状旱迷宫八臂放射状旱迷宫，是八臂放射状旱迷宫，是OltenOlten和和SamnelsonSamnelson在在19761976年设计，做为一个年设计，做为一个评定大鼠空间学习记忆方法。它能评定大鼠空间学习记忆方法。它能够同时评定试验动物工作记忆和参够同时评定试验动物工作记忆和参考记忆。考记忆。原理原理 利用利用食物食物作为激励办法而抵达目标作为激励办法而抵达目标地，饥饿动物需要实施尤其搜索次地，饥饿动物需要实施尤其搜索次序或利用最短时间或最小错误来寻序或利用最短时间或最小错误来寻求奖赏。求奖赏。第59页八臂放射状旱迷宫八臂放射状旱迷宫l装装置置八臂放射状旱迷宫是由从中央平台伸出八臂放射状旱迷宫是由从中央平台伸出8个相等臂呈放个相等臂呈放射状排列组成，射状排列组成，8臂中有臂中有4臂臂末端放有食物末端放有食物，在同一天整个，在同一天整个试验过程中哪些臂中含有食物保持固定不变，但天天之间试验过程中哪些臂中含有食物保持固定不变，但天天之间都有改变。迷宫周围有若干空间线索。试验前大鼠需都有改变。迷宫周围有若干空间线索。试验前大鼠需被剥被剥夺食物和水夺食物和水，试验开始时，大鼠被放在中央平台处后去寻，试验开始时，大鼠被放在中央平台处后去寻找食物。在试验中大鼠需记住哪些臂已被探索过，食物已找食物。在试验中大鼠需记住哪些臂已被探索过，食物已被摄取，以防止再次进入，从而在最短时间内取得最大量被摄取，以防止再次进入，从而在最短时间内取得最大量食物。同时，在天天试验结束后，大鼠还必须放弃当日记食物。同时，在天天试验结束后，大鼠还必须放弃当日记忆信息，以准备适应第二天试验。忆信息，以准备适应第二天试验。第60页八臂放射状旱迷宫八臂放射状旱迷宫l应用应用评定动物工作记忆工作记忆和参考记忆参考记忆工作记忆工作记忆是指利用一个仅仅在短时间内保留信息，或称为试验特定信息（trial-specificinformation）而取得记忆，它是对试验中可变事物记忆能力。参考记忆参考记忆是对连续存在信息，或称为任务特定信息（task-specificinformation）记忆，它是对试验中不变事物记忆能力。第61页八臂放射状旱迷宫八臂放射状旱迷宫l观察指标观察指标时间测定和错误积分l存在问题存在问题l优点：同时评定试验动物工作记忆和参考记忆l不足：l气味影响。包含食物气味、其它动物气味以及动物本身气味。l试验动物被限制食物和水，由此会带来影响。l而且不一样食物奖赏也可产生显著影响；l另外，动物种属不一样使其在食物需求上也可造成不一样结论。第62页穿梭箱试验穿梭箱试验l试验装置试验箱大小为50cm16cm18cm。箱底部格栅为能够通电不锈钢棒，箱底中央部有一高1.2cm挡板，将箱底部分隔成左右两列。试验箱顶部有光源，蜂鸣音控制器。l训练时，将大白鼠放入箱内任何一侧，20s后开始展现灯光和（或）蜂鸣音，连续15s，后10s内同时给以电刺激(100V，O.2mA，50Hz，AC)。最初，动物只对电击有反应，即逃至对侧以回避电击。20s后再次出现条件刺激并继之在动物所在侧施以电刺激，迫使动物跳至另一侧如此来往穿梭。当蜂鸣音或灯光信号展现时，大白鼠马上逃至对侧安全区以躲避电击，即认为出现了条件反应(或称主动回避反应)。每闲天训练一回，每回100次。约训练45回后动物主动回避反应率可达8090。l此法可同时观察被动和主动回避性反应.另外从动物反应次数也能够了解动物系处于兴奋或抑制状态。第63页穿梭箱试验穿梭箱试验l自动统计系统能够输出以下内容：(1)动物序号；(2)遭受刺激次数；(3)遭受刺激时间；(4)主动回避反应时间。l以上各值均为在设定穿梭次数内反应总和。遭受电激次数是被动回避次数，该值与设定循环次数之差即为主动回避次数；刺激时间是指动物在被动回避过程被动回避过程受到电刺激时间和，该值愈小，说明动物被动反应愈灵敏，主动回避时间主动回避时间是指动物在接收条件刺激时间长短，该值越短，说明动物主动回避反应越快速第64页跳台试验跳台试验l 跳台试验属一次性刺激回避反应试验（ONE TRAIL AVOIDANCE TEST）。l 装置：试验装置为一长方形反射箱，大小为10cm10cm60cm，用黑色塑板分割成5间。地面铺以栅栏，间距0.5cm，能够通电，每间角落置一高和直径均为4.5cm平台。第65页跳台试验跳台试验l原理原理在一个开阔空间，动物大部分时间都在边缘及角落里活动。在一个方形中心设置一个高平台，当把动物放在平台时，它几乎马上跳下平台并向四面探索靠近边缘l指标指标潜伏期：统计动物从上平台到第一次下平台时间l操作步骤操作步骤一个经典例子包含三个过程：熟悉过程熟悉过程学习过程学习过程记忆检测记忆检测l熟悉过程：将动物放在平台上，开始计时，至动物跳下。此时间段为潜伏期。动物探索10s以后，放回笼中l学习过程：动物一旦从平台上跳下后，马上受到电刺激，然后放回笼中l记忆检测：学习试验24h后，将试验动物重新放回平台上，统计跳下平台潜伏期。动物跳下平台或连续停留在平台上标志着验结束（终止时间为60s）。l将动物放入反应箱内适应环境3min，然后马上通以36V交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或屡次跳至栅栏上，受到电击后又快速跳回平台。如此训练5min，并统计每鼠受到电击次数或叫错误次数（numberoferrors），以此作为学习成绩。24h后重做测试，此即叫记忆保持测试。统计受电击死亡动物数、第一次跳下平台潜伏期和3min内错误次数。第66页三、电生理学方法电生理学方法包含胞外统计、胞内统计、脑内电电生理学方法包含胞外统计、胞内统计、脑内电刺激、电压钳、膜片钳、脑电图等技术。刺激、电压钳、膜片钳、脑电图等技术。1、电生理惯用仪器、电生理惯用仪器l阴极射线示波器阴极射线示波器:高灵敏度，扫描速度慢高灵敏度，扫描速度慢l生物电放大器生物电放大器l电子刺激器电子刺激器l贮贮存存和和分分析析电电生生理理试试验验结结果果仪仪器器：如如示示波波器器摄影机和计算机。摄影机和计算机。第67页2、电生理学惯用方法、电生理学惯用方法l细细胞胞外外统统计计(Extracellularrecording)：把把引引导导电电极极安放在神经组织表面或附近引导神经组织电活动。安放在神经组织表面或附近引导神经组织电活动。l胞胞内内统统计计(Intracellularrecording)：研研究究神神经经元元基基本本生物物理特征有力伎俩。生物物理特征有力伎俩。EPSP,IPSP,AP(动作电位动作电位)l脑内电刺激：是研究中枢功效定位方法之一。脑内电刺激：是研究中枢功效定位方法之一。第68页l顺顺 行行 冲冲 动动 统统 计计 法法(Orthodromic impulserecording)：就就是是电电刺刺激激某某一一突突触触前前细细胞胞体体、树树突突或或轴轴突突，在在此此突突触触后后神神经经元元细细胞胞体体上上统统计计此刺激引发电活动改变。此刺激引发电活动改变。l逆逆 行行 冲冲 动动 统统 计计 法法(Antidromic impulserecording)：逆逆行行冲冲动动统统计计法法即即电电刺刺激激神神经经元元轴轴突突主主干干或或末末梢梢，在在同同一一神神经经元元胞胞体体统统计计反反相相传导动作电位。传导动作电位。第69页l电压钳技术电压钳技术(VoltageClamp)：经过插入细胞内一根微电极向细胞内补充经过插入细胞内一根微电极向细胞内补充电流，补充电流量恰好等于跨膜流出反向离子电流，补充电流量恰好等于跨膜流出反向离子流，这么即使膜通透性发生改变时，也能控制流，这么即使膜通透性发生改变时，也能控制膜电位数值不变。经过离子通道离子流与经微膜电位数值不变。经过离子通道离子流与经微电极施加电流方向相反，数量相等。电极施加电流方向相反，数量相等。第70页SG:信号发生器，信号发生器，FBA:反馈放大器，反馈放大器，V监监测膜电位测膜电位第71页l膜膜(斑斑)片钳技术（片钳技术（PatchClamp）：）：能能够够从从分分子子水水平平研研究究细细胞胞膜膜离离子子通通道道功功效效，是是用用玻玻璃璃微微电电极极吸吸管管和和只只含含个个离离子子通通道道，面面积积为为几几个个平平方方微微米米细细胞胞膜膜经经过过负负压压吸吸引引封封接接起起来来，因因为为电电极极尖尖端端与与细细胞胞膜膜高高阻阻封封接接，此此片片膜膜内内开开放放所所产产生生电电流流流流进进玻玻璃璃吸吸管管，用用一一极极敏敏感感电电流流监监视视器器（斑斑片片钳钳放放大大器器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。第72页膜片钳（膜片钳（patchclamp）内尔内尔内尔内尔(Neher)(Neher)萨克曼萨克曼萨克曼萨克曼(Sakmann)(Sakmann)（1944-1944-）（1942-1942-）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）合作创造了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。合作创造了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。合作创造了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。合作创造了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一结果对于研究细胞功效调控至关主要，可揭示神经系统、肌肉系统、心这一结果对于研究细胞功效调控至关主要，可揭示神经系统、肌肉系统、心这一结果对于研究细胞功效调控至关主要，可揭示神经系统、肌肉系统、心这一结果对于研究细胞功效调控至关主要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等各种疾病发病机理，并提供治疗新路径。血管系统及糖尿病等各种疾病发病机理，并提供治疗新路径。血管系统及糖尿病等各种疾病发病机理，并提供治疗新路径。血管系统及糖尿病等各种疾病发病机理，并提供治疗新路径。二人共获二人共获二人共获二人共获1991199119911991年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。第73页膜片钳膜片钳第74页经典统计模式：经典统计模式：贴附式（贴附式（Cell-attached Cell-attached 或或 on cell)on cell)内膜向外式内膜向外式(Inside-out)(Inside-out)外膜向外式外膜向外式(Outside-out)(Outside-out)全细胞统计方式全细胞统计方式(Whole-cell recording)(Whole-cell recording)第75页第76页第77页第78页l脑电波测定脑电波测定:用双极或单极引导法，将引导电极放在脑用双极或单极引导法，将引导电极放在脑活动区颅骨表面之上，能够统计出能变换方向活动区颅骨表面之上，能够统计出能变换方向微弱电流。经过强力放大统计出来电位称脑电微弱电流。经过强力放大统计出来电位称脑电图（）。图（）。第79页l诱发电位诱发电位:中枢神经任何部位对于有意刺激感受器官，感中枢神经任何部位对于有意刺激感受器官，感受神经、感觉通路上任何一点，或与感觉器官受神经、感觉通路上任何一点，或与感觉器官相关任何结构上一点，所产生电改变，叫做诱相关任何结构上一点，所产生电改变，叫做诱发电位（发电位（evokedpotential)。第80页l经典生物化学方法包含：l离心离心l电泳电泳l层析层析l质谱质谱等l因为生物化学方法与药理学、免疫学等其它学科相结合，又发展