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1第第12讲讲 生物技术生物技术 第一节第一节 生物技术概述生物技术概述 第二节第二节 基因工程基因工程 第三节第三节 其它生物技术其它生物技术发光树发光树第1页2第一节第一节 生物技术概述生物技术概述生物技术将主导人类历史第三次技术革命生物技术将主导人类历史第三次技术革命第一次技术革命第一次技术革命工业革命工业革命 解放人双手解放人双手第二次技术革命第二次技术革命信息技术信息技术 扩展人大脑扩展人大脑第三次技术革命第三次技术革命生物技术生物技术 改造生命本身改造生命本身生物技术发展为人类带来了巨大利益和财富生物技术发展为人类带来了巨大利益和财富，将是未来经济发展新动力。将是未来经济发展新动力。第2页3生物工程简史生物工程简史传统发酵酿酒、制酱、制醋技术传统发酵酿酒、制酱、制醋技术1860年，年，Pausteur单一霉菌纯粹培养技术单一霉菌纯粹培养技术1878年，啤酒酵母单一培养技术年，啤酒酵母单一培养技术1881年，细菌纯粹培养技术年，细菌纯粹培养技术1929年，发觉抗菌素年，发觉抗菌素“盘尼西林盘尼西林”1946年，用细菌生产出氨基酸年，用细菌生产出氨基酸1952年，用微生物转化荷尔蒙取得成功年，用微生物转化荷尔蒙取得成功1953年，年，Watson和和Crick提出了提出了DNA双螺旋结构双螺旋结构1956 年，年，Kornberg 发觉了发觉了 DNA 聚合酶聚合酶1966 年，破译了氨基酸三联密码子年，破译了氨基酸三联密码子 第3页4生物工程简史生物工程简史1970 年，发觉了核酸限制性内切酶年，发觉了核酸限制性内切酶1972年，年，Stanford大学构建了第一个重组大学构建了第一个重组DNA分子分子1975 年，研制出了第一个单克隆抗体年，研制出了第一个单克隆抗体 1982 年，年，FDA 同意了第一个基因工程药品同意了第一个基因工程药品-重组人重组人 胰岛素胰岛素1983 年，年，Mullis 创造了聚合酶链式反应创造了聚合酶链式反应(PCR)技术技术1990 年，人类基因组计划年，人类基因组计划(HGP)开启开启1997 年，克隆羊多利诞生年，克隆羊多利诞生 年，人类基因组序列草图完成年，人类基因组序列草图完成，人类基因组计划完成，人类基因组计划完成第4页世界上第一个生物技术企业世界上第一个生物技术企业1976年年4月月7日，日，Herb Boyer 和和 Bob Swanson 创建了创建了 Genentech 企业，企业，标志着生物技术产标志着生物技术产业诞生。业诞生。5第5页生物技术生物技术应用自然科学及工程学原理，依靠微生物、应用自然科学及工程学原理，依靠微生物、动物、植物体对物料进行加工，以提供产动物、植物体对物料进行加工，以提供产品为社会服务技术品为社会服务技术19821982年，国际合作年，国际合作与发展组织与发展组织以当代生命科学为基础，结合先进工程技以当代生命科学为基础，结合先进工程技术伎俩和其它基础学科科学原理，按照预术伎俩和其它基础学科科学原理，按照预先设计改造生物体或加工生物原料，为人先设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或到达某种目标类生产出所需产品或到达某种目标19861986年，国家科委年，国家科委第6页当代生物技术当代生物技术传统生物技术：微生物发酵，普通可分为传统生物技术：微生物发酵，普通可分为上游上游/中游中游/下游过程下游过程当代生物技术：以当代生物技术：以DNA重组为主要伎俩基重组为主要伎俩基因工程为关键，也包含酶工程因工程为关键，也包含酶工程/细胞工程细胞工程/发酵工程等；多学科交叉；广泛使用计算发酵工程等；多学科交叉；广泛使用计算机及各种高科技仪器设备；应用领域广泛机及各种高科技仪器设备；应用领域广泛第7页8生物工程生物工程生物工程是生物技术总称，是对生命有机体在生物工程是生物技术总称，是对生命有机体在分子水平分子水平、细胞水平细胞水平、组织水平组织水平、个体水平个体水平进进行不一样层次创造性设计和改造，使之能行不一样层次创造性设计和改造，使之能定向定向组建含有特定性状新物种或新品系，从而造福组建含有特定性状新物种或新品系，从而造福人类当代应用技术。人类当代应用技术。硕士物工程意义：硕士物工程意义：使人类进入了按照自己需要人工创造新生物伟大使人类进入了按照自己需要人工创造新生物伟大时代。时代。世界新技术革命三大支柱之一（信息、材料、世界新技术革命三大支柱之一（信息、材料、生生物工程物工程），含有相当大发展潜力。），含有相当大发展潜力。第8页9生物工程内容和特点生物工程内容和特点生物工程四大致系：生物工程四大致系：基因工程基因工程细胞工程细胞工程蛋白质工程蛋白质工程发酵工程发酵工程生物工程显著特点：生物工程显著特点：高技术（精细和密集复杂技术）高技术（精细和密集复杂技术）高投入（尤其是前期科研投入高）高投入（尤其是前期科研投入高）高利润高利润第9页10第二节第二节 基因工程基因工程基因工程基因工程就是将不一样生物外源就是将不一样生物外源DNA(DNA(基因）基因）插入到载体分子上，形成插入到载体分子上，形成“杂种杂种”DNADNA分子，分子，导入受体细胞中扩增和表示，导入受体细胞中扩增和表示，从而得到期从而得到期望由这个外源基因所编码蛋白质。望由这个外源基因所编码蛋白质。重组重组DNADNA技术技术，又称为基因或分子克隆技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程关键技术。该技术包含了一系是基因工程关键技术。该技术包含了一系列分子生物学操作步骤。列分子生物学操作步骤。第10页112.1 理论上三大发觉和技术上三大创理论上三大发觉和技术上三大创造造成了基因工程诞生造造成了基因工程诞生理论上三大发觉：理论上三大发觉：DNADNA为遗传物质为遗传物质DNADNA双螺旋结构发觉和双螺旋结构发觉和DNADNA半保留复制机制半保留复制机制遗传密码与中心法则遗传密码与中心法则技术上三大创造：技术上三大创造：限制性内切酶和连接酶限制性内切酶和连接酶载体载体逆转录酶逆转录酶19731973年，完成了年，完成了DNADNA体外重组并成功转化体外重组并成功转化第11页分子生物学基础分子生物学基础DNA即脱氧核糖核酸，携带决定生物遗传，即脱氧核糖核酸，携带决定生物遗传，细胞分裂、分化、生长以及蛋白质生物合细胞分裂、分化、生长以及蛋白质生物合成等生命信息成等生命信息DNA分子基本单位是脱氧核糖核苷酸，由分子基本单位是脱氧核糖核苷酸，由碱基、脱氧核糖和磷酸基三部分组成碱基、脱氧核糖和磷酸基三部分组成碱基有四种：碱基有四种：A、G、C、T第12页13限制性内切酶限制性内切酶DNADNA“手术刀手术刀”限制性内切酶：限制性内切酶：生物工程中最主要工具酶，生物工程中最主要工具酶，主要从原核生物中提取；它能识别双链主要从原核生物中提取；它能识别双链DNADNA分子中特异性核苷酸序列，使它在特定位分子中特异性核苷酸序列，使它在特定位点水解。点水解。Arber、Smith和和Nathans因为在发觉限制因为在发觉限制性内切酶方面开创性工作而共同取得了性内切酶方面开创性工作而共同取得了1978年诺贝尔奖年诺贝尔奖该种酶已经发觉和判定了该种酶已经发觉和判定了200各种各种第13页14EcoRI和和T4连接酶连接酶EcoEcoRIRI特异特异识别识别GAATTCGAATTC粘性粘性末端末端第14页常见限制性内切酶常见限制性内切酶15第15页16载体载体运输基因工具运输基因工具载体是运输目标基因片段进入宿主细胞工载体是运输目标基因片段进入宿主细胞工具，当前最惯用载体包含细菌质粒、噬菌具，当前最惯用载体包含细菌质粒、噬菌体、体、cosmid质粒和质粒和YAC载体等。载体等。质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外能质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外能够自主复制一段环状够自主复制一段环状DNA分子。进入到宿分子。进入到宿主细胞中一个质粒能够大量增加其拷贝数。主细胞中一个质粒能够大量增加其拷贝数。第16页17细菌质粒细菌质粒pUC18多克隆多克隆位点位点第17页182.2 重组重组DNA普通普通操作步骤操作步骤1 1、取得目标基因、取得目标基因2 2、构建重组、构建重组DNADNA分子分子3 3、转化受体细胞、转化受体细胞4 4、筛选和判定转化子、筛选和判定转化子5 5、培养转化细胞取得、培养转化细胞取得所需遗传性状或产物所需遗传性状或产物第18页19（1）获得目基因）获得目基因分离分离逆转录逆转录从生物从生物基因组基因组中分离中分离基因组基因组DNADNA酶切产物酶切产物总总RNARNAmRNAmRNAcDNAcDNA人工人工合成合成化学合成化学合成PCRPCR第19页20细胞内总细胞内总DNA提取提取第20页21紫外分紫外分光光度光光度计测定计测定DNA溶溶液纯度液纯度和浓度和浓度第21页22基因文库构建基因文库构建第22页23反转录反转录人工合人工合成成cDNA第23页24PCR法法同时完成同时完成目标基因寻目标基因寻 找和扩增找和扩增PCR创造是创造是DNA操作技术革命操作技术革命美国美国Mullis教授教授1988年创造了年创造了PCR技术技术1993年取得诺贝尔奖年取得诺贝尔奖第24页25（2）构建重组构建重组DNADNA分子分子外源外源DNADNA质质粒粒酶切位点酶切位点酶切位点酶切位点酶切酶切酶切酶切混合混合DNADNA连接酶连接酶第25页26（3 3）将重组）将重组DNADNA引入宿主细胞引入宿主细胞转化转化：某一基因型细胞从周围介质中吸收某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞另一基因型细胞DNA，而使其基因型和表，而使其基因型和表型发生对应改变现象。型发生对应改变现象。转染转染：除去蛋白质外壳病毒核酸感染细胞除去蛋白质外壳病毒核酸感染细胞或原生质体过程。或原生质体过程。转导转导：用噬菌体做载体，将一个细胞基因用噬菌体做载体，将一个细胞基因传递给另一个细胞过程传递给另一个细胞过程.第26页27基基因因枪枪法法第27页28显显微微注注射射第28页29农农杆杆菌菌介介导导第29页30（4）对转化子筛选）对转化子筛选筛选：筛选：从大量携带重组体从大量携带重组体DNADNA宿主细胞中分宿主细胞中分离出携带目标基因细胞。离出携带目标基因细胞。筛选方法：筛选方法：遗传学方法遗传学方法对于带有抗药性基因质粒，可对于带有抗药性基因质粒，可经过检测受体菌是否由敏感状态变成抗药状态经过检测受体菌是否由敏感状态变成抗药状态进行筛选进行筛选.免疫学方法免疫学方法用特异性抗体检测基因产物从用特异性抗体检测基因产物从而筛选阳性克隆方法而筛选阳性克隆方法第30页31Southern杂交杂交转化子分转化子分析析第31页32将老鼠基因转到大肠杆菌中将老鼠基因转到大肠杆菌中抽取抽取DNADNA切下鼠切下鼠DNADNA切开质粒切开质粒DNADNA将质粒导入宿主细胞将质粒导入宿主细胞混合、连接混合、连接 第32页33将老鼠基因转到大肠杆菌中将老鼠基因转到大肠杆菌中培养基中加抗生素培养基中加抗生素培养培养裂解细胞释放裂解细胞释放DNADNA分子分子杂交杂交分离扩增目克隆第33页342.3 基因工程应用基因工程应用基因工程在基因工程在医学医学上被用于大量生产过去难以上被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到蛋白质肽类药品。得到或几乎不可能得到蛋白质肽类药品。10g胰岛素胰岛素1000 磅牛胰磅牛胰200升发酵液升发酵液干扰素干扰素1200升人血升人血1升发酵液升发酵液23万美元万美元/病人病人200300美元美元/病人病人第34页35基因工程技术提升奶酪产量基因工程技术提升奶酪产量哺乳小牛哺乳小牛胃胃凝乳酶凝乳酶凝乳酶基因凝乳酶基因啤酒酵母啤酒酵母转入转入制造奶酪制造奶酪第35页36转基因农作物转基因农作物转基因植物取得新性状转基因植物取得新性状第36页37全球转基因作物种植情况全球转基因作物种植情况第37页38转基因动物转基因动物转基因动物首先在小鼠转基因动物首先在小鼠取得成功。现在转基因取得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，动物技术已用于牛、羊，使得从使得从 牛牛/羊羊 奶中能够奶中能够生产蛋白质药品。称为生产蛋白质药品。称为“乳腺反应器乳腺反应器”工程。工程。比如：从转基因羊羊奶比如：从转基因羊羊奶中提取出治疗心脏病药中提取出治疗心脏病药品品tPAtPA第38页蜘蛛山羊蜘蛛山羊转基因山羊能经转基因山羊能经过乳腺分泌产生过乳腺分泌产生有着超强抗张强有着超强抗张强度蜘蛛丝，很多度蜘蛛丝，很多科学家把蜘蛛丝科学家把蜘蛛丝叫做叫做“生物钢生物钢”。39第39页40环境工程菌环境工程菌美国美国 GE 企业结构成功含有巨大烃类分解能企业结构成功含有巨大烃类分解能力工程菌，并获专利，用于去除石油污染。力工程菌，并获专利，用于去除石油污染。第40页研究人类远古遗传信息研究人类远古遗传信息41第41页42第三节第三节 其它生物技术其它生物技术3.1 细胞工程：细胞工程：是指经过细胞水平上筛选或改是指经过细胞水平上筛选或改造，取得有商业价值细胞株或细胞系，再经过造，取得有商业价值细胞株或细胞系，再经过规模培养，取得特殊商品技术与过程。规模培养，取得特殊商品技术与过程。基本原理基本原理：将一个生物细胞中携带全套遗传信：将一个生物细胞中携带全套遗传信息息基因组或染色体基因组或染色体全部转入另一个生物细胞，全部转入另一个生物细胞，从而改变细胞遗传性，改造生物性状和功效。从而改变细胞遗传性，改造生物性状和功效。包含包含细胞融合细胞融合、细胞器移植细胞器移植、染色体工程染色体工程、细细胞和组培技术胞和组培技术等。等。第42页43动动物物细细胞胞培培养养第43页44体细胞杂交体细胞杂交/细胞融合技术细胞融合技术体细胞杂交体细胞杂交/细胞融合技术：细胞融合技术：经过生物学、经过生物学、化学或物理学方法，使两个不一样种类体化学或物理学方法，使两个不一样种类体细胞融合在一起，从而产生含有两个亲本细胞融合在一起，从而产生含有两个亲本遗传性状新细胞。遗传性状新细胞。比如：比如：童鱼童鱼世界上第一条没有父母鱼世界上第一条没有父母鱼，“鲫鲤核质杂交鱼鲫鲤核质杂交鱼”第44页利用杂交瘤细胞制备单利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体克隆抗体第45页克隆克隆“多莉羊多莉羊”细细胞融合技术高峰胞融合技术高峰第46页473.2 蛋白质工程蛋白质工程“后基因组时代后基因组时代”将是将是“蛋白质组课时代蛋白质组课时代”，即从对基因信息研究转向对蛋白质信息，即从对基因信息研究转向对蛋白质信息研究，包含研究蛋白质结构、功效与应用研究，包含研究蛋白质结构、功效与应用及蛋白质相互关系和作用。及蛋白质相互关系和作用。蛋白质工程就是在对蛋白质化学、晶体学、蛋白质工程就是在对蛋白质化学、晶体学、动力学等结构与功效认识基础上，对蛋白动力学等结构与功效认识基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终取得商业化产品。质人工改造与合成，最终取得商业化产品。第47页48蛋白质工程普通过程蛋白质工程普通过程从生物体中分离纯化目标蛋白从生物体中分离纯化目标蛋白测定其氨基酸序列测定其氨基酸序列借助核磁共振和借助核磁共振和X射线晶体衍射等伎俩，尽可射线晶体衍射等伎俩，尽可能地了解蛋白质二维重组和三维晶体结构能地了解蛋白质二维重组和三维晶体结构设计各种处理条件，了解蛋白质结构改变，包设计各种处理条件，了解蛋白质结构改变，包含折叠与去折叠等对其活性与功效影响含折叠与去折叠等对其活性与功效影响设计编码该蛋白基因改造方案，如点突变设计编码该蛋白基因改造方案，如点突变分离、纯化新蛋白，功效检测后投入实际使用。分离、纯化新蛋白，功效检测后投入实际使用。第48页酶催化反应动力学酶催化反应动力学第49页50经过点突变改造蛋白质结构经过点突变改造蛋白质结构第50页蛋白质复性蛋白质复性将蛋白质从结构不规将蛋白质从结构不规则、无活性状态，恢则、无活性状态，恢复到有唯一立体结构、复到有唯一立体结构、有生物活性状态过程有生物活性状态过程称为称为蛋白质复性蛋白质复性。第51页大肠杆菌表示系统大肠杆菌表示系统效率高、产量大效率高、产量大 周期短、成本低周期短、成本低 工艺稳定、质量可控工艺稳定、质量可控缺点是易形成包含体。缺点是易形成包含体。因无法有效处理复性因无法有效处理复性问题，在美国每年造问题，在美国每年造成经济损失就达成经济损失就达十亿十亿美元美元 第52页原核与真核细胞表示系统比较原核与真核细胞表示系统比较原核细胞原核细胞:发酵发酵包含体包含体复性复性 纯化纯化目蛋白目蛋白真核细胞真核细胞:发酵发酵 上清液上清液纯化纯化目蛋白目蛋白第53页543.3 发酵工程发酵工程发酵工程是利用微生物特征，经过当代工程技发酵工程是利用微生物特征，经过当代工程技术，生产有用物质或直接将其应用于工业化生术，生产有用物质或直接将其应用于工业化生产一门技术。产一门技术。发酵工程基本步骤：包含发酵工程基本步骤：包含菌种选育菌种选育、菌种生产菌种生产、代谢产物发酵代谢产物发酵和和分离分离以及以及微生物机能利用微生物机能利用等。等。优点：优点：投资省；见效快；污染小投资省；见效快；污染小发酵工程应用广泛：发酵工程应用广泛：医药工业；食品工业；能医药工业；食品工业；能源工业；饲料工业；冶金工业；农业源工业；饲料工业；冶金工业；农业第54页发酵工业回顾发酵工业回顾几千年前，人类开始酿酒、制酱、制奶酪等几千年前，人类开始酿酒、制酱、制奶酪等1675年，列文虎克创造了显微镜，观察到了微年，列文虎克创造了显微镜，观察到了微生物生物巴斯德证实酒精发酵是因为酵母菌引发，发酵巴斯德证实酒精发酵是因为酵母菌引发，发酵现象是由微生物所进行化学反应现象是由微生物所进行化学反应柯赫建立了单种微生物分离和纯培养技术，新柯赫建立了单种微生物分离和纯培养技术，新发酵产品不停出现，以固态发酵和浅层液态发发酵产品不停出现，以固态发酵和浅层液态发酵为主酵为主上世纪上世纪40年代，抗生素大规模深层发酵工艺建年代，抗生素大规模深层发酵工艺建立立伴随新型发酵设备、发酵工艺和育种技术发展，伴随新型发酵设备、发酵工艺和育种技术发展，当代发酵工程到达了一个新高度当代发酵工程到达了一个新高度第55页发酵工程内容发酵工程内容发酵工程由三部分组成：上游工程、发酵工程和发酵工程由三部分组成：上游工程、发酵工程和下游工程下游工程上游工程包含优良菌种选育、最适发酵条件（上游工程包含优良菌种选育、最适发酵条件（pH、温、温度、溶氧和营养组成）确实定、营养物准备等度、溶氧和营养组成）确实定、营养物准备等发酵工程主要指在最适发酵条件下，在发酵罐中大量发酵工程主要指在最适发酵条件下，在发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物工艺技术。要求严格无菌生培养细胞和生产代谢产物工艺技术。要求严格无菌生长环境。可分为分批发酵，补料分批发酵和连续发酵长环境。可分为分批发酵，补料分批发酵和连续发酵下游工程指从发酵液中分离和纯化产品技术。包含固下游工程指从发酵液中分离和纯化产品技术。包含固液分离技术，细胞破壁技术，蛋白质纯化技术，和产液分离技术，细胞破壁技术，蛋白质纯化技术，和产品包装处理技术。还要考虑发酵后菌体与废物处理问品包装处理技术。还要考虑发酵后菌体与废物处理问题题第56页发酵工艺组成部分发酵工艺组成部分培养基制备培养基制备 种子培养种子培养发酵罐发酵罐产物提取精制产物提取精制无菌空气无菌空气第57页菌种选育菌种选育发酵工业生产水平取决于三个要素：生产菌种、发酵工业生产水平取决于三个要素：生产菌种、发酵工艺和设备发酵工艺和设备菌种选育目标是为了改良菌种特征，使其符合工菌种选育目标是为了改良菌种特征，使其符合工业生产需要业生产需要提升其生产能力提升其生产能力能适应特定工艺条件，如能利用廉价原料、耐受性好能适应特定工艺条件，如能利用廉价原料、耐受性好当前主要采取自然选育和诱变育种方法，工作量当前主要采取自然选育和诱变育种方法，工作量大，有一定盲目性大，有一定盲目性基因工程、细胞工程等育种方法含有定向性基因工程、细胞工程等育种方法含有定向性第58页发酵基本过程发酵基本过程第59页初级代谢产物和次级代谢产物比较初级代谢产物和次级代谢产物比较第60页发酵生物反应器发酵生物反应器发酵罐是最主要微生物细胞反应器发酵罐是最主要微生物细胞反应器染菌率低染菌率低大型化，有利于提升经济效益大型化，有利于提升经济效益过程优化可提升产量和降低成本过程优化可提升产量和降低成本利于提升产品回收率和质量利于提升产品回收率和质量生物反应器基本类型生物反应器基本类型搅拌式生物反应器（搅拌式生物反应器（stirred tank reactor）鼓泡塔式反应器（鼓泡塔式反应器（bubble column）气升式反应器（气升式反应器（airlift reactor）第61页几个常见生物反应器几个常见生物反应器第62页发酵罐结构发酵罐结构第63页发酵过程监测发酵过程监测物理参数物理参数温度、压力、流量、转速、粘度、泡沫位等温度、压力、流量、转速、粘度、泡沫位等化学参数化学参数pH、溶氧、尾气、发酵液成份、离子浓度等、溶氧、尾气、发酵液成份、离子浓度等生物参数生物参数生物量、生物量、ATP、蛋白质等、蛋白质等在线与非在线测量在线与非在线测量间接测量间接测量第64页65本讲摘要本讲摘要以重组以重组DNADNA操作为关键技术过程被称为基因工程。操作为关键技术过程被称为基因工程。基因工程发展带动和促进了蛋白质工程、发酵工基因工程发展带动和促进了蛋白质工程、发酵工程和细胞工程发展，它们相互补充和相互渗透，程和细胞工程发展，它们相互补充和相互渗透，形成了生物技术上游与下游关系。形成了生物技术上游与下游关系。重组重组DNADNA技术普通操作步骤有：技术普通操作步骤有：(1)(1)取得目标基因；取得目标基因；(2)(2)构建重组质粒；构建重组质粒；(3)(3)转化受体细胞；转化受体细胞；(4)(4)筛选和筛选和判定转化子；判定转化子；(5)(5)培养转化细胞取得所需性状或所培养转化细胞取得所需性状或所需产物。需产物。第65页66思索题思索题1、基因工程技术发展给人类带来影响？、基因工程技术发展给人类带来影响？2、基因工程基本过程？、基因工程基本过程？3、获取目标基因方法？、获取目标基因方法？4、DNA片段怎样与载体连接片段怎样与载体连接?第66页