耐盐芦苇高频遗传转化体系的建立.pdf
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1、书书书第 卷第 期烟台大学学报(自然科学与工程版)年 月 ()文章编号:():收稿日期:基金项目:山东省“渤海粮仓”科技示范工程升级版计划项目();国家自然科学基金资助项目();山东自然科学基金资助项目()。通信作者:张侠(),副教授,博士,主要研究方向为植物功能基因组和微生物开发利用。耐盐芦苇高频遗传转化体系的建立王美玲,韩建玮,陈方军,尹海波,张侠(烟台大学生命科学学院,山东 烟台 )摘要:以耐盐芦苇()种子愈伤组织为材料,以根瘤农杆菌 为媒介建立高效的芦苇遗传转化体系。结果表明:在潮霉素浓度为 、浓度为 时不定芽分化率达到最高。将沉默载体 通过根瘤农杆菌 在芦苇愈伤组织中进行遗传转化,共
2、获得 个抗性株系,转化率为 。实时荧光定量 检测显示 个株系实现了基因沉默,表明该转化体系高效可用。关键词:芦苇;根瘤农杆菌;遗传转化中图分类号:文献标志码:芦苇(),禾本科,芦苇属,具有较强的繁殖能力和环境适应能力 ,在滨海湿地生态系统中属于优势物种 。芦苇可以通过调整形态和生理特征来应对水淹、盐渍和极端气候等不同类型的非生物胁迫 ,具有较高的生态价值。芦苇在盐胁迫下可以将体内过多的 排出体外以减少离子的毒害 ,并通过调节体内 和 平衡,将 从地下组织转运到地上组织,因此对湿地有一定除 的作用 。芦苇作为研究耐盐胁迫的模式植物,已建立多个 文库并鉴定了大量功能基因。国内外针对芦苇的遗传转化报
3、道甚少且大多使用下胚轴诱导愈伤组织 ,研究并优化芦苇遗传转化体系,将有助于芦苇重要基因功能的鉴定,更好地挖掘抗逆相关基因。本研究利用山东东营滨海湿地的耐盐芦苇种子诱导愈伤组织,就愈伤组织分化、抗性筛选的条件进行优化探讨,建立高频转化体系,同时利用沉默载体验证该体系的转化效率,为进一步鉴定抗逆相关基因提供参考。材料和方法 材料芦苇种子采自山东东营滨海湿地,侵染用根瘤农杆菌 、沉默载体 (潮霉素 作为抗性标记)由烟台大学生命科学学院植物发育分子生物学实验室构建并保存。方法 光照对诱导愈伤组织的影响挑选颗粒饱满、大小相近的成熟芦苇种子,乙醇振荡消毒 ;再用 安替福民浸泡 ,不间断地轻轻振荡;最后用无
4、菌水振荡清洗 ,重复 次,放在无菌滤纸上吸干水份。将消毒后的种子均匀放至诱导培养基(,)上,每个培养皿接种 粒,低温处理 打破种子热休眠,转入恒温培养室(),光照强度 ,分为以下 组进行处理:()暗培养 ;()光照培养 ;()先进行暗培养 ,观察到种子出现萌动迹象再放于光下培养 。烟台大学学报(自然科学与工程版)第 卷每个处理含 个培养皿。待愈伤组织长到直径 左右,在超净工作台内将褐化的芽切除,将愈伤组织转接至诱导培养基上继续培养,待愈伤组织生长到黄豆大小,挑选黄色致密的块状愈伤组织在继代培养基(,)上培养,每周继代一次,继代次,观察其增殖情况,统计诱导出愈伤组织数和出愈率。出愈率(诱导出愈伤
5、组织数 接种的芦苇种子数)。根瘤农杆菌 介导的转化和共培养将 载体利用冻融法转入农杆菌 中,然后将构建好的重组根瘤农杆菌接种于含 氯霉素()的甘露醇培养基()中,于 暗培养,调整侵染液的吸光度值为 左右,培养得到的单菌落刮下后转至 侵染液中,并轻轻摇晃。从诱导后的愈伤组织中挑选表面干燥、生长旺盛的在预 共培养基(,)中预活化 ,将活化后的愈伤组织切成直径 左右的组织块置于侵染液中浸泡 ,期间不断晃动以保证愈伤组织可以充分接触侵染液。侵染完成后倒出悬浮液,取愈伤组织吸干水份,转移至盖有滤纸的预 共培养基中于 暗培养 。无菌水振荡冲洗 次直至溶液完全澄清,然后用含 头孢的水振荡 脱菌。不同浓度潮霉
6、素()对转化的影响将上述脱菌后的愈伤组织用无菌滤纸吸干水份,置于不同浓度 抗性的筛选培养基(,头孢 蔗糖,)中。浓度梯度设置为 、,每个培养皿接入 块愈伤组织,每个浓度处理含 个培养皿,培养两周后,更换培养基继续培养,重复筛选两次后,统计抗性愈伤率。抗性愈伤率(抗性愈伤组织数 侵染的愈伤组织总数)。不同浓度 对分化的影响挑选侵染后的黄色颗粒状、疏松的抗性愈伤组织,分割成 大小,接种在不同浓度 的分化培养基(,)上,浓度梯度设置为 、,每个培养皿接入 块愈伤组织,每个处理含 个培养皿,等到长出绿色组织后统计不定芽分化率。不定芽分化率(分化出不定芽的外植体数量 外植体总数)。驯化与移栽将出芽的愈伤
7、组织于分化培养基上培养两代(周 代)后,将整株苗移入生根壮苗培养基(蔗糖 ,),光照诱导生根两周,等到再生苗的根长到 时,将瓶苗移出,轻轻洗去根基部培养基,移栽到蛭石 黑土 的移栽基质中于温室培养。转基因植株的检测与鉴定采用 法提取候选转基因植株叶片的基因组 ,扩增 基因片段,以野生型芦苇叶片 扩增产物为阴性对照,重组载体扩增产物为阳性对照。确定阳性转基因株系,并计算转化率。转化率(检测均为阳性植株数 以最佳组合转化的总愈伤组织数)。提取阳性转基因株系的 ,根据芦苇 基因设计引物进行实时荧光定量 检测。结果与分析 光照对诱导愈伤组织的影响本研究分析了光照对外植体的生长状态、颜色以及愈伤组织出现
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- 关 键 词:
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