炮制前后地骨皮药材与饮片质量相关性分析.pdf

中药炮制专栏 基金项目:云南省工信厅 年中药饮片产业发展专项资金(.)作者简介:董汛男硕士副高级工程师研究方向:中药研究与开发:.通信作者:杨增明男硕士正高级工程师研究方向:中药研究与开发:.炮制前后地骨皮药材与饮片质量相关性分析董汛周林牛延菲谢佳颖陆雪萍李小辉杨增明(.云南省药物研究所云南 昆明.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室云南 昆明)摘要:目的 研究炮制前后地骨皮药材与饮片的质量相关性 方法 建立地骨皮乙素含量和特征图谱的高效液相色谱()测定方法 照中国药典 年版(四部)相关规定测定浸出物、总灰分和酸不溶性灰分 结果 地骨皮乙素在.范围内线性关系良好相关系数.精密度、稳定性和重复性的 均小于等于.平均加样回收率为.为.除地骨皮乙素峰(峰)外供试品色谱图中共呈现 个特征峰 批地骨皮药材及对应饮片测定结果表明炮制前后地骨皮乙素、浸出物、总灰分和酸不溶性灰分的平均转移率分别为.、.、.和.分别为.、.、.和.以峰面积计算特征图谱 个特征峰平均转移率在.之间 在.之间 结论检测方法合理结果准确可靠 与浸出物转移率比较总灰分和酸不溶性灰分的转移率较高地骨皮乙素转移率较低且差异较大个特征峰转移率有高有低 研究结果可为相关中药研究和生产中质量设计空间确定、炮制工艺研究、药材和饮片质量控制等提供参考关键词:地骨皮炮制饮片相关性地骨皮乙素特征图谱中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.):.().药学研究 .:中药材地骨皮为茄科植物枸杞(.)或宁夏枸杞(.)的干燥根皮 春初或秋后采挖根部洗净剥取根皮晒干宁夏枸杞原产我国内蒙古、山西北部、陕西北部、甘肃、宁夏等北部省区目前多栽培以宁夏、甘肃等地栽培多、产量大 枸杞则广泛分布于我国东北、河北、山西、陕西、甘肃南部以及西南、华中、华南和华东各省区多为野生 地骨皮甘寒 归肺、肝、肾经具有凉血除蒸清肺降火的功效 用于阴虚潮热骨蒸盗汗肺热咳嗽咯血衄血内热消渴 地骨皮药材及饮片标准收载于中国药典 年版(一部)以及香港中药材标准第六册、日本药典()等中药材标准中 中国药典规定地骨皮饮片的炮制方法为“除去杂质及残余木心洗净晒干或低温干燥”地骨皮药材中地骨皮乙素的高效液相色谱测定和特征图谱研究已有相关报道未见基于多指标分析的药材与饮片相关性研究报道 本文首次以地骨皮关键质量属性之地骨皮乙素含量、特征图谱、浸出物、总灰分与酸不溶性灰分为指标以多个代表性产地、多批代表性样品为对象对地骨皮药材与饮片间的质量相关性进行了系统研究和分析为相关中药新药的研究设计、药品生产质量管理等提供参考 仪器与材料 高效液相色谱仪(美国沃特世公司)电子天平、电子天平(瑞士梅特勒托利多仪器有限公司).箱式电阻炉(天津市泰斯特仪器有限公司)电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)数显恒温水浴锅(常州智博瑞仪器制造有限公司)型洗药机(南京远大干燥设备厂)型热风循环烘箱(中国范群干燥设备有限公司)地骨皮药材采集自宁夏、甘肃各产地代表性原植物标本均经中国科学院昆明植物研究所标本馆李嵘研究员鉴定为宁夏枸杞(.)所有样品依据法定标准鉴定与检验均符合规定所有标本和样品保存于云南省药物研究所 地骨皮乙素(批号:)自制经(、)、(、)、鉴定确证结构经标定含量为.含量()色谱纯度水分炽灼残渣溶剂残留地骨皮甲素(批号:)自制经、鉴定结构含量.(面积归一化法)色谱纯乙腈(公司)三氟乙酸等其他试剂为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)方法与结果.地骨皮饮片炮制 人工拣选除去杂质及残余木心筛去灰屑洗药机清洗(筒体转速 水压.冲洗时间)热风循环烤箱干燥放凉筛去灰屑包装.地骨皮乙素含量测定方法地骨皮乙素是地骨皮 的 主 要 活 性 成 分 专 属 性 强、含 量 较高我们参照香港中药材标准(第六册)地骨皮质量标准及文献方法建立了地骨皮中地骨皮乙素含量测定方法.色谱条件与系统适用性试验色谱柱为 (.)流动相为乙腈().三氟乙酸水溶液()梯度洗脱程序:流 速.检测波长 柱温 进样量 理论板数按地骨皮乙素峰计算应不低于.对照品溶液的制备取地骨皮乙素对照品适量精密称定加甲醇冰醋酸溶液()的混合溶液制成每 含.的溶液摇匀即得.供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约.精密称定置圆底烧瓶中精密加入甲醇醋酸()混合溶液 称定重量加热回流 放冷再称定重量用甲醇醋酸()混合溶液补足减失的重量摇匀滤过取续滤液即得.地骨皮乙素含量测定方法学考察.专属性 供试品溶液色谱图(见图)中供试品溶液目标峰与对照品溶液色谱峰相对保留时间、峰型一致地骨皮乙素与相邻峰(地骨皮甲素)分离度符合要求地骨皮乙素色谱峰光谱纯度良好(纯度角度.纯度阈值.)该方法具有良药学研究 .好的专属性.精密度试验 取地骨皮乙素对照品溶液连续进样 次记录峰面积结果 次峰面积的 为.表明仪器精密度良好.线性关系考察精密称取地骨皮乙素对照品适量加甲醇醋酸()混合溶液制成浓度分别为.、.、.、.、.、.、.、.的对照品溶液按“.”项下色谱条件分别进样记录峰面积以峰面积为纵坐标()浓度为横坐标()进行线性回归得回归方程 相关系数 .结果表明地骨皮乙素在.范围内线性关系良好.稳 定 性 试 验 取 地 骨 皮 药 材(批 号:)粉末按已确定的方法(见“.”项下)进行供试品溶液制备依次于、进样检测计算地骨皮乙素含量得到不同时间地骨皮乙素含量的 为.表明供试品溶液在 内稳定.重 复 性 试 验 取 地 骨 皮 药 材(批 号:)粉末 份每份约.按“.”项下方法分别检测结果 份样品地骨皮乙素平均含量为.为.表明方法重复性良好.准 确 度 试 验 取 地 骨 皮 药 材(批 号:)粉末 份每份约.按“.”项下的方法添加不同比例的地骨皮乙素对照品(.、.)制成 种浓度的供试品溶液各 份分别检测 结果见表 总平均回收率为.(.)为.表明方法准确度良好符合相关要求.特征图谱照“.”项下试验记录色谱图和各色谱峰的保留时间及峰面积 采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(.版)软件对 批地骨皮药材 图谱进行分析生成对照图谱确定 个峰为共有特征峰 通过与对照品比较保留时间、紫外光谱图及峰纯度检查确定峰 为地骨皮乙素峰、峰 为地骨皮甲素峰 与地骨皮乙素对照品相应的色谱峰(峰)为 峰计算上述稳定性试验、重复性试验中其余 个特征峰与 峰的相对保留时间和相对峰面积计算 结果均小于 稳定性、重复性较好.浸出物、总灰分、酸不溶性灰分测定方法照中国药典 年版(四部)相关规定分别进行浸出物(通则 水溶性浸出物测定法 之热浸法)、总灰分和酸不溶性灰分(通则)的测定表 地骨皮乙素含量测定准确度试验结果序号称样量/样品含量/加入量/测得量/回收率()平均回收率()().样品分析检测 对 批地骨皮药材及对应饮片分别进行地骨皮乙素含量、特征图谱、热水浸出物、总灰分和酸不溶性灰分的分析测定结果见表 色谱图及对照特征图谱见图 特征图谱与文献比较药材基原、供试品处理及供试品溶液制备(提取溶剂等)不同色谱条件有差异特征图谱整体相似各有不同 将记录的各特征峰峰面积首先折算为单位质量峰面积(相同供试品浓度下的峰面积)计算公式为:色谱峰峰面积供试品溶液浓度(折干)再用此结果计算平均峰面积及平均转移率等结果见表 表 地骨皮药材及对应饮片检测结果()药材批号代号产地地骨皮乙素含量总灰分酸不溶性灰分水溶性浸出物药材对应饮片药材对应饮片药材对应饮片药材对应饮片宁夏银川西夏区.宁夏银川西夏区.宁夏银川西夏区.宁夏银川西夏区.宁夏银川西夏区.宁夏中宁县.宁夏中宁县.宁夏中宁县.宁夏中宁县.宁夏中宁县.宁夏中宁县.药学研究 .表 (续)药材批号代号产地地骨皮乙素含量总灰分酸不溶性灰分水溶性浸出物药材对应饮片药材对应饮片药材对应饮片药材对应饮片宁夏中宁县.宁夏中宁县.宁夏中宁县.甘肃省靖远县.甘肃省靖远县.甘肃省靖远县.甘肃省靖远县.甘肃省靖远县.宁夏中宁县.宁夏中宁县.宁夏中宁县.平均.平均转移率.注:系按干燥品计算含地骨皮乙素()的质量分数不计饮片炮制过程中产生的重量损失为各样品转移率的算术平均值计算公式为 饮片检验结果 药材检验结果()图 批地骨皮药材及对应饮片 色谱图()和对照特征图谱().地骨皮药材与饮片质量相关性分析我们选择以药材、饮片检测结果直接比较计算转移率的方式进行相关性研究更合理的反映炮制前后地骨皮乙素、特征图谱各特征峰、浸出物等内在质量的变化净制过程为物理过程净制去除的杂质产生的重量损失不宜引入相关性分析当中 批次的检测结果表明炮制前后浸出物平均转移率为.为.说明炮制工艺稳定清洗程度均一总灰分和酸不溶性灰分的转移率较高说明合格药材的总灰分主要为生理灰分(内在灰分)如薄壁细胞中草酸钙砂晶等钙盐 产地加工未洗净的残留泥沙等特别是嵌合在根皮凹陷部分或不同层理间的泥沙已经很难再被清洗去除如果再要清除它们势必造成浸出物等更大的损失表 批地骨皮药材及对应饮片特征图谱特征峰峰面积统计分析色谱峰样品平均峰面积()/()()平均转移率()()峰 峰 峰 峰 峰 峰 药材.对应饮片.药材.对应饮片.药材.对应饮片.药材.对应饮片.药材.对应饮片.药材.对应饮片.注:为相同浓度下各样品相应色谱峰峰面积(单位质量峰面积)的算术平均值同表 为各样品转移率的算术平均值计算公式为 饮片峰面积 药材峰面积()地骨皮乙素平均转移率仅有.且 较大达.较大可能与药材、饮片取样代表性有一定关系也可能与药材形状大小等关系更大 转移率低可能是因为地骨皮乙素易溶于水 以峰面积计算特征图谱其余 个特征峰平均转移率在.之间 在.之间部分峰的转移率与地骨皮乙素(峰)基本一致其中峰、峰、峰 转移率较高均超过了 峰 达 与浸出物转移率基本一致峰(地骨皮甲素)的转移率 较高达 药学研究 .讨论本文选择地骨皮药材和饮片的几个关键质量属性指标研究建立了 检测方法或照药典通则中的方法对多个产地的炮制前后的多批药材样品和饮片样品进行检测以检测结果直接计算转移率直观反映炮制前后各指标的相关性结果表明浸出物平均转移率为.以此为基础进行比较总灰分和酸不溶性灰分的转移率较高达到 以上地骨皮乙素转移率较低仅为.个特征峰转移率有高有低 炮制前后地骨皮药材和饮片几个关键质量指标之间转移率严重不一致 在相关中药的工艺质量研究及生产质量管理过程中设计空间的确定、药材与饮片质量控制等均应充分考虑这种不一致性.关于质量相关性评价指标地骨皮乙素是地骨皮药材与饮片相关性的主要评价指标 特征图谱是目前常用的整体质量评价指标浸出物特别是水溶性浸出物传统上就是中药材及饮片整体质量评价的主要指标也是清洗程度的衡量指标 总灰分、酸不溶性灰分是地骨皮法定标准收载的质量控制项目且为地骨皮的主要风险项目 以上指标均为地骨皮关键质量属性指标以它们作为指标进行评价能够较全面地反映药材与饮片间的相关性.关于 分析测定方法地骨皮乙素含量测定经提取方式选择(超声提取、回流提取)、提取溶剂选择(甲醇、甲醇、甲醇醋酸()混合溶液)、粉碎粒度选择(过二号筛、三号筛、四号筛)、提取溶剂用量选择(、倍)、提取时间选择(、)等试验拟定了供试品溶液制备方法参考文献方法试验确定了梯度洗脱条件和最佳色谱柱等色谱条件 经方法学验证拟定的测定方法用于地骨皮乙素含量测定和特征图谱分析分离度、精密度、重复性、准确度、耐用性等良好结果准确、可靠.关于饮片炮制和药材与饮片质量控制 中国药典 年版中地骨皮药材与饮片的总灰分和酸不溶性灰分的限度规定一致均为不得过.和.依据文献报道地骨皮饮片的抽检不合格率为.总灰分都是主要不合格项目依据本文研究结果合格药材在炮制前后总灰分和酸不溶性灰分下降很少清洗的作用极其有限与此同时浸出物和地骨皮乙素等水溶性成分特别是后者则损失严重 因此地骨皮饮片炮制应在加强采收及产地加工质量控制提高药材质量水平的基础上严格净选质量控制尽量先行除去根皮表面的泥沙和灰屑选择适宜的洗药设备和干燥设备合理确定相关关键工艺参数在总灰分和酸不溶性灰分的去除与浸出物和地骨皮乙素的保留之间找到合理的平衡点确保地骨皮饮片的安全性和有效性参考文献:国家药典委员会.中华人民共和国药典 年版(一部).北京:中国医药科技出版社:.中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志:第 卷.北京:科学出版社:.中华人民共和国香港特别行政区卫生署.香港中药材标准:第六册/.().:/./.:/.().:/./.王亚飞杨平荣杨耘等.基于含量测定和化学计量法的地骨皮多指标成分分析.中国中医药信息杂志():.().():.董丹华刘玉军于帅等.不同产地地骨皮药材水提液高效液相特征图谱研究.中国现代中药():.赵子楠闫立文赵凯.不同产地与等级地骨皮的指纹图谱研究.华西药学杂志():.陈靖枝卢星胡运琪等.传统中药地骨皮化学成分和药理活性研究进展.中国中药杂志():.:.():.杨东.拮抗剂苦柯胺 介导 在肝脏内化清除的分子机制研究.重庆:第三军医大学.()().():.陈倩倩邬丽琴郝丽霞等.批次地骨皮药材的真伪鉴别及质量分析.北方药学():.(收稿日期:)药学研究 .