生物化学和分子生物学酶省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

Wang-Kai FangWang-Kai Fang,PhD,PhD（方王楷）（方王楷）（方王楷）（方王楷）Department of biochemistry and Molecular BiologyShantou University Medical College 第 三 章酶酶Enzyme第1页磨粉 去糠 打坏 酶应用比酶研究含有更长历史成酒 发酵 装瓶麦芽 萌发 浸润酶参加细胞内全部代谢路径第2页v生物化学是在处理Liebig和Pasteur关于发酵本质著名论中产生。巴斯德（Pasteur）李比希（Leibig）“活力论”第3页1897年，比希纳（Buchner)发觉磨碎酵母细菌或无细胞酵母抽提液也能和酵母细菌一样，将糖转变成酒精和二氧化碳，这么才把争论统一起来。当初认为引发发酵是酵母细胞中一个叫酵素物质，现在称为酶酶（Enzyme)。酶发觉酶发觉The Nobel Prizein Chemistry 1907第4页Sumner 对酶发觉有重大贡献温温度度时间时间进行酶进行酶反应试管反应试管SumnerUrease crystal(1926)Discovering Enzyme(1991)p.82第5页v1982年，Thomas Cech从四膜虫rRNA前体加工研究中首先发觉rRNA前体本身含有自我催化作用，提出核酶(ribozyme)概念。v1983年S.Altman等研究RNaseP（20%蛋 白 质 和80%RNA），发 觉 RNaseP中RNA可催化E.coli tRNA前体加工v1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了含有DNA连接酶活性DNA片 段，称 为 脱 氧 核 酶(deoxyribozyme)。Thomas Cech University of Colorado,USA Sidney Altman Yale University,USA 第6页酶概念酶概念v酶是生物体活细胞产生含有特殊催化活性和特定酶是生物体活细胞产生含有特殊催化活性和特定空间构象生物大分子，包含蛋白质及核酸。空间构象生物大分子，包含蛋白质及核酸。v酶是一类含有高效率、高度专一性、活性可调整酶是一类含有高效率、高度专一性、活性可调整生物催化剂。生物催化剂。第7页丙糖磷酸异构酶丙糖磷酸异构酶（TIM）三维结构飘带图和半透明蛋白表面图显示。丙糖磷酸异构酶是经典TIM桶折叠桶折叠，图中用不一样颜色来表示该酶中所含有两个TIM桶折叠结构域。第8页第一节第一节酶分子结构与功效酶分子结构与功效The Molecular Structure and Function of Enzyme 第9页酶分类：酶分类：v单体酶单体酶(monomeric enzyme)(monomeric enzyme)：由由单条肽链单条肽链组成组成,仅含有三级结构酶。仅含有三级结构酶。v寡聚酶寡聚酶(oligomeric enzyme)(oligomeric enzyme)：由由多个相同或不一样亚基多个相同或不一样亚基以非共价键连接以非共价键连接组成酶。组成酶。蛋白激酶A、磷酸果糖激酶-1 4个亚基溶菌酶溶菌酶（英文名称：Lysozyme）是一个分子量为14.4kDa酶，它经过催化肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨乙酰氨基葡萄糖基葡萄糖残基间和壳糊精壳糊精中N-乙酰葡糖胺残基间1,4-链水解，而破坏细菌细胞壁。第10页 (multienzyme system)(multienzyme system)：由由几个不一样功效几个不一样功效酶酶彼此聚合形成多酶复合彼此聚合形成多酶复合物。物。v多酶体系多酶体系丙酮酸丙酮酸脱氢酶脱氢酶复合体复合体（Pyruvate dehydrogenase complex；PDH complex）是生物体内催化丙酮酸转变成乙乙醘辅酶醘辅酶A之反应三种酶及五种辅酶辅酶组合。第11页v一些一些多酶体系多酶体系在进化过程中在进化过程中因为因为基因融合基因融合，各种不一样催，各种不一样催化功效存在于一条多肽链中，化功效存在于一条多肽链中，这类酶称为多功效酶。这类酶称为多功效酶。v由由单肽链单肽链组成，含有组成，含有若干个若干个酶活性酶活性结构域结构域v多功效酶或串联酶多功效酶或串联酶(multifunctional or tandem enzyme)(multifunctional or tandem enzyme)：脂肪酸合酶脂肪酸合酶（Fatty acid synthase）是一个含有各种功效酶系统，在哺乳动物中，其分子量高达272kDa。在脂肪酸合酶中，底物和中间产物分子在各个功效结构域（能够位于同一酶分子，也能够位于不一样酶分子）中传递直到完成脂肪酸整个合成过程。第12页一、一、酶分子组成酶分子组成蛋白质部分：酶蛋白蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)(apoenzyme)辅助因子辅助因子(cofactor)(cofactor)金属离子金属离子小分子有机化合物小分子有机化合物全酶全酶(holoenzyme)(holoenzyme)单纯酶单纯酶(simple enzyme)(simple enzyme)结合酶结合酶(conjugated enzyme)(conjugated enzyme)第13页*各部分在催化反应中作用各部分在催化反应中作用J酶蛋白酶蛋白决定反应决定反应特异性特异性J辅助因子辅助因子决定反应决定反应种类与性质种类与性质金属酶金属酶(metalloenzyme)(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。失。金属激活酶金属激活酶(metal-activated enzyme)(metal-activated enzyme)金属离子为酶活性所必需，但与酶结合不甚金属离子为酶活性所必需，但与酶结合不甚紧密。紧密。【羧基肽酶、黄嘌呤氧化酶】【己糖激酶、肌酸激酶】第14页一些金属酶和金属激活酶一些金属酶和金属激活酶 金属酶金属酶金属离子金属离子 金属激活酶金属激活酶金属离子金属离子 过氧化氢酶过氧化氢酶Fe2+丙酮酸激酶丙酮酸激酶K+、Mg2+过氧化物酶过氧化物酶Fe2+丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶Mn2+、Zn2+谷胱甘肽过氧化谷胱甘肽过氧化物酶物酶Se2+蛋白激酶蛋白激酶Mg2+、Mn2+固氮酶固氮酶Mo2+己糖激酶己糖激酶Mg2+核糖核苷酸还原核糖核苷酸还原酶酶Mn2+磷脂酶磷脂酶CCa2+羧基肽酶羧基肽酶Zn2+细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶Cu2+碳酸酐酶碳酸酐酶Zn2+脲酶脲酶Ni2+碱性磷酸酶碱性磷酸酶Mg2+柠檬酸合酶柠檬酸合酶K+第15页金属离子作用金属离子作用稳定酶构象；稳定酶构象；参加催化反应，传递电子；参加催化反应，传递电子；在酶与底物间起桥梁作用；在酶与底物间起桥梁作用；中和阴离子，降低反应中静电斥力等。中和阴离子，降低反应中静电斥力等。小分子有机化合物作用小分子有机化合物作用在反应中起运载体作用，传递电子、质在反应中起运载体作用，传递电子、质子或其它基团。子或其它基团。第16页小分子有机化合物在催化中作用小分子有机化合物在催化中作用 第17页NADH NADH 可耦合氧化及还原反应可耦合氧化及还原反应可耦合氧化及还原反应可耦合氧化及还原反应第18页辅助因子分类辅助因子分类（按其（按其与酶蛋白结合紧密程度与酶蛋白结合紧密程度）辅酶辅酶(coenzyme):(coenzyme):与酶蛋白结合与酶蛋白结合疏松，可用疏松，可用透析或超滤方透析或超滤方法除去。法除去。辅基辅基(prosthetic group):(prosthetic group):与酶蛋白结合与酶蛋白结合紧密，紧密，不不能用能用透析或超透析或超滤方法除去滤方法除去。第19页辅酶作用辅酶作用1 1参加基团转移参加基团转移参加基团转移参加基团转移:l 氨基氨基-磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛(Vit B6)(Vit B6)l 羧基羧基-生物素生物素(biotin)(biotin)、维生素、维生素K Kl 一碳单位一碳单位-四氢叶酸四氢叶酸(folic acid)(folic acid)l 甲基甲基-维生素维生素B B1212l 酰基酰基-辅酶辅酶A A、硫辛酸、硫辛酸第20页辅酶作用辅酶作用 2质子（氢原子质子（氢原子）转移）转移:l FAD+FADH2l NAD+NADH+H+l NADP+NADPH+H+NAD+是脱氢酶辅酶，如乙醇脱乙醇脱氢酶氢酶（ADH），用于氧化乙醇。它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环及呼吸链呼吸链中发挥着不可替换作用。中间产物会将脱下氢递给NAD，使之成为NADH+H+。而NADH+H+则会作为氢载体，在呼吸链中经过化学渗透偶联方式，合成ATP。第21页或称或称活性部位活性部位(active site)(active site)，指，指必需必需基团在一级结构上可能相距遥远，但在空间基团在一级结构上可能相距遥远，但在空间结构上彼此靠近，组成含有结构上彼此靠近，组成含有特定空间结构区特定空间结构区域域，能，能与底物特异结合与底物特异结合并并将底物转化为产物将底物转化为产物。酶活性中心酶活性中心(active center)(active center)二、酶活性中心二、酶活性中心第22页酶活性中心酶活性中心第23页必需基团必需基团(essential group)(essential group)酶分子中氨基酸残基侧链化酶分子中氨基酸残基侧链化学基团中，一些与酶活性亲学基团中，一些与酶活性亲密相关化学基团。密相关化学基团。有些必需基团即使在一级结构上可能相距很远，但在空间结构上彼此靠近，集中在一起形成含有一定空间结构区域，该区域与底物相结合并将底物转化为产物，这一区域称为酶活性中心(active center)，对于结合酶来说，辅酶或辅基上一部分结构往往是活性中心组成成份。第24页活性中心内必需基团活性中心内必需基团结合基团结合基团(binding group)与底物相结合与底物相结合与底物相结合与底物相结合催化基团催化基团(catalytic group)催化底物转变成产物催化底物转变成产物 位于活性中心以外，维持酶活性中心应有位于活性中心以外，维持酶活性中心应有空间构象所必需。空间构象所必需。活性中心外必需基团活性中心外必需基团第25页底底 物物 活性中心以外活性中心以外必需基团必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 酶活性中心常位于酶蛋白分子表面，为含有较多疏水氨酶活性中心常位于酶蛋白分子表面，为含有较多疏水氨基酸残基，形成基酸残基，形成疏水性疏水性“裂缝裂缝”或或“口袋口袋”，形成了利，形成了利于酶促反应发生疏水环境于酶促反应发生疏水环境第26页n溶菌酶活性中心溶菌酶活性中心溶溶菌菌酶酶活活性性中中心心是是一一裂裂隙隙，能能够够容容纳纳肽肽多多糖糖6个个单单糖糖基基（A，B，C，D，E，F），并并与与之之形形成成氢氢键键和和van derwaals力。力。催催化化基基团团是是35位位Glu，52位位Asp；101位位Asp和和108位位Trp是结合基团。是结合基团。第27页三、同工酶催化相同化学反应三、同工酶催化相同化学反应 同同工工酶酶(isoenzyme)是是指指催催化化相相同同化化学学反反应应，但但酶酶蛋蛋白白分分子子结结构构、理理化化性性质质乃乃至至免疫学性质不一样一组酶。免疫学性质不一样一组酶。n定义定义大多数同工酶因为大多数同工酶因为对底物亲和力不一对底物亲和力不一样和受不一样原因样和受不一样原因调整，常表现不一调整，常表现不一样生理功效，比如样生理功效，比如动物肝脏动物肝脏碱性磷酸碱性磷酸酯酶酯酶和肝脏排泄功和肝脏排泄功效相关，而肠粘膜效相关，而肠粘膜碱性磷酸酯酶却参碱性磷酸酯酶却参加脂肪和钙、磷吸加脂肪和钙、磷吸收。对收。对LDH催化可催化可逆反应，心肌中富逆反应，心肌中富含含LDH1及及LDH2在在体内倾向于催化乳体内倾向于催化乳酸脱氢，而骨骼肌酸脱氢，而骨骼肌中丰富中丰富LDH4及及LDH5则有利于丙则有利于丙酮酸还原而生成乳酮酸还原而生成乳酸。所以酸。所以同工酶只同工酶只是做相同是做相同“工作工作”（即催化同一个（即催化同一个反应），却不一定反应），却不一定有相同功效。有相同功效。第28页依据国际生化学会提议，同工酶是由不一样基因编码多依据国际生化学会提议，同工酶是由不一样基因编码多肽链，或由同一基因转录生成不一样肽链，或由同一基因转录生成不一样mRNAmRNA所翻译不一所翻译不一样多肽链组成蛋白质。样多肽链组成蛋白质。同工酶存在于同一个属或同一个体不一样组织或同一细同工酶存在于同一个属或同一个体不一样组织或同一细胞不一样亚细胞结构中，它使不一样组织、器官和不一胞不一样亚细胞结构中，它使不一样组织、器官和不一样亚细胞结构含有不一样代谢特征。这为同工酶用来诊样亚细胞结构含有不一样代谢特征。这为同工酶用来诊疗不一样器官疾病提供了理论依据。疗不一样器官疾病提供了理论依据。第29页HHHHHHH MHHMMHMMMMMMMLDH1 (H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5 (M4)乳酸脱氢酶同工酶乳酸脱氢酶同工酶n举例举例 1几乎存在于全部组织中。同功酶有五种形式，即LDH1（H4）、LDH-2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH-4（HM3）及LDH-5（M4），可用电泳方法将其分离。LDH同功酶分布有显著组织特异性，所以能够依据其组织特异性来协用诊疗疾病。M:骨骼肌型；H:心肌型第30页LDH同工酶同工酶红细胞红细胞白细胞白细胞血清血清骨骼肌骨骼肌心肌心肌肺肺肾肾肝肝脾脾LDH1（H4）431227.10731443210LDH2（H3M）444934.70243444425LDH3（H2M2）123320.95335121110LDH4（HM3）1611.7160512720LDH5（M4）005.7790120565人体各组织器官人体各组织器官LDHLDH同工酶谱（同工酶谱（活性活性%）第31页检测血清中同工酶改变有主要临床意义检测血清中同工酶改变有主要临床意义 心肌梗死和肝病病人血清心肌梗死和肝病病人血清LDHLDH同工酶谱改变同工酶谱改变1 1酶酶活活性性心肌梗死酶谱心肌梗死酶谱正常酶谱正常酶谱急性肝炎酶谱急性肝炎酶谱2 23 34 45 5脏器特异性第32页n举例举例 2B BB BB BMMMM MM CK1(BB)CK2(MB)CK3(MM)脑脑 心肌心肌 骨骼肌骨骼肌肌酸激酶肌酸激酶(creatine kinase,CK)同工酶同工酶CK2常作为临床早期诊疗心肌梗死一项生化指标常作为临床早期诊疗心肌梗死一项生化指标 M:肌型；B:脑型肌酸激酶（CK），能可逆地催化肌酸和三磷酸腺苷生成磷酸肌酸和二磷酸腺苷反应。在pH中性条件下，逆反应为正反应26倍，即以ATP生成为主，以确保组织细胞供能。而正向反应利于线粒体内氧化磷酸化生成ATP，以磷酸肌酸形式进入细胞液，满足细胞生理活动之需要。第33页第二节第二节酶促反应特点与机理酶促反应特点与机理The Characteristic and Mechanism of Enzyme-Catalyzed Reaction 第34页反应总能量改变反应总能量改变 非催化反应活化能非催化反应活化能 酶促反应酶促反应 活化能活化能 普通催化剂催普通催化剂催化反应活化能化反应活化能 能能量量反反 应应 过过 程程 底物底物 产物产物 酶促反应活化能改变酶促反应活化能改变 活化能：底物分子从初态转变到活化态所需能量。活化能：底物分子从初态转变到活化态所需能量。酶酶可降低所催化反应活化能可降低所催化反应活化能第35页 催化效率高，用量少（细胞中含量低)。加紧反应速度但不改改变学反应平衡点（不改变平衡常数）。降低反应活化能。活化能：在一定温度下，1mol分子全部进入其活化态所需要自由能。反应前后本身结构不变。酶与非生物催化剂共性酶与非生物催化剂共性第36页（一）酶促反应含有高效性（一）酶促反应含有高效性 一、一、酶促反应特点酶促反应特点酶催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比普通催化剂高1071013倍。酶催化不需要较高反应温度。酶和普通催化剂加速反应机理都是降低反应活化能(activation energy)。酶比普通催化剂更有效地降低反应活化能。第37页1双氧水裂解FeCl3Catalase反应速率1,000,000,0001,0002 H2O2 2 H2O+O2PESJuang RH()BCbasics第38页底物底物催化催化剂剂反反应应温度温度（）速率常数速率常数苯苯酰酰胺胺H+522.410-6OH-538.510-6-胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶酶2514.9尿素尿素H+627.410-7脲脲酶酶215.0106H2O2Fe2+5622一些酶与普通催化剂催化效率比较一些酶与普通催化剂催化效率比较 第39页分类：分类：v绝对特异性绝对特异性(absolute specificity)(absolute specificity)：只能只能作用于作用于特定结构底物特定结构底物，进行一个专一反应，进行一个专一反应，生成一个特定结构产物生成一个特定结构产物。v相对特异性相对特异性(relative specificity)(relative specificity)：作用作用于于一类化合物或一个化学键一类化合物或一个化学键。v立体结构特异性立体结构特异性(stereo specificity)stereo specificity)：作作用于用于立体异构体立体异构体中一个。中一个。旋光异构特异性旋光异构特异性几何异构特异性几何异构特异性第41页vv旋光异构特异性：旋光异构特异性：L-L-乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 丙酮酸丙酮酸 L-L-乳酸乳酸 D-D-乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 丙酮酸丙酮酸 D-D-乳酸乳酸第42页 酵母中酶酵母中酶酵母中酶酵母中酶vvD-型葡萄糖型葡萄糖 发酵发酵vv 酵母中酶酵母中酶酵母中酶酵母中酶vvL-型葡萄糖型葡萄糖 发酵发酵vv L-L-精氨酸酶精氨酸酶精氨酸酶精氨酸酶vvL-精氨酸精氨酸 L-鸟氨酸鸟氨酸+尿素尿素vvD-精氨酸精氨酸 第43页立体异构特异性立体异构特异性vv几何异构特异性几何异构特异性 延胡索酸酶延胡索酸酶 反丁烯二酸反丁烯二酸 苹果酸苹果酸 延胡索酸酶延胡索酸酶 顺丁烯二酸顺丁烯二酸 第44页（三）酶促反应可调整性（三）酶促反应可调整性对酶生成与降解量调整对酶生成与降解量调整酶催化效力调整酶催化效力调整经过改变底物浓度对酶进行调整等经过改变底物浓度对酶进行调整等酶促反应受各种原因调控，以适应机体对不酶促反应受各种原因调控，以适应机体对不停改变内外环境和生命活动需要。其中包含三方停改变内外环境和生命活动需要。其中包含三方面调整。面调整。第45页（四）酶含有不稳定性（四）酶含有不稳定性酶化学本质主要是蛋白质。在一些理化原酶化学本质主要是蛋白质。在一些理化原因（如高温、强酸、强碱等）作用下，酶会发因（如高温、强酸、强碱等）作用下，酶会发生变性而失去催化活性。所以，酶促反应往往生变性而失去催化活性。所以，酶促反应往往都是在常温、常压和靠近中性条件下进行。都是在常温、常压和靠近中性条件下进行。第46页二、酶促反应机理二、酶促反应机理（一）酶（一）酶-底物复合物形成与诱导契合假说底物复合物形成与诱导契合假说*诱导契合假说诱导契合假说(induced-fit hypothesis)(induced-fit hypothesis)酶底物复合物酶底物复合物 E+S E+P ESES 酶与底物相互靠近时，其结构相互诱导、酶与底物相互靠近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶程称为酶-底物结合诱导契合假说底物结合诱导契合假说 。酶经过促进底物形成过渡态而提升反应速率酶经过促进底物形成过渡态而提升反应速率酶经过促进底物形成过渡态而提升反应速率酶经过促进底物形成过渡态而提升反应速率诱导契合作用使酶与底物亲密结合诱导契合作用使酶与底物亲密结合第47页第48页羧肽酶诱导契合模式羧肽酶诱导契合模式 底物底物第49页酶与底物结合 抗体与抗原结合 酶能够催化底物转化成产物，而抗体则不具备此功效酶能够催化底物转化成产物，而抗体则不具备此功效第50页（三）与酶高效率催化相关机制：（三）与酶高效率催化相关机制：1.1.邻近效应与定向排列邻近效应与定向排列 2.2.多元催化多元催化：酸碱催化酸碱催化 3.3.表面效应表面效应：预防底物与酶之间形成水化膜：预防底物与酶之间形成水化膜 第51页1.1.趋近效应和定向效应趋近效应和定向效应a 底物在活性中心聚集，局部微环境浓度底物在活性中心聚集，局部微环境浓度 a 催化基团定向催化反应催化基团定向催化反应将分子间反应变成类似于分子内反应，从而提升反应速率将分子间反应变成类似于分子内反应，从而提升反应速率第52页l 接收质子：接收质子：碱碱l 提供质子：提供质子：酸酸2.2.多元催化（多元催化（multielement catalysismultielement catalysis）1）亲核催化作用）亲核催化作用(nucleophilic catalysis)2）亲电催化（）亲电催化（electrophilic catalysis）1.酸酸-碱催化作用（碱催化作用（general acid-base catalysis）2.亲核催化和亲电子催化作用亲核催化和亲电子催化作用 酶活性中心一些基团可作为质子供体或受酶活性中心一些基团可作为质子供体或受体，从而对底物进行酸碱催化体，从而对底物进行酸碱催化酶活性中心亲核基团释出电子攻击过渡态底物上含有部分正电性原子或酶活性中心亲核基团释出电子攻击过渡态底物上含有部分正电性原子或基团，形成瞬间共价键；随即，底物深入水解形成产物和酶。基团，形成瞬间共价键；随即，底物深入水解形成产物和酶。酶活性中心内亲电子基团与富含电子底物形成共价键。酶活性中心内亲电子基团与富含电子底物形成共价键。第53页胰凝乳蛋白酶共价催化和酸胰凝乳蛋白酶共价催化和酸-碱催化机制碱催化机制 第54页l 酶活性中心酶活性中心疏水性疏水性“口袋口袋”l 预防底物与酶之间形成水化膜预防底物与酶之间形成水化膜l 有利底物与酶亲密接触有利底物与酶亲密接触3.3.表面效应表面效应(surface effect)(surface effect)第55页第三节第三节 酶促反应动力学酶促反应动力学Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction 第56页q概念概念研究各种原因对研究各种原因对酶促反应速度酶促反应速度影响，并加影响，并加以定量阐述。以定量阐述。q影响原因包含有影响原因包含有酶浓度、底物浓度、酶浓度、底物浓度、pHpH、温度、温度、抑制剂、激活剂等。抑制剂、激活剂等。研究一个原因影响时，其余各原因均恒定。研究一个原因影响时，其余各原因均恒定。第57页一、底物浓度对反应速度影响一、底物浓度对反应速度影响I.I.单底物、单产物反应单底物、单产物反应II.II.酶酶促促反反应应速速度度普普通通在在要要求求反反应应条条件件下下，用用单单位位时时间间内内底物消耗量底物消耗量和和产物生成量产物生成量来表示来表示III.III.反反应应速速度度取取其其初初速速度度，即即底底物物消消耗耗量量很很小小（普普通通在在55以内）时反应速度以内）时反应速度IV.IV.底物浓度远远大于酶浓度底物浓度远远大于酶浓度研究前提研究前提E+SE+S k k1 1k k2 2k k3 3ESESE+PE+P第58页v 在其它原因不变情况下，底物浓度对反应在其它原因不变情况下，底物浓度对反应速度影响呈速度影响呈矩形双曲线关系矩形双曲线关系。第59页当底物浓度较低时：当底物浓度较低时：反应速率与底物浓度成正比；反应为反应速率与底物浓度成正比；反应为一级反应。一级反应。SSV VV Vmaxmax第60页伴随底物浓度增高：伴随底物浓度增高：反应速率不再成正百分比加速；反应反应速率不再成正百分比加速；反应为混合级反应。为混合级反应。SSV VV Vmaxmax第61页当底物浓度高达一定程度：当底物浓度高达一定程度：反应速率不再增加，达最大速率；反反应速率不再增加，达最大速率；反应为零级反应应为零级反应SSV VV Vmaxmax酶酶 被被 底底 物物 饱饱 和和第62页底物对酶促反应饱和现象：底物对酶促反应饱和现象：第63页（一）米曼氏方程式（一）米曼氏方程式中间产物中间产物 酶促反应模式酶促反应模式中间产物学说中间产物学说E+SE+S k k1 1k k2 2k k3 3ESESE+PE+P揭示单底物反应动力学特征揭示单底物反应动力学特征揭示单底物反应动力学特征揭示单底物反应动力学特征19第64页19Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。SS：底物浓度底物浓度V V：不一样不一样SS时反应速度时反应速度VmaxVmax：最大反应速度最大反应速度(maximum velocity)(maximum velocity)m m：米氏常数米氏常数(Michaelis constant)(Michaelis constant)V VmaxmaxS S K Km m+S +S 第65页1.E与与S形形成成ES复复合合物物反反应应是是快快速速平平衡衡反反应应，而而ES分分解解为为E及及P反反应应为为慢慢反反应应，反反应应速速率率取取决决于慢反应即于慢反应即 V=k3ES。(1)2.S总总浓浓度度远远远远大大于于E总总浓浓度度，所所以以在在反反应应初初始始阶段，阶段，S浓度可认为不变即浓度可认为不变即S=St。米曼氏方程式推导基于两个假设：米曼氏方程式推导基于两个假设：当底物浓度很高，将酶活性中心全部饱和时，即当底物浓度很高，将酶活性中心全部饱和时，即Et=ES，反应达最大反应达最大速率速率 Vmax=k3ES=k3Et (5)第66页n米曼氏方程式推导过程：米曼氏方程式推导过程：ES生成速率生成速率=ES分解速率分解速率k2+k3=Km（米氏常数）（米氏常数）k1令：令：则则(2)(2)变为变为:(EtES)S=Km ES(2)=(EtES)Sk2+k3ES k1整理得：整理得：k1(EtES)S=k2 ES+k3 ES当反应处于稳态时：当反应处于稳态时：E+SE+S k k1 1k k2 2k k3 3ESESE+PE+P第67页当底物浓度很高，将酶活性中心全部饱和时，即当底物浓度很高，将酶活性中心全部饱和时，即Et=ES，反应达最大速率反应达最大速率Vmax=k3ES=k3Et (5)ES=EtSKm+S(3)整理得整理得:将将(5)(5)代入代入(4)(4)得米氏方程式：得米氏方程式：Vmax S Km+S V=将将(3)(3)代入代入(1)(1)得得k3EtS Km+S(4)V=第68页当当当当 V=VV=VV=VV=Vmax max max max/2 2 2 2 时时时时,v K Km m值推导值推导K Km mSS K Km m值等于酶促反应速度为最大反应速度二分值等于酶促反应速度为最大反应速度二分之一时底物浓度，单位是之一时底物浓度，单位是mol/Lmol/L。2 2K Km m+S+S V Vmaxmax V VmaxmaxSSV V V VmaxmaxmaxmaxV V V VSSSSK K K Km m m mV V V Vmaxmaxmaxmax/2 /2 /2 /2 V VmaxmaxS S K Km m+S +S 第69页（二）（二）K Km m与与V Vmaxmax意义意义 K Km m值值 K Km m等于酶促反应速度为最大反应速度二分之一时底物等于酶促反应速度为最大反应速度二分之一时底物浓度。浓度。意义：意义：a)a)K Km m是酶特征性常数之一；是酶特征性常数之一；Km Km 只与酶性质相关只与酶性质相关,与酶浓度无关与酶浓度无关b)b)K Km m可近似表示酶对底物亲和力可近似表示酶对底物亲和力（反比）（反比）c)c)同一酶对于不一样底物有不一样同一酶对于不一样底物有不一样KmKm值。值。确定最适当底物或天然底物确定最适当底物或天然底物第70页 酶酶 底物底物 Km（mol/L）己糖激酶（脑）己糖激酶（脑）ATP4 10 4D-葡萄糖葡萄糖5 10 5D-果糖果糖1.5 10 3碳酸酐酶碳酸酐酶HCO3 2.6 10 2胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶甘氨酰酪氨酰甘氨酸甘氨酰酪氨酰甘氨酸1.08 10 1N-苯甲酰酪氨酰胺苯甲酰酪氨酰胺2.5 10 3-半乳糖苷酶半乳糖苷酶D-乳糖乳糖4.0 10 3过氧化氢酶过氧化氢酶H2O22.5 10 2溶菌酶溶菌酶己己-N-乙酰氨基葡糖乙酰氨基葡糖6.0 10 3一些酶对其底物一些酶对其底物Km 第71页vKmKm最小底物大多数是此酶天然底物最小底物大多数是此酶天然底物 如：己糖激酶对葡萄糖如：己糖激酶对葡萄糖Km 1.5mmol/LKm 1.5mmol/L 对果糖对果糖Km 28mmol/LKm 28mmol/L 所以葡萄糖为最适底物所以葡萄糖为最适底物v一个酶对每一个底物都各有一个特定一个酶对每一个底物都各有一个特定KmKm第72页 V Vmaxmax定义：定义：V Vm m是酶完全被底物饱和时反应速度，与酶是酶完全被底物饱和时反应速度，与酶浓度成正比。浓度成正比。意义：意义：V Vmaxmax=K=K3 3 EE假如酶总浓度已知，可从假如酶总浓度已知，可从V Vmaxmax计算计算 酶转换酶转换数数(turnover number)(turnover number)，即动力学常数，即动力学常数K K3 3。第73页酶转换数酶转换数当酶被底物完全饱和时（当酶被底物完全饱和时（Vmax），单位），单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变成产物分子数称为酶转换数（变成产物分子数称为酶转换数（turnover number），单位是），单位是s-1。酶转换数酶转换数可用来表示酶催化效率可用来表示酶催化效率第74页（三）（三）m m值与值与maxmax值测定值测定1.双倒数作图法双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为，又称为 林林-贝氏贝氏(Lineweaver-Burk)作图法作图法 V VmaxmaxS S K Kmm+S+SV=V=（林贝氏方程）（林贝氏方程）+1/V=1/V=K KmmV Vmax max 1/V1/Vmax max 1/S 1/S 两边同取倒数两边同取倒数两边同取倒数两边同取倒数-1/Km 1/V 1/Vmax max 1/S1/S1/V1/V第75页2.Hanes2.Hanes作图法作图法在林贝氏方程基础上，两边同乘在林贝氏方程基础上，两边同乘在林贝氏方程基础上，两边同乘在林贝氏方程基础上，两边同乘SSS/V=S/V=K Kmm/V/Vmax max+S/V+S/Vmax max S S S/V S/V -Km K Kmm/V/Vm m 1/V1/Vmax max 第76页二、酶浓度对反应速度影响二、酶浓度对反应速度影响当当SSEE，酶酶可可被被底底物物饱饱和和情情况况下下，反反应应速度与酶浓度速度与酶浓度成正比成正比。关系式为：关系式为：V=KV=K3 3 E E0 V V EE 当当SESE时，时，V Vmax max=k=k3 3 E E 酶浓度对反应速度影响酶浓度对反应速度影响 第77页q 双重影响双重影响温温度度升升高高，酶酶促促反反应应速速度度升升高高；温温度度升升高高1010o oC,C,反反应应速速度增加一倍度增加一倍因因为为酶酶本本质质是是蛋蛋白白质质，温温度度升升高高，可可引引发发酶酶变变性性，从从而而反应速度反应速度降低降低 。三、温度对反应速度影响三、温度对反应速度影响酶酶活活性性0.50.51.01.02.02.01.51.50 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 温度温度 C C 温度对淀粉酶活性影响温度对淀粉酶活性影响 第78页q 最适温度最适温度 (optimum temperature)：酶促反应速度最快时环境温度。酶促反应速度最快时环境温度。温血动物：温血动物：35354040Taq DNATaq DNA聚合酶：聚合酶：707075 75 可耐受可耐受100100高温高温此酶是从水生栖热菌此酶是从水生栖热菌 Thermus Thermus AquaticusAquaticus（TaqTaq）中分离出热稳定性）中分离出热稳定性DNADNA聚合酶，聚合酶，用于用于PCRPCR反应。反应。第79页低温作用低温作用:贮存生物制品、菌种等贮存生物制品、菌种等 v低低温温时时因因为为活活化化分分子子数数目目降降低低，反反应应速速度度降降低低，但温度升高后，但温度升高后，酶活性又可恢复酶活性又可恢复。临床上低温麻醉临床上低温麻醉v降降低低组组织织细细胞胞代代谢谢程程度度，使使机机体体耐耐受受手手术术时时氧氧和营养物质缺乏和营养物质缺乏 第80页四、四、pH pH对反应速度影响对反应速度影响vv解离状态：解离状态：解离状态：解离状态：蛋白质极性基团蛋白质极性基团 辅助因子荷电状态辅助因子荷电状态 底物解离状态底物解离状态 而不一样解离状态或直接影响酶与底物而不一样解离状态或直接影响酶与底物结合结合,或影响酶空间结构或影响酶空间结构,从而改变酶活力从而改变酶活力第81页q 最适最适pH pH (optimum pH)(optimum pH)：酶催化活性最大酶催化活性最大时环境时环境pHpH。多数酶：多数酶：7.07.0左右左右胃蛋白酶：胃蛋白酶：1.81.8肝精氨酸酶：肝精氨酸酶：9.89.80 0酶酶活活性性 pH pH pH对一些酶活性影响对一些酶活性影响 胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶 淀粉酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶 胆碱酯酶胆碱酯酶胆碱酯酶胆碱酯酶 2 24 46 68 81010 选择适当缓冲液保持酶相对稳定和保持高活选择适当缓冲液保持酶相对稳定和保持高活选择适当缓冲液保持酶相对稳定和保持高活选择适当缓冲液保持酶相对稳定和保持高活性性性性第82页五、抑制剂对反应速度影响五、抑制剂对反应速度影响酶抑制剂酶抑制剂(inhibitor)(inhibitor)凡能使酶催化活性下降而不引发酶蛋白变凡能使酶催化活性下降而不引发酶蛋白变性物质称为酶抑制剂。性物质称为酶抑制剂。区分于酶变性区分于酶变性 抑制剂对酶有一定选择性抑制剂对酶有一定选择性 引发变性原因对酶没有选择性引发变性原因对酶没有选择性第83页 抑制作用类型抑制作用类型不可逆性抑制不可逆性抑制(irreversible inhibitionirreversible inhibition)可逆性抑制可逆性抑制(reversible inhibitionreversible inhibition)：v竞争性抑制竞争性抑制(competitive inhibition)(competitive inhibition)v非竞争性抑制非竞争性抑制(non-competitive (non-competitive inhibition)inhibition)v反竞争性抑制反竞争性抑制(uncompetitive inhibition)(uncompetitive inhibition)第84页(一一)不可逆性抑制作用不可逆性抑制作用*概念概念抑抑制制剂剂通通常常以以共共共共价价价价键键键键与与酶酶活活性性中中心心必必需需基基团团相结合，使酶失活。相结合，使酶失活。*举例举例有机磷化合物有机磷化合物 羟基酶羟基酶解毒解毒-解磷定解磷定(PAM)(PAM)重金属离子及砷化合物重金属离子及砷化合物 巯基酶巯基酶解毒解毒-二巯基丙醇二巯基丙醇(BAL)(BAL)这类抑制剂不能用透析、超滤等方法给予去除