生物化学检验常用技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第三章第三章 生物化学检验惯用技术生物化学检验惯用技术光光谱谱分分析析技技电电化化学学分分析析技技术术干干化化学学分分析析技技术术电电泳泳分分析析技技术术基基因因扩扩增增技技术术第1页第一节第一节 光谱分析技术光谱分析技术吸收光谱分析技术吸收光谱分析技术发射光谱分析技术发射光谱分析技术散射光谱分析技术散射光谱分析技术第2页一、吸收光谱分析法一、吸收光谱分析法第3页40.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示器显示器钨灯、卤钨灯 3501000氢灯、氘灯 180360滤光片棱镜光栅玻璃比色皿石英比色皿第4页5(一一)、分光光度技术基本原理分光光度技术基本原理1 1、吸光度、吸光度与透光度与透光度 A A=-lgT=-lgI/I=-lgT=-lgI/I0 0=lgI=lgI0 0/I/I 当光线经过均匀、透明溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，当光线经过均匀、透明溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部一部分光分光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I I0 0，透射光强度为透射光强度为I I，I I和和I I0 0之比称为透光度之比称为透光度，即：即：T=I/IT=I/I0 0 T100%T100%为为T%T%称为百分透光度。透光度负对数称为称为百分透光度。透光度负对数称为吸光度吸光度即：即：入射光入射光 I I0 0透射光透射光 I I第5页62 2、Lambert-BeerLambert-Beer定律定律Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系基本定律，该定律是分光分析理论基础分光分析理论基础。A=KLCA A 为为吸光度吸光度；K K 为为百分比常数，称为吸光系百分比常数，称为吸光系数数；L L 为溶液层为溶液层厚度，称为光径厚度，称为光径；C C 为为溶液浓度溶液浓度 Lambert-BeerLambert-Beer定律适合用于定律适合用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射可见光、紫外光、红外光和均匀非散射液体液体当一束平行当一束平行单色光色光经过均匀非散射均匀非散射样品品时，吸光度与溶液，吸光度与溶液层厚厚度和溶液度和溶液浓度成正比。度成正比。L L第6页第7页Lambert-Beer定律定律适合用于适合用于:可见光可见光、紫外光、红外光和均匀非散射、紫外光、红外光和均匀非散射液体以及分散均匀固态或气态样品液体以及分散均匀固态或气态样品.单色光单色光 均匀介质均匀介质吸收物质无相吸收物质无相互作用互作用3 3、Lambert-BeerLambert-Beer定律应用条件定律应用条件4 4、Lambert-BeerLambert-Beer定律偏离现象定律偏离现象溶液：稀溶液、化学改变溶液：稀溶液、化学改变光学光学;非单色光、散射和折射非单色光、散射和折射仪器仪器;光源、试验条件光源、试验条件第8页 在分光光度法中，为消除显色剂及样品中各种共存有色物质产生干扰、抵消比色皿和试剂对入射光影响而用来调整仪器百分透光率为100%溶液。5 5、空白溶液选择、空白溶液选择 蒸馏水 试剂样品不含待测元素 不显色1、溶剂空白溶剂空白：不加样品和任何试剂，用纯溶剂（如蒸馏水或其它有机溶剂）作参比溶液。选择标准：当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其它有色离子时，选取溶剂参比。2、试剂空白试剂空白：用不加样品，而显色剂和其它试剂都相同溶液作参比溶液。选择标准：当显色剂本身有颜色或其它试剂有颜色，被测试样中又无其它有色离子时，选取试剂参比。3、样品空白样品空白：用不加显色剂样品溶液作参比溶液。选择标准：当试样溶液有颜色，而试剂、显色剂均无颜色时，选取样品空白。4、平行操作空白：按样品分析完全相同操作步骤，用不含待测元素样品进行平行操作，以消除操作过程中引入干扰杂质所带来误差。选择标准：当操作过程中因为试剂、器皿、水和气等原因引入了一定量被测试样组分干扰离子5、不显色空白：可将一份试样加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂 和其它试剂均按照操作手续加入，以此作为参比溶液，这么能够消除显色剂和一些共存组分干扰。选择标准：当显色剂和被测试样都有颜色时，可选取此法。第9页(二二)、分光光度法在生化检验中应用、分光光度法在生化检验中应用灵敏度高、操作简便、应用广泛1、对未知化合物进行定性分析、对未知化合物进行定性分析2、对待测物质进行定量测定、对待测物质进行定量测定定性依据：最大吸收波长最大吸收波长maxmax和摩尔吸光系数和摩尔吸光系数 标准曲线法和比较法第10页11(1).标准曲线法标准曲线法 依据依据Lambert-BeerLambert-Beer定律，液体浓度在一定范围内与定律，液体浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度标准品溶液（浓度吸光度成正比关系。配制一系列浓度标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标标，以吸光度为纵座标，将，将对应各点连成一条经过原点对应各点连成一条经过原点直线，这条直线称为直线，这条直线称为标准曲线标准曲线。待测溶液测定吸光度后，。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其对应浓度。从标准曲线上可查出其对应浓度。u方法：第11页5.标准溶液设置浓度范围足够大。标准溶液设置浓度范围足够大。第12页132 2比较法比较法 C CR R=(A=(AR R CCs s)/A)/As s 己己知浓度标准品和标本作一样处理，使用相同空白知浓度标准品和标本作一样处理，使用相同空白，同时，同时测定标测定标准管和标本吸光度，依据测定吸光度及准管和标本吸光度，依据测定吸光度及标准品标准品浓度，可直接计算出标浓度，可直接计算出标本浓度，计算公式为：本浓度，计算公式为：第13页二、发射光谱分析法二、发射光谱分析法 处于激发态待测元素，原子回到基态时以辐射形式释放出能量，由此而产生光谱称为发射光谱，对元素进行定性与定量分析方法。发射光谱是指样品本身产生光谱被检测器接收；吸收光谱是光源发射光谱被样品吸收了一部分，剩下那部分光谱被检测器接收。火焰光度法荧光光度法第14页火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测元素所发射辐射强度来进行定量分析方法。元素所发射辐射强度来进行定量分析方法。它是一个简化发射光谱分析法它是一个简化发射光谱分析法（一）、火焰光度法（一）、火焰光度法FP640火焰光度计火焰光度法分析示意图第15页火焰火焰光度法特点光度法特点应用范围窄灵敏快速准确设备简单试样溶液于数分钟内可完成测定火焰光源稳定性高，干扰少，误差为25，可用于微量分析和常量分析分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达0110106 g被测试样易被火焰激发，产生谱线较简单，且均在可见光区，故使谱线分离和测量设备简单主要用于碱金属和部分碱土金属测定第16页1、激发条件影响火焰光度分析原因影响火焰光度分析原因2、试样种类和组成3、试液中共存离子对测定有影响4、仪器质量火焰温度要适当，温度过低灵敏度下降，温度太高则碱金属电离严重，影响测量线性关系。第17页（二）、荧光分光光度法（二）、荧光分光光度法化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩能量能够电磁辐射形式放射（即发光）。利用物质吸收较短波长光能后发射较长波长特征光谱性质，对物质定性或定量分析方法。荧光定义：一些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长光。荧光产生原理：荧光分光光度法分析测定蛋白质、核酸、维生素等;对一些激素及其代谢产物测定;当化合物含量太少,普通分析方法灵敏度不够时,使用荧光分析技术就能处理测定问题。第18页三、散射光谱分析法三、散射光谱分析法透射比浊与散射比浊是免疫比浊常见两种方法，其反应原理一样，只是检测光信号与仪器检测器有区分。1、透射比浊操作简便，适合用于普通自动生化分析仪和普通分光光度计，几乎全部试验室均能开展。不足是灵敏度和精密度均不够理想，所需抗血清量大，检测周期较长。2、散射比浊优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定分析仪器，试剂价格高。光散射用单色光照射透明溶液时，大部分按原来方向透射，而一小部分则按不一样角度散射开来。散射光谱分析法利用悬浮颗粒混浊液散射光强度或对入射光减弱原理进行定量分析方法。第19页第二节第二节 电化学分析技电化学分析技术术第20页一、电位分析法一、电位分析法 ISE利用电极电位与浓度关系测定物质含量电化学分析方法。利用电极电位与浓度关系测定物质含量电化学分析方法。电位分析法位分析法一类用特殊敏感膜制成，对溶液中某种特定离子有选择性响应电化学传感器离子离子选择电极极 ISE电解质溶液中参加电化学反应离子有效浓度第21页第22页 离子选择性电极类型和品种很多，外形也差异很大；但基本结构都包含：对特定离子有选择性响应薄膜(敏感膜或传感膜)、内参比溶液与内参比电极。敏感膜将内侧参比溶液与外侧待测离子溶液分开，是电极关键部位。ISE基本基本结构结构内参比电极内参比电极电极壳体电极壳体内参比溶液内参比溶液敏感膜敏感膜离子选择性电极离子选择性电极结构示意图结构示意图第23页电极电位电极电位第24页电极电位测量电极电位测量在在电位分析中，位分析中，组成成电池两池两个个电极，其中一个，其极，其中一个，其电位位值随待随待测离子离子浓(活活)度改度改变而改而改变，能指示待，能指示待测离子离子浓(活活)度，称度，称为指示指示电极极，或，或离子离子选择性性电极极。指示电极指示电极而另一个而另一个电极，其极，其电位不受位不受试液液组成改成改变影影响，含有响，含有较恒定数恒定数值，只是作只是作为测量量电位位标准，准，称称为参比参比电极极(参考参考电极极)。参比电极参比电极离子离子选择性性电极：极：电位法位法测定溶液中某种定离子活度指示定溶液中某种定离子活度指示电极；能极；能在各种离子存在混合液中，在各种离子存在混合液中，选择性地响性地响应该特定离子，指示出特定离子，指示出这种种离子活度改离子活度改变情况，情况，测定离子活度或定离子活度或浓度。度。第25页 选择性好选择性好 在多数情况下，共存离子干扰小，对组成复杂试样往往在多数情况下，共存离子干扰小，对组成复杂试样往往不需要分离处理就可直接测定。不需要分离处理就可直接测定。灵敏度高灵敏度高 电位法检出限为电位法检出限为1010-5-51010-8-8 mol/Lmol/L，适于微量组分，适于微量组分测定，电位滴定法适于常量分析。测定，电位滴定法适于常量分析。快速快速 仪器设备简单、操作方便、分析快速、测定范围宽、不破坏仪器设备简单、操作方便、分析快速、测定范围宽、不破坏试液，易于实现分析自动化。试液，易于实现分析自动化。缺点缺点 需要有专用离子选择性电极。需要有专用离子选择性电极。电位电位分析法特点：分析法特点：第26页3、离子选择性电极分类和主要类型依据国际纯粹及应用化学联合会（IUPAC）提议，离子选择性电极普通采取以下分类：依据国际纯粹及应用化学联合会依据国际纯粹及应用化学联合会(IUPAC)提议，离子选择提议，离子选择性电极普通采取以下分类：性电极普通采取以下分类：惯用离子选择电极惯用离子选择电极第27页玻璃膜电极玻璃膜电极第28页气敏电极气敏电极如如，二二氧氧化化碳碳气气敏敏电极极：微微孔孔气气体体渗渗透透膜膜憎憎水水但但能能透透气气(由由醋醋酸酸纤维、聚聚四四氟氟乙乙烯、聚聚偏偏氟氟乙乙烯等等材材料料制制成成)。测定定时，CO2气气体体经过微微孔孔渗渗透透膜膜与与中中介介溶溶液液接接触触(中中介介液液是是0.001mol/LNaHCO3)；因因为CO2与与H2O结合合生生成成碳碳酸酸，从而影响到碳酸从而影响到碳酸氢钠电离平衡。离平衡。气气敏敏电极极经过界界面面发生生化化学学反反应进行行工工作作，离离子子电极极用用来来指指示示中中介介液液中中某某一一离离子子活活度度改改变。溶溶解解在在水水溶溶液液中中气气体体，只只要要能能生生成成可可用用离离子子选择性性电极极检出出离子，均可用气敏离子，均可用气敏电极极测定。定。用用pH玻璃电极间接测定玻璃电极间接测定CO2含量含量 气敏电极是一个气体传感器，测定溶液中气体含量。气敏电极是一个气体传感器，测定溶液中气体含量。原理：利用待原理：利用待测气体气体对某一化学平衡影响，使平衡中某特定离某一化学平衡影响，使平衡中某特定离子活度子活度发生改生改变，来，来测定定试液中被液中被测气体分气体分压(含量含量)。在气敏在气敏电极中介溶液中放入玻璃极中介溶液中放入玻璃电极。极。测量量时，控制，控制试液酸碱度，液酸碱度，使使CO2经过气透膜气透膜扩散加入气敏散加入气敏电极；引极；引发中介溶液中介溶液pH改改变。测定中介溶液定中介溶液pH值，即可，即可计算出算出试液中液中CO2浓度。度。第29页第30页 CO2+H2O=HCO3-+H+NH3+H2O=NH4+OH-SO2+H2O=HSO3-+H+2NO2+H2O=NO3-+NO2-+H+H2S+H2O=HS-+H3O+HCN+H2O=H3O+CN-HF+H2O=H3O+F-凡凡是是溶溶于于水水释放放H+反反应，都都能能够用用pH玻玻璃璃电极极检出出；而而后三种分后三种分别能能够用用S2-、CN-、F-等离子等离子选择性性电极来极来检测。可用电极测定气体可用电极测定气体第31页 酶酶催催化化反反应应专专一一强强；酶酶电电极极有有极极高高选选择择性性。作作为为一一个个生生物物传传感感器器，酶酶电电极极尤尤其其适适合合用用于于生生物医学、生物化学等领域。物医学、生物化学等领域。酶电极酶电极 选择适合选择适合指示电极指示电极 制成含有催化活性水不溶性制成含有催化活性水不溶性酶膜酶膜 把酶膜固定在电极表面把酶膜固定在电极表面(酶固定化酶固定化)酶电极制作极制作过程程将生物将生物酶涂布在离子涂布在离子选择性性电极或其它极或其它传感器敏感膜上，感器敏感膜上，经过酶催化作用，催化作用，使待使待测物物质产生能在生能在该电极上响极上响应离子或化合物，离子或化合物，间接接测定定该物物质。脲酶催化分解尿素催化分解尿素产生生NH3、CO2，溶于水可得到不一溶于水可得到不一样产物物NH3、CO2、NH4+、HCO3-等，可用等，可用对应离子离子选择性性电极来极来检测它它们，间接得到尿素接得到尿素含量。含量。惯用固定化技术有：吸附、试剂交联、共价键合、包埋法(酶与载体聚丙酰胺混合后直接包在电极敏感部分形成酶凝胶层)。第32页几个酶电极品种与性能几个酶电极品种与性能测定物质酶检测物测定范围(mol/L)葡萄糖葡萄糖氧化酶O210-42*10-2尿素(脲)脲酶NH310-510-2胆固醇胆固醇氧化酶H2O210-510-2L谷氨酸谷氨酸脱氢酶NH4+10-410-1L赖氨酸赖氨酸脱羧酶CO210-410-1第33页 标准曲线法标准曲线法 标准比较法标准比较法 标准加入法标准加入法 离子选择性离子选择性电极电极分析方法分析方法1 1、直接法：、直接法：2 2、间接法：接法：样品不经稀释，直接由电极测量离子活度。样品经缓冲溶液稀释后由电极测量离子活度。用测定离子纯物质配制一系列已知活度或浓度标准溶液，用离子计测定，绘用测定离子纯物质配制一系列已知活度或浓度标准溶液，用离子计测定，绘制电极电位与活度对数关系曲线；然后在相同条件下测定样品，由标准曲线制电极电位与活度对数关系曲线；然后在相同条件下测定样品，由标准曲线查得浓度。查得浓度。将已知小体积标准溶液，加入已知较大致积待测液中，依据加入前后电位值将已知小体积标准溶液，加入已知较大致积待测液中，依据加入前后电位值改变，求得待测液中被测离子得浓度。改变，求得待测液中被测离子得浓度。第34页二、电导分析法二、电导分析法电导分析法分析法在外电场作用下，以电解质溶液中正负离子迁移为基础电化学分析法。什麽是电导？衡量电解液导电能力量度值这里所说电导是指电解质溶液中正、负离子在外电场作用下迁移而产生电流传导导电能力与溶液中正负离子数目、离子所带电荷量、离子在溶液中迁移速率等原因相关利用电解质溶液电导值来确定物质含量分析方法利用溶液电导与溶液中离子数目标相关性建立分析方法第35页第三节第三节 干化学分析技干化学分析技术术 将液体检测样品直接加到含有试剂固相载体上发生反应，依照反应结果定量测定样品中特定成份浓度或活动一项技术。干化学分析技术是以酶法为基础一类分析方法，又有干试剂化学或固相化学之称。干化学分析第36页一、干化学分析技术基本原理一、干化学分析技术基本原理依据多层膜测定方法不一样，可将多层膜分为3种类型：反射光度法差示电位法荧光反射光度法荧光技术竞争免疫技术第37页反射光度法反射光度法第38页 漫反射光是指从光源发出光进漫反射光是指从光源发出光进入样品内部，经入样品内部，经 过屡次反射、过屡次反射、折射、散射及吸收后返回样品表折射、散射及吸收后返回样品表面光面光 朗伯定律描述入射光和吸收光之间关系朗伯定律描述入射光和吸收光之间关系KubelkaMunk 理论理论描述一束单描述一束单色光入射到一个既能吸收光，又色光入射到一个既能吸收光，又能反射光物体上光学关系。能反射光物体上光学关系。第39页差示差示电位法位法第40页二、干化学分析技术在临床检验中应用二、干化学分析技术在临床检验中应用反射光度法系统胶片涂层技术袋式分析仪第41页第42页仪器检测:三、干化学分析技术影响原因三、干化学分析技术影响原因 反射光度计 标准灰色试剂条 离子选择电极干式化学分析仪 标准条校准频度:质控物:干片试剂储存与使用:温度和湿度:第43页第三节第三节 电泳分析技术电泳分析技术正极正极负极负极带负电粒子带负电粒子带正电粒子带正电粒子带电荷溶质或粒子带电荷溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反电极移动现象在电场中向着与其本身所带电荷相反电极移动现象 电泳：电泳：电泳技术电泳技术:利用电泳现象将利用电泳现象将多组分样品分离、分析多组分样品分离、分析技术技术电泳仪电泳仪:能够实现电泳分离技术仪器能够实现电泳分离技术仪器第44页一、电泳分析技术基本原理一、电泳分析技术基本原理溶液中粒子带电状态溶液中粒子带电状态两性电离及两性电解质两性电离及两性电解质:等电点时蛋白质分子在电场中不会移动。等电点时蛋白质分子在电场中不会移动。溶液溶液pHpH值离等电点越远，颗粒所带电荷越多，电泳速度也越快。值离等电点越远，颗粒所带电荷越多，电泳速度也越快。等电点等电点pI:pI:某一溶液中粒子所带正、负电荷相等，即净电荷为零时溶液某一溶液中粒子所带正、负电荷相等，即净电荷为零时溶液pH值。值。第45页电泳迁移率电泳迁移率影响电泳原因影响电泳原因1 1、分子形状和性质、分子形状和性质2 2、电场强度、电场强度电场强度大，速度快，产热多，变性；电场强度大，速度快，产热多，变性；电场强度小，速度慢，产热少，区带含糊电场强度小，速度慢，产热少，区带含糊第46页473、电泳缓冲溶液、电泳缓冲溶液维持电泳介质维持电泳介质pHpH恒定恒定,并起导电作用并起导电作用第47页 溶液酸碱度决定被分离物质解离程度和带电性质及所带净电荷量。pH与pI差值越大，粒子带电量越多。缓冲溶液不能过酸过碱，缓冲溶液不能过酸过碱，以免使蛋白质发生变性，以免使蛋白质发生变性，pHpH普通普通4.5-9.04.5-9.0为宜。为宜。第48页缓冲溶液离子强度影响缓冲容量、电泳速度和产热效应兼顾上述效应将缓冲溶液离子强度设置在一个适当范围，普通设在0.050.1mol/L为宜第49页4、支持介质、支持介质纸吸附作用最大，醋酸纤维素膜吸附作用较小。吸附作用和电渗作用吸附作用和电渗作用5、蒸发、蒸发第50页二、惯用电泳技术及应用二、惯用电泳技术及应用按电泳方式分类按电泳方式分类1.移动界面电泳2.区带电泳3.稳态电泳带电分子移动速率经过观察界面移动来测定带电荷分子在含有渗透能力介质上迁移分子颗粒电泳迁移在一定时间后到达稳态第51页按电泳支持物分类按电泳支持物分类第52页第53页(五五)等电聚焦电泳等电聚焦电泳 (IEF)第54页第五节第五节 基因扩增技术基因扩增技术 在在体外将微量目标基因片段大量扩增，以得到足量体外将微量目标基因片段大量扩增，以得到足量DNADNA供研究分析和检测判定用技术供研究分析和检测判定用技术聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction（PCRPCR）第55页一、一、PCR反应基本原理反应基本原理第56页l含含Mg2+缓冲液缓冲液ldNTPsl耐热耐热DNA聚合酶聚合酶lTag DNA聚合酶聚合酶l特异性引物特异性引物l一对分别与待扩增一对分别与待扩增DNA序列两端互序列两端互补寡核苷酸片段。补寡核苷酸片段。l模板模板DNAPCR反应体系反应体系第57页PCR基本反应步骤基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C循环循环2530次次使模板使模板DNA完全变性成单链。完全变性成单链。同时引物本身和引物之间存在同时引物本身和引物之间存在局部双链得以消除局部双链得以消除使引物和模板使引物和模板DNA退火结合退火结合此温度下此温度下DNA聚聚合酶以合酶以dNTP 为为底物催化底物催化DNA链链延长延长三个步骤为一个循环，三个步骤为一个循环，每次循环产物作为下一每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环轮模板进入下一轮循环第58页第一轮循环5/3/3/5/5/5/5/5/引物引物A引物引物B变性（变性（95）6075859590807065555045403530退火（退火（60）延伸（延伸（72）DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol温度温度第59页第二轮循环5/5/5/3/3/5/5/5/引物引物A引物引物B6075859590807065555045403530变性（变性（95）退火（退火（60）延伸（延伸（72）5/5/5/5/温度温度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol第60页第三次循环5/5/5/5/5/5/5/60758595908070655550454035305/变性（变性（95）退火（退火（60）延伸（延伸（72）温度温度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol第61页基因组基因组DNADNA样品样品第一次循环第一次循环第二次循环第二次循环第三次循环第三次循环第四次循环第四次循环待扩增序列待扩增序列引物引物A引物引物B3/5/3/5/5/3/5/3/第62页一个新核酸微量分析技术。一个新核酸微量分析技术。尤其在定量尤其在定量RT-PCR中含有主要价值。中含有主要价值。实现了实现了PCR技术从定性到定量飞跃。技术从定性到定量飞跃。p实时实时PCRPCR基本原理是：基本原理是：引入荧光标识分子，引入荧光标识分子，使使PCRPCR反应中产生荧光信号与反应中产生荧光信号与PCRPCR产物量成正比，产物量成正比，对每一个反应时刻荧光信号实时分析能够计算对每一个反应时刻荧光信号实时分析能够计算PCRPCR产物量。产物量。依据动态改变数据能够准确计算样品中原有模板含量。依据动态改变数据能够准确计算样品中原有模板含量。荧光定量荧光定量PCR技术技术第63页实时实时PCRPCR技术原理示意图技术原理示意图没有扩增反应时探针保持完整，没有扩增反应时探针保持完整，荧光汇报分子和荧光淬灭分子同时存在于探针上，荧光汇报分子和荧光淬灭分子同时存在于探针上，无荧光信号释放。无荧光信号释放。上游引物上游引物上游引物上游引物下游引物下游引物下游引物下游引物荧光探针引物荧光探针引物RQQRQRQ传统传统PCR实时PCR系统增加了特殊引物作为探针3端荧光淬灭分子端荧光淬灭分子（Quencher，Q）5端荧光汇报分子端荧光汇报分子（Reporter，R）QRRQPCR进行时，进行时，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中碰到聚合酶在链延伸过程中碰到与模板结合着荧光探针，与模板结合着荧光探针，其其5 3核酸外切酶逐步切断荧光探针探针，核酸外切酶逐步切断荧光探针探针，荧光汇报分子和荧光淬灭分子分离产生荧光信号。荧光汇报分子和荧光淬灭分子分离产生荧光信号。荧光信号被检测系统接收用于数据分析。荧光信号被检测系统接收用于数据分析。R第64页荧光定量PCR临床应用肝炎、禽流感、结核等肝炎、禽流感、结核等传染病传染病诊疗；诊疗；性别发育异常；、珠蛋白生成障碍性贫血、胎儿畸形等性别发育异常；、珠蛋白生成障碍性贫血、胎儿畸形等优生优育优生优育检测；检测；肿瘤标识物及癌基因检测与诊疗。肿瘤标识物及癌基因检测与诊疗。第65页谢谢谢谢第66页