生物样品分析方法的基本要求省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx
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1、 第四节 生物样品分析方法基本要求 在测定生物样品中药品及其代谢物时,普通要在测定前进行样品前处理,即进行分离、纯化、浓集。第1页一、惯用具种种类、采集和贮藏 生物样品包含各种体液和组织,惯用是血液(血浆、血清、全血)、尿液、唾液。第2页(一)血样 血浆(plasma)和血清(serum)是最惯用生物样品。测定血中药品浓度通常是指测定血浆或血清中药品浓度,而不是指含有血细胞全血中药品浓度。普通认为,当药品在体内到达稳定状态时,血浆中药品浓度与药品在作用点浓度紧密相关,即血浆中药品浓度反应了药品在体内(靶器官)情况,因而血浆浓度可作为作用部位药品浓度可靠指标。第3页 1.取样:供测定血样应能代表
2、整个血药浓度,因而应待药品在血液中分布均匀后取样。动物试验时,可直接从动脉或心脏取血。对于病人,通常采取静脉血,有时依据血药浓度和分析方法灵敏度。也可用毛细管采血。第4页 2.制备:血浆制备 将采取血液置含有抗凝剂(如:肝素、草酸盐等)试管中,混合后,离心,分离血细胞,上清液即为血浆。肝素是一个含硫酸盐粘多糖,惯用其钠盐、钾盐,它能阻止凝血酶原转化为凝血酶,从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白。普通lml全血需加0.10.2mg肝素,加入血样后马上轻轻旋摇,但勿太猛烈,以免造成血细胞破裂。第5页 血清制备 血清是由血液中纤维蛋白原等影响下,引发血液凝结而析出澄清黄色液体,经离心其量约为全血量30一5
3、0。在室温高时,血凝过程进行得很快,宜在血凝后半小时内分离血清。当室温低时,血凝过程较慢,可将血液置37温度下加速血清析出。血浆及血清中药品浓度测定值通常是相同。第6页 全血也应加入抗凝剂混匀,预防凝血。对大多数药品来说血浆浓度与红细胞中浓度成正比,所以测定全血也不能提供更多数据。因为全血净化较血浆和血清麻烦,尤其是溶血后,血色素等可能会给测定带来影响。第7页3.特点:血样采取量受到限制、间隔时间,采集方法:普通取1ml2m1。用注射器、毛细管或微量采血管采取。血样采血时间间隔应随测定目标不一样而异。采取血样后,应及时分离血浆或血清,并马上进行分析。如不能马上测定时,应完全密塞后保留,短期冷藏
4、(4),长久冷冻(-20)保留。第8页(二)唾液 唾液采集应尽可能在刺激少平静状态下进行。普通在漱口后15min搜集。采集后马上测量其除去泡沫部分体积。放置后分为泡沫部分、透明部分及灰乳白色沉淀部分三层。分层后离心分离,取上清液作为药品浓度测定样品。可集中、单一部位采集。第9页 唾液中含有粘蛋白,为阻止粘蛋白生成,应将唾液在4以下保留,解冻后搅匀后再用,不然会产生误差。优点:能够不受时间和地点限制,很轻易地重复采集,采集时无痛苦无危险;有些唾液中药品浓度能够反应血浆中游离型药品浓度。第10页缺点:唾液是各腺体分泌混合液体,其组成发生经时变动;所以,唾液中药品浓度与血浆中游离型药品浓度相比就轻易
5、变动;唾液中药品浓度与血浆中药品浓度比值(S/P)只有少数药品是恒定值;有些与蛋白结合率较高药品,药品在唾液中浓度比血浆浓度低得多,需要高灵敏度分析方法才能检测;对有些患者(如癫痛二昏迷)不能采集唾液样品。第11页(三)尿液 尿药测定主要用于药品剂量回收研究、尿去除率、生物利用度研究。体内药品去除主要是经过尿液排出,药品能够原型(母体药品)或代谢物及其缀合物(conjugates)等形式排出。尿液主要成份是水、含氮化合物(其中大部分是尿素)及盐类。第12页 尿液中药品浓度较高,搜集量能够很大,也方便,但尿液浓度通常改变较大,应测定一定时间内排入尿中药品总量,这就需要测定在要求时间内尿液体积及尿
6、药浓度,时间尿以外尿不可能推断全尿中药品排泄浓度和药品总量。第13页 测定尿中药品总量时,将一定时间内(如8h;12h或24h等)排泄尿液全部储存起来,并统计其体积,取其一部分测定药品浓度,然后乘以尿量求得排泄总量。采集尿液时,需用量筒准确地测量储尿量,并做好统计。第14页 缺点:尿液中药品浓度与血药浓度相关性差;受试者肾功效正常是否直接影响药品排泄,因而肾功效不良者不宜采集尿样;婴儿排尿时间难于掌握;尿液不易采集完全并不易保留。采集尿样应马上侧定。若搜集24h尿液不能马上测定时,应加入防腐剂置冰箱中保留。惯用防腐剂有:甲苯等,短时冷藏;长时冷冻。第15页二 生物样品分析其前处理技术 主要应考
7、虑生物样品种类,被测定药品性质和测定方法三个方面问题。样品分离、纯化技术应该依据生物样品类型。比如,血浆或血清需除蛋白,使药品从蛋白结合物中释出;唾液样品则主要采取离心沉淀除去粘蛋白;尿液样品常采取酸或酶水解使药品从缀合物中释出。第16页 依据被测定药品结构、理化性质及药理性质、存在形式、浓度范围等,采取对应前处理方法。87页图4-4大致反应了检测方法与样品前处理要求相互关系。第17页(一)去除蛋白质目标:可使结合型药品释放出来,方便测定药品总浓度;去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡,降低乳化形成,以及能够保护仪器性能,延长使用期限。第18页去除蛋白质方法:1.加入与水相混溶有机溶剂 加入
8、水溶性有机溶剂,可使蛋白质分子内及分子间氢键发生改变而使蛋白质凝聚,使与蛋白质结合药品释放出来。惯用水溶性有机溶剂有:乙睛、甲醇等。含药品血浆或血清与水溶性有机溶剂体积比为1:(1-3)时,就能够将90%以上蛋白质除去,采取超速离心机(10000r/min)离心便可将析出蛋白质完全沉淀。第19页 2.加入中性盐 使溶液离子强度发生改变。中性盐能将与蛋白质水合水置换出来,从而使蛋白质脱水而沉淀。惯用中性盐:饱和硫酸胺等。盐析方法与有机溶剂提取法常并用,药品回收率高。第20页 3.加入强酸 当pH低于蛋白质等电点时,蛋白质以阳离子形式存在,加入强酸,可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。惯用强酸有:
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