黄芩苷对SARS-COV-2侵袭的抑制作用研究.pdf
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1、 基金项目:山东省自然科学基金重点项目(.)山东省食品药品检验研究院院级课题(.)作者简介:耿雪女博士生副主任药师研究方向:中药药理学:.通信作者:祝清芬男博士主任药师硕士生导师研究方向:药理学:.黄芩苷对 侵袭的抑制作用研究耿雪王雪周倩苏昕宇李水仙祝清芬(.山东省食品药品检验研究院国家药品监督管理局胶类产品质量评价重点实验室中药标准创新与质量评价工程实验室山东 济南.山东中医药大学山东 济南.山东省中医药研究院山东 济南)摘要:目的 在体外研究黄芩苷对新型冠状病毒()入侵细胞过程的抑制作用 方法利用构建有荧光素酶报告基因的 蛋白假病毒系统通过荧光素酶试剂盒检测加入黄芩苷和假病毒后 细胞中的荧
2、光素表达变化进而绘制病毒抑制曲线 结果 黄芩苷能显著抑制 细胞的病毒感染率黄芩苷和病毒提前共孵育组与直接加入组在不同浓度下的病毒抑制曲线并无显著差别表明黄芩苷并不能与病毒直接结合而是通过作用于病毒 蛋白介导的细胞融合过程产生抑制作用黄芩苷在.浓度时对病毒的抑制率在 组显著降低在 和 组并无显著差别表明黄芩苷可能在病毒入侵细胞(非吸附)阶段产生抑制作用且介导的入侵抑制阶段发生在 内 结论 黄芩苷可能通过介导抑制 病毒 蛋白与细胞表面受体的融合过程在非吸附阶段抑制病毒的入侵发挥抗新冠病毒活性关键词:黄芩苷新型冠状病毒荧光素酶检测 蛋白中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.):.:药学
3、研究 .年 月一种全新的传染性呼吸道疾病被报道该疾病于 年 月被世界卫生组织()命 名 为“()”导致该疾病的致病病原体已成功鉴定为 感染进入宿主细胞后在宿主细胞的帮助下 其遗传物质 的/首先翻译表达出两条多聚蛋白前体(和)多 聚 蛋 白 前 体 在 主 蛋 白 酶()和 木 瓜 样 蛋 白 酶()的作用下发生分子内的切割产生多个非结构蛋白从而发生病毒的复制 整个过程任何一个阶段关键酶或关键蛋白缺失病毒都不能进行连续的复制这为病毒抑制提供了多个作用靶点依据这些靶点设计的病毒抑制剂或药物成为治疗新冠的重要手段目前新冠病毒的药物靶点包括结构蛋白(蛋白、蛋白、蛋白、蛋白)、主要蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋
4、白酶和 聚合酶黄芩苷为唇形科植物黄芩干燥根的主要成分具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、防治糖尿病及其并发症等药理作用可通过直接杀灭病毒、抑制病毒复制、调控宿主细胞功能蛋白表达等多种机制来有效防治病毒对流感病毒、肝炎病毒、柯萨奇病毒、呼吸道合胞病毒等多种病毒具有显著作用 对于黄芩苷抗新冠病毒方面也有一些研究成果 最近研究发现黄芩素可通过一系列的直接和间接氢键与 残基/结合固定游离的氧阴离子环结构防止肽底物接近活性位点进而抑制病毒的复制发挥抗病毒作用 通过分子对接技术进行靶点药物筛选发现黄芩苷和溴隐亭可分别结合新冠病毒非结构蛋白()蛋白同源性模型的 末端和 末端活性位点可进入新冠病毒 末端和
5、 末端活性结构域此外黄芩苷可能作为新冠病毒木瓜蛋白酶样蛋白酶的抑制剂发挥抗病毒作用 以上研究聚焦在病毒入胞后的复制阶段在病毒吸附阶段是否发挥作用还没有相关研究 为解决这一问题本研究采用了体外试验假病毒体系探索了黄芩苷对 病毒吸附融合抑制作用预测了黄芩苷可能的新的作用靶点蛋白为更深入研究黄芩苷抗新冠病毒机制提供依据 材料与仪器.细胞株 细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库.病 毒 株 假 病 毒(批 号:)病毒滴度为.购自北京天坛药物生物技术开发公司.试剂与仪器荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号:公司)胎牛血清(批号:)、高糖培养基(批号:)、胰蛋白酶(批号:)、(批号:/)均购自 公司
6、(批号:公司)(批号:公司)黄芩苷标准品(批号:中国食品药品检定研究院)(批号:公司)转染试剂(批号:公司)裂解液(批号:上海碧云天生物技术股份有限公司)聚偏二氟乙烯()膜(批号:公司)超敏底物化学发光检测试剂盒(批号:公司)抗 体(批 号:公司)方法.病毒抑制试验基本步骤如下:用 完全培养基将假病毒稀释至.取出培养箱中事先准备好的 细胞(汇合率达)吸弃瓶中的培养基加入 缓冲液清洗细胞倾去 后加入 .胰酶 消化 倾去胰酶用 完全培养基重悬细胞细胞计数用 完全培养基将细胞稀释至 向 孔板中每孔加 细胞使每孔细胞为 个 受试物组和阳性对照组每孔加 假病毒稀释液和 的受试物或完全培养基溶液阴性对照组
7、则只加 完全培养基将 孔板前后左右轻轻晃动使细胞在孔中分散均匀将 孔板放入细胞培养箱中 培养 以上每组均设 个重复从细胞培养箱中取出 孔板用多道移液器从每个上样孔中吸弃 上清然后加入 荧光素酶检测试剂室温避光反应 反应结束后用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸 次使细胞充分裂解从每孔中吸出 液体加于对应 孔化学发光检测板中置于化学发光检测仪中读取发光值并计算中和抑制率:抑制率(受试物组的发光强度均值空白对照组药学研究 .均值)/(阴性组的发光强度均值空白对照组均值).不同浓度黄芩苷病毒抑制试验配制不同浓度的黄芩苷标准品假病毒混合稀释液(/)孵育 后取 加入新的 孔板中同时加入 细胞悬液使每孔黄
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