基于高通量测序技术的9种铁线莲属药材混合粉末分子鉴定.pdf
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1、 基金项目:内蒙古卫健委蒙医药标准化研究项目(.)内蒙古自然科学基金项目(.)内蒙古自治区直属高校基本科研业务费项目(.)作者简介:呼和男硕士生研究方向:蒙药鉴定与品种资源:.通信作者:包桂花女博士教授研究方向:蒙药鉴定与品种资源:.基于高通量测序技术的 种铁线莲属药材混合粉末分子鉴定呼和莫日根乌雅汉乌日汗额尔敦呼白明君包桂花许亮(.内蒙古民族大学内蒙古 通辽.新巴尔虎右旗阿拉坦额莫勒镇社区卫生服务中心内蒙古 呼伦贝尔.内蒙古自治区国际蒙医医院内蒙古 呼和浩特.蒙医药研发工程教育部重点实验室内蒙古 通辽.辽宁中医药大学辽宁 大连)摘要:目的 建立基于高通量测序技术的 种铁线莲属混合粉末分子鉴定
2、方法 方法采用高通量测序技术对 种铁线莲属药材混合粉末样品中的总 经提取对 片段进行 扩增利用 平台对 片段进行双端测序最后采用、及 .软件对序列进行整理并聚类分析鉴定混合粉末中的物种 结果 混合粉末样品中得到高质量的 序列共 条铁线莲属物种含有序列 条比对出棉团铁线莲、女萎铁线莲、短尾铁线莲、灌木铁线莲、单叶铁线莲、黄花铁线莲、粗齿铁线莲等 个物种未能比对出东北铁线莲和芹叶铁线莲 结论 以 作为 条形码采用高通量测序技术可以鉴定出铁线莲属药材混合样品中的 个物种为混合药材的鉴定提供依据关键词:高通量测序技术铁线莲属药材混合粉末分子鉴定中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.):.
3、:药学研究 .铁线莲属植物在全世界有 多种主要分布在热带及亚热带地区寒带地区也有分布 我国约有 种广泛分布于全国各地云南是我国铁线莲属植物的分布中心 铁线莲属植物适应性强具有较强的耐寒性该属许多种类花大色艳花色各种各样花型多种花期长观赏价值很高具有“攀援植物皇后”的美称 铁线莲属植物是我国传统中草药具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、镇痛等作用目前国内外对铁线莲属的研究主要在生理抗性、无性繁殖、化学成分和药理作用等方面 铁线莲属植物在我国 个少数民族地区作为民族药使用其药用部位多以根和全草为主其次是藤茎叶较少另有个别药材用带花枝叶、果实、嫩枝或根皮 民族药传统功效为祛风止痛、利尿通淋、痛经下乳、抗菌消炎等
4、少部分可用于消化不良、胃寒、腹胀、黄疸、痞块、心悸、鼻窦炎等病症治疗外敷可用于疮疡久溃不敛、皮肤炎症如羌族用黄花铁线莲嫩枝外敷治各种顽癣、神经性皮炎 毛茛科铁线莲属近缘物种化学成分、药理作用相似如短尾铁线莲、芹叶铁线莲、黄花铁线莲等 在市场流通过程中经常有近缘药材代替正品药材的现象严重影响了临床用药的安全性和准确性应引起广泛重视 因此为了临床用药安全性及有效性准确鉴定铁线莲属近缘药材任重而道远有关铁线莲属药材的分子鉴定研究较少传统的鉴定方法不能很好地对正品、伪品药材进行准确系统的鉴定 近年来分子鉴定技术不断发展越来越多的学者利用分子技术对近缘药材进行鉴定并具有一定的可行性 因此分子鉴定的相关研
5、究越来越多研究成果也较为突出 安蕊等利用聚合酶链反应单链构象多态性方法建立了一种快速、准确鉴别威灵仙药材基原的方法为进一步开展威灵仙药材的准确鉴定提供了新的方法 木其尔应用 条形码技术对 种铁线莲属植物进行了分子鉴定为 条形码技术鉴别铁线莲属药材提供了新的思路 高通量测序技术作为新一代的测序技术广泛用于中药材的鉴定并且能够应用于药材混合粉末样品的鉴定本实验利用高通量测序技术对棉团铁线莲、女萎铁线莲、短尾铁线莲、灌木铁线莲、单叶铁线莲、黄花铁线莲、粗齿铁线莲、东北铁线莲和芹叶铁线莲等 种铁线莲属药材混合粉末样品的 序列进行宏基因组学物种多样性分析并构建系统发育树旨在鉴定出混合粉末样品中的铁线莲属
6、药材同时探究其系统进化关系 材料.药材 种铁线莲属药材采集时间为 年 月至 年 月其药用部位均为全草样品信息见表 表 样本信息编号药材采集地纬度经度海拔/鉴定人及单位棉团铁线莲 .内蒙古特金罕山保护区包桂花教授内蒙古民族大学粗齿铁线莲 .安徽黄山保护区杨青山副教授安徽中医药大学单叶铁线莲 .安徽黄山保护区杨青山副教授安徽中医药大学女萎铁线莲 .湖北省神农架保护区 万定荣教授中南民族大学短尾铁线莲 .内蒙古高格斯台罕乌拉保护区 布和巴特尔教授内蒙古民族大学灌木铁线莲 .内蒙古呼和浩特市金山开发区 岳鑫副教授内蒙古医科大学黄花铁线莲 内蒙古呼和浩特市金山开发区 岳鑫副教授内蒙古医科大学芹叶铁线莲
7、.内蒙古锡林浩特市乌和尔沁敖包森林公园 呼斯勒副主任药师锡林浩特市蒙医医院东北铁线莲 .辽宁千山保护区许亮教授辽宁中医药大学.试剂天根植物提取试剂盒、聚合酶、(公司)溴化乙锭(公司)缓冲液(公司)引物(北京六合华大基因科技有限公司)和 聚合酶(北京康为世纪生物科技有限公司)反应、和(北京索莱宝科药学研究 .技有限公司).仪器微量移液器(公司)低温冷冻离心机(北京五洲东方公司)仪()电泳系统(北京市六一仪器厂)凝胶成像分析仪(北京五洲东方公司)方法.样品总 提取 取 种药材各 分别研碎等比混匀取 份 混合粉末样品分别命名为、应用植物提取试剂盒提取样品中总.扩增 混合样品宏基因组物种多样性分析目标
8、为 序列片段引物序列为:扩增体系为 :反应 上游引物和下游引物各 模板 为.聚合酶.扩增参数:预变性 变性 退火 延伸 个循环 延长 .测序文库制备 采用 平台进行双端测序 采用滑动窗口法筛查 格式的双端序列质量 利用 软件对通过质量初筛的序列进行配对连接 将连接后的序列识别分配入对应样本获得有效序列 使用 (使用的 为.官方网址是:/.)和(版本为.)软件 具体的参数为:首先使用 切除序列的引物片段设置 为 弃去未匹配引物的序列使用 的 模块拼接序列使用 模块对拼接序列进行质控使用 模块去除重复序列使用 模块在 相似度水平对去重后的序列聚类使用 模块去除嵌合 体 再 使 用 脚 本(:/./
9、)过滤质控后序列集中的嵌合体从而获得高质量序列使用 模块在 相似度水平对高质量序列聚类并分别输出代表序列和 表 最后去除 表格中的 (即在所有样本中丰度为 的 默认操作)及其代表序列 利用和 数据库进行序列比对获取各 的分类学信息.分类学信息交互展示与进化分析 使用 软件(:/./)进行群落分类并对样本分类水平的组成进行可视化分析并使用 .在 下载的序列与 代表序列构建邻接系统分类()树鉴定出物种并探讨系统进化关系 结果与分析.测序结果混合粉末样品的物种多样性分析显示 组重复实验、分别得到、条序列所得序列总数为 条 剔除有疑问的序列后剩余高质量的序列总数为 条其中 为 条、为 条、为 条序列长
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