HPLC多波长切换指纹图谱结合化学计量学研究白术土炒前后成分变化规律.pdf

基金项目:山东省重点研发计划项目(.)国家重点研发计划项目(.)山东省自然科学基金项目(.)国家药品监管科学体系建设重点项目(.)山东中医药大学 年教育教学研究课题(.)同为第一作者作者简介:张磊男硕士生研究方向:中药新药研发与炮制:.任榕霞女中级经济师研究方向:财政税收与数理统计:.通信作者:崔伟亮男博士副主任中药师研究方向:中药质量控制:.李慧芬女博士副教授研究方向:中药新药研发与炮制:.多波长切换指纹图谱结合化学计量学研究白术土炒前后成分变化规律张磊任榕霞丁宁崔伟亮李慧芬(.山东中医药大学山东 济南.济南市企业技术进步促进中心山东 济南.山东省食品药品检验研究院山东 济南.中药制药共性技术国家重点实验室山东 临沂)摘要:目的 建立测定白术、土白术水溶性和脂溶性成分的高效液相色谱二极管阵列检测器()多波长切换指纹图谱结合化学计量学研究白术土炒前后成分变化规律 方法建立白术、土白术水溶性及脂溶性成分的 多波长切换指纹图谱测定方法测定 批白术和 批土白术的 指纹图谱采用相似度评价、聚类分析、分析进行统计分析 结果白术指纹图谱中共标定 个共有峰土白术指纹图谱中共标定 个共有峰 指认了新绿原酸、绿原酸、白术内酯、白术内酯、白术内酯及苍术酮 个成分土炒后 号峰、号峰(白术内酯)、号峰(白术内酯)峰面积增加 号峰(新绿原酸)、号峰(绿原酸)、号峰、号峰、号峰、号峰(白术内酯)、号峰(苍术酮)土炒后峰面积均降低 结论所建立指纹图谱方法能够系统地分析白术土炒前后化学成分的变化规律可为进一步规范白术土炒工艺制定土白术专属性质量标准研究土白术炮制原理提供实验基础关键词:白术土白术高效液相色谱二极管阵列检测器指纹图谱多波长切换化学计量学成分变化中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.):()().()药学研究 .().()()()().:白术为菊科植物白术(.)干燥根茎具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的作用用于脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安等症始载于神农本草经列为上品 白术土炒后增强健脾止泻的作用多用于脾虚泄泻 外台秘要始载白术土炒的炮制方法现代保留的白术主要炮制方法有麸炒法、土炒法及清炒法 白术经炒制后化学成分发生了不同程度的变化白术化学成分研究主要集中于挥发油类、内酯类、多糖类等成分土白术中化学成分研究主要集中于倍半萜和聚乙炔类成分 目前对白术及麸白术 指纹图谱的研究较多未检索到对土白术水溶性成分及脂溶性成分测定的报道 为了系统分析土炒对白术成分变化的影响本研究建立同时测定白术、土白术水溶性成分及脂溶性成分的高效液相色谱二极管阵列检测器()多波长切换指纹图谱方法并进行化学计量学分析筛选白术、土白术的主要差异性成分研究白术土炒前后化学成分变化规律为进一步规范白术土炒炮制工艺制定土白术专属性质量标准研究土白术炮制原理提供实验基础 仪器与试药.仪器 高效液相色谱仪(美国沃特世公司)数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)电子天平(美国梅特勒托利多公司)超净水仪(美国密理博公司).试 剂 新 绿 原 酸 对 照 品(批 号:)购自成都曼思特生物科技有限公司绿原酸、白术内酯 、白术内酯、白术内酯对照品(批号依次为:、)均购自中国食品药品检定研究院苍术酮对照品(批号:)购自上海源叶生物科技有限公司乙腈、甲醇为色谱纯水为自制超纯水其余试剂均为分析纯.试药 本研究从安徽盛海堂中药饮片有限公司和安国市聚药堂中药饮片有限公司购置白术饮片共 批(编号为)具体见表 表 白术样品来源信息编号批号生产厂家产地安徽盛海堂中药饮片有限公司安徽安徽盛海堂中药饮片有限公司安徽安徽盛海堂中药饮片有限公司安徽安徽盛海堂中药饮片有限公司安徽安徽盛海堂中药饮片有限公司安徽安徽盛海堂中药饮片有限公司安徽安徽盛海堂中药饮片有限公司安徽安徽盛海堂中药饮片有限公司安徽安徽盛海堂中药饮片有限公司安徽安徽盛海堂中药饮片有限公司安徽安国市聚药堂中药饮片有限公司安徽安国市聚药堂中药饮片有限公司安徽安国市聚药堂中药饮片有限公司安徽安国市聚药堂中药饮片有限公司安徽安国市聚药堂中药饮片有限公司安徽安国市聚药堂中药饮片有限公司安徽安国市聚药堂中药饮片有限公司安徽 分别委托两家企业根据山东省中药饮片炮制规范 年版一部土白术炮制方法取伏龙肝细粉置锅内中火炒至呈灵活状态时加入净白术片拌炒至表面挂土色有香气逸出时取出筛去伏龙肝细粉放凉每 白术片用伏龙肝细粉 制备了土白术(编号记为)经山东中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定样品分别为菊科植物白术(.)干燥根茎切制的厚片和土炒饮片 方法与结果.色谱条件 色谱柱为 色谱柱(.)流动相乙腈().磷酸溶液()进样体积为 流速为.柱温为 检测波长 (新绿原酸、绿原酸)(白术内酯、)(白术内酯 )(苍术酮)梯度洗脱(药学研究 .).混合对照品溶液的制备 分别取新绿原酸、绿原酸、白术内酯、白术内酯、白术内酯、苍术酮对照品适量精密称定加甲醇制成每 含新绿原酸.、绿原酸.、白术内酯.、白术内酯.、白术内酯.、苍术酮.的混合对照品溶液.供试品溶液制备 精密称定样品粉末(过三号筛).置具塞三角瓶中精密加入 甲醇 盖塞称重超声处理(功率 频率 )补足失重过滤滤液再以.微孔滤膜过滤即得.方法学考察.指纹图谱的建立及共有峰的确定取各样品按照“.”项下方法分别制备供试品溶液按“.”项下色谱条件进行测定将测定结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(.版)”进行 峰匹配和多点矫正分别建立白术、土白术 指纹图谱白术共标识出 个共有峰(见图)土白术共标识出 个共有峰(见图)分别以、样品指纹图谱为参照图谱生成白术、土白术对照指纹图谱 通过对照品(见图)比对根据对照品保留时间比对并结合紫外光谱图确定 号峰为新绿原酸 号峰为绿原酸 号峰(峰)为白术内酯 号峰为白术内酯 号峰为白术内酯 号峰为苍术酮图 白术 指纹图谱图 土白术 指纹图谱.新绿原酸.绿原酸.白术内酯().白术内酯.白术内酯.苍术酮图 混合对照品色谱图.参照峰选择本试验以白术内酯为参照峰用于计算指纹图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积.精密度试验 取土白术()的供试品溶液按照“.”项下色谱条件连续进样 次以白术内酯色谱峰为参照峰 计算各共有峰的相对保留时间 值范围为.相对峰面积 值范围为.表明仪器精密度符合要求.稳定性试验 取土白术()的供试品溶液按照“.”项下色谱条件分别在、进样以白术内酯色谱峰为参照峰 计算各共有峰的相对保留时间 值 范 围 为.相对峰面积 值范围为.表明供试品溶液在 内稳定.重复性试验取土白术()粉末按照“.”项制备供试品溶液平行制备 份按照“.”项下色谱条件进样以白术内酯色谱峰为参照峰计算各共有峰的相对保留时间 值范围为.相对峰面积 值范围为.表明方法重复性良好.指纹图谱相似度分析 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(.版)”软件分别计算各批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度结果见表 白术指纹图谱与对照指纹图谱的相似度范围在.土白术样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度范围在.表明白术、土白术不同饮片各批次之间相似度高.多元统计分析.聚类分析(分析)将白术、土白术共有峰面积数据导入 .软件进行聚类分析结果见图 由图 可知白术可聚为一类土白术中、归为白术一类其余土白术样品可聚为一类药学研究 .表 白术、土白术指纹图谱相似度评价结果编号相似度编号相似度.图 白术、土白术聚类分析图.正交偏最小二乘判别分析(分析)为了进一步筛选对两种饮片产生影响贡献较大的成分采用 .软件进行有监督模式识别分析建立 分析模型表示模型在 轴、轴方向上对变量解释能力的().().表示模型分组预测能力的().表明所建立模型稳定可靠、预测能力强可用于区别白术、土白术 得分图显示(见图)白术和土白术可以被有效区分表明白术土炒前后化学成分有明显差异 检验图显示(见图)经 次排列检验右侧.、.回归线的截距.排列检验确保了模型没有过度拟合因此所建立的模型是可靠、准确的 图(见图)中共有峰分布的位置表明其对 组样品分组相应的贡献率 其中 号峰(白术内酯)、号峰对土白术分组贡献率最大号峰、号峰(白术内酯)、号峰(白术内酯)、号峰、号峰(苍术酮)对白术分组贡献率最大 图(见图)中的纵坐标()代表每个组分的相关系数距离原点越远的组分对分组的贡献越大 故各变量对分组贡献度由大到小为:峰().峰 苍术酮().峰().峰 白术内酯().峰().图 白术、土白术 模型得分图()、模型检验图()、图()、图()以峰编号为横坐标以表明变量重要性的投影值()为纵坐标得到 图(见图)一般认为 值大于 的成分为主要差异成分 值越高对区分两种样品的贡献率越高 由统计结果可知 号峰(苍术酮)、号峰、号峰、号峰、号峰(白术内酯)的 大于 图 白术、土白术 图()结合 图、图与 图以 和()的绝对值大于.为标准筛选出对模型分组影响最大的变量 号峰(苍术酮)、号峰、号峰、号峰、号峰(白术内酯)小结与讨论本研究以色谱峰的个数、峰形及分离效果为指标分别对提取溶剂(不同浓度甲醇、乙醇、水)、提取方法(加热回流、超声)进行了系统考察采用全药学研究 .波长扫描选择最佳检测波长优选的最佳实验条件为:甲醇超声法提取样品色谱条件为色谱柱:色谱柱(.)流动相乙腈.磷酸溶液多波长切换:(新绿原酸、绿原酸)(白术内酯、)(白术内酯)(苍术酮)流速为.柱温为 进样量为 建立的 多波长切换指纹图谱测定方法稳定、可靠能够系统地分析白术土炒前后化学成分的变化规律对比色谱图可知土炒后 号峰、号峰(白术内酯)、号峰(白术内酯 )峰面积增加 号峰(新绿原酸)、号峰(绿原酸)、号峰、号峰、号峰、号峰(白术内酯 )、号峰(苍术酮)土炒后峰面积均降低 通过化学计量学分析 号峰(苍术酮)、号峰、号峰、号峰、号峰(白术内酯)为白术与土白术的显著差异性成分 白术可聚为一类土白术中、被归为白术一类其余土白术样品可聚为一类推测原因可能是这 批土白术炮制程度稍欠导致无法对白术与土白术进行有效区分 结果提示现有的炮制工艺尚不够精细炮制温度与时间需要进一步细化和规范以便更加有效保证土白术的质量稳定性 号峰为土白术重要的专属性成分试验中曾以羟甲基糠醛、隐绿原酸、异绿原酸等对照品进行了比对分析并查阅相关文献但仍未能其代表的化学成分 根据紫外光谱图推测该成分可能为小分子脂肪酸类成分课题组在后续试验中将进一步采用成分分离、纯化及结构鉴定等相关技术明确该成分同时结合药效学实验进一步研究白术与土白术功效差异与成分差异的关系参考文献:国家药典委员会.中华人民共和国药典 年版(一部).北京:中国医药科技出版社:.孙星衍孙冯翼.神农本草经.北京:人民卫生出版社.王焘.外台秘要.北京:人民卫生出版社.马斯怡侴桂新.土白术药材中()十四癸二烯二炔二乙酸酯和芹烷二烯酮的定性定量方法研究.上海中医药杂志():.张乐林石典花孙蓉.白术生品与麸炒品 指纹图谱及主成分差异分析.辽宁中医杂志():.谭小娟李世雄李璎峪等.白术饮片的指纹图谱形状特征与质量标志物()研究.中草药():.张诚光孙冬梅毕晓黎等.不同产地麸白术指纹图谱及同时测定 种白术内酯成分含量的方法研究.广东药科大学学报():.张兵张丽娜韩鹏军等.白术中 种内酯成分的含量测定及指纹图谱研究.天津中医药大学学报():.盛云杰严斌俊穆朝峰等.基于指纹图谱与化学计量学评价白术炮制品质量.中成药():.杜晓蕾崔伟亮朱日然等.指纹图谱结合化学计量学研究白术麸炒前后成分变化情况.中药材():.山东省药品监督管理局.山东省中药饮片炮制规范(年版).济南:山东科学技术出版:.吴胜鸿黄圆圆周欣等.痔炎消颗粒 指纹图谱研究.中药新药与临床药理():.(收稿日期:)(上接第 页).():.():.():.:.():./.():./.():.(收稿日期:)药学研究 .