生物技术概论细胞工程省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

生生 物物 技技 术术 概概 论论细胞工程细胞工程生物工程专业课程生物工程专业课程吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院1第1页第一节第一节 细胞培养设施、条件及细胞培养设施、条件及方法方法 2第2页研究基础：细胞学研究基础：细胞学操作对象：细胞或组织操作对象：细胞或组织基本技术：细胞与组织培养基本技术：细胞与组织培养3第3页一、细胞工程基本原理一、细胞工程基本原理1.1 细胞工程概念及研究范围细胞工程概念及研究范围1.2 细胞工程基础知识细胞工程基础知识1.3 细胞工程细胞工程理论关键理论关键4第4页1.1 细胞工程概念及研究范围细胞工程概念及研究范围概念概念：应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学试应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特征和生验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特征和生物学特征，以取得特定细胞、细胞产品或新生物体相关理物学特征，以取得特定细胞、细胞产品或新生物体相关理论和技术方法学科。论和技术方法学科。研究范围研究范围：广义细胞工程包含全部生物组织、器官及细胞广义细胞工程包含全部生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义细胞工程则是指细胞融合和细离体操作和培养技术，狭义细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。依据研究对象不一样，细胞工程可分为动物胞培养技术。依据研究对象不一样，细胞工程可分为动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程。细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程。5第5页1.2 细胞工程基础知识细胞工程基础知识生物界有两大类细胞生物界有两大类细胞：原核细胞与真核细胞原核细胞与真核细胞。原核细胞原核细胞：DNADNA裸露于细胞质中，不与蛋白质结合，易于人裸露于细胞质中，不与蛋白质结合，易于人们遗传操作；生长快速；胞内无膜系结构细胞器；是细胞们遗传操作；生长快速；胞内无膜系结构细胞器；是细胞改造良好材料。改造良好材料。真核细胞真核细胞：胞内有细胞核和众多膜系结构细胞器；普通都有胞内有细胞核和众多膜系结构细胞器；普通都有显著细胞周期，处于有丝分裂时期染色体展现高度螺旋紧显著细胞周期，处于有丝分裂时期染色体展现高度螺旋紧缩状态，既不利于基因外钓，也不利于外源基因插入。可缩状态，既不利于基因外钓，也不利于外源基因插入。可采取一定办法诱导真核细胞同时化生长。植物细胞外还有采取一定办法诱导真核细胞同时化生长。植物细胞外还有数层以纤维素为主要成份细胞壁。数层以纤维素为主要成份细胞壁。6第6页动物细胞结构图动物细胞结构图细菌细胞模式图细菌细胞模式图7第7页1.3 细胞工程理论关键细胞工程理论关键1.3.1 细胞全能性概念19，德国植物学家Haberlandt提出了细胞全能性假想。1934年，White首次定义为:每个植物活细胞在适当条件下，都有发育为胚能力。70年代，扩大了以上定义范围，认为：植物活细胞不但能形成胚状体，而且能发育为完整植株。80年代初，认为：任何植物离体细胞在人工培养下都含有它们母体植株那种合成药用成份能力，即培养细胞药品生物合成能力。8第8页当前细胞全能性定义：当前细胞全能性定义：每个植物活细胞都含有该物种每个植物活细胞都含有该物种新陈代谢新陈代谢、应应激性激性和和自体复制自体复制等生命基本属性，在适当离体培等生命基本属性，在适当离体培养条件下，能够展现这些特征属性。养条件下，能够展现这些特征属性。9第9页1.3.2 植物活细胞含有生命特征属性植物活细胞含有生命特征属性生命特征属性生命特征属性细胞含有生命特征属性细胞含有生命特征属性离体培养细胞展现该物种生命特征离体培养细胞展现该物种生命特征10第10页生命特征属性：生命特征属性：新陈代谢新陈代谢、应激性应激性、自我复制自我复制11第11页1.1.新陈代谢：是指维持生命各种活动过程中化学改变总称。新陈代谢：是指维持生命各种活动过程中化学改变总称。生物体总是不停地从环境中摄取物质和能量，来维持本身。生物体总是不停地从环境中摄取物质和能量，来维持本身。又有同等量能量，以热或者其它形式排出体外。一旦新陈又有同等量能量，以热或者其它形式排出体外。一旦新陈代谢停顿，生命活动也就停顿，生物体就会瓦解。代谢停顿，生命活动也就停顿，生物体就会瓦解。即，生物体要维持生命，必须吐故纳新。即，生物体要维持生命，必须吐故纳新。12第12页2.2.应激性：是指生物体随环境改变刺激而发生对应应激性：是指生物体随环境改变刺激而发生对应反应特征。反应特征。生物体生存离不开环境条件，而环境又是不停生物体生存离不开环境条件，而环境又是不停改变。除四季有规律改变外，还有些急剧改变，改变。除四季有规律改变外，还有些急剧改变，如干旱、涝灾、高温、低温、昆虫侵害等等。生如干旱、涝灾、高温、低温、昆虫侵害等等。生物体含有物体含有“某种机制某种机制”来感知和正确预计环境改来感知和正确预计环境改变，方便在体内加以校正，确保体内平衡，来应变，方便在体内加以校正，确保体内平衡，来应付突变环境。付突变环境。13第13页3.3.自我复制：是指生物体利用本身作模板，经过代自我复制：是指生物体利用本身作模板，经过代谢作用，复制出完全相同结构，或产生也含有相谢作用，复制出完全相同结构，或产生也含有相同自体繁殖能力突变结构。同自体繁殖能力突变结构。前者为前者为“遗传遗传”，后者为，后者为“变异变异”。“遗传遗传”确保了物种纯化，确保了物种纯化，“变异变异”为物种进化提供依为物种进化提供依据。自我复制实现了遗传与变异矛盾统一。据。自我复制实现了遗传与变异矛盾统一。14第14页细胞含有生命特征属性细胞含有生命特征属性 生物体由细胞组成，所以细胞也含有生命特征生物体由细胞组成，所以细胞也含有生命特征属性。属性。细胞是生物体结构和功效基本单位。核酸是组成细胞是生物体结构和功效基本单位。核酸是组成细胞主要物质，携带着遗传信息，并含有自我复细胞主要物质，携带着遗传信息，并含有自我复制能力，但当单独存在时，不能表现出生命特征制能力，但当单独存在时，不能表现出生命特征属性。只有组成细胞时，才能表现完整生命活动。属性。只有组成细胞时，才能表现完整生命活动。15第15页 同一个体每一个体细胞所含基因是相同，同一个体每一个体细胞所含基因是相同，但细胞结构和功效往往不一样（如根细胞含但细胞结构和功效往往不一样（如根细胞含有吸收水分和养分作用；叶片含有光和、蒸有吸收水分和养分作用；叶片含有光和、蒸腾作用等）。腾作用等）。所以说，并非每个细胞能把全部遗传信息所以说，并非每个细胞能把全部遗传信息都表示出来。有基因在这些细胞中表示，另都表示出来。有基因在这些细胞中表示，另一些基因在另一些细胞中表示。即，生命全一些基因在另一些细胞中表示。即，生命全部属性在不一样细胞中分别表示。部属性在不一样细胞中分别表示。16第16页离体培养细胞展现该物种生命特征离体培养细胞展现该物种生命特征1.1.培养细胞新陈代谢培养细胞新陈代谢 在适宜条件下，离体细胞能够存活，则在适宜条件下，离体细胞能够存活，则含有新陈代谢特征。如：绿色细胞含有光自含有新陈代谢特征。如：绿色细胞含有光自养能力；培养细胞含有该物种养能力；培养细胞含有该物种“药品生物合药品生物合成能力成能力”。17第17页2.2.培养细胞应激性培养细胞应激性 在适宜培养条件下，离体细胞含有应激在适宜培养条件下，离体细胞含有应激性：植物组织切割损伤后，应激于培养条件性：植物组织切割损伤后，应激于培养条件而出现脱分化，并在适宜条件下再分化（芽而出现脱分化，并在适宜条件下再分化（芽和根）。和根）。18第18页3.3.培养细胞展现自体复制特征培养细胞展现自体复制特征再分化再分化植株植株植物组织植物组织脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织（脱分化细胞）（脱分化细胞）19第19页20第20页细胞工程是生命科学领域一个组成部分。就学科而言，细胞工程是生命科学领域一个组成部分。就学科而言，它是它是包括细胞生物学、发育生物学和遗传学等多门学科包括细胞生物学、发育生物学和遗传学等多门学科综合科学。综合科学。细胞工程以细胞培养技术、细胞融合技术为基础，现已细胞工程以细胞培养技术、细胞融合技术为基础，现已被广泛应用于多个学科被广泛应用于多个学科基础研究工作基础研究工作以及以及农业、医药与农业、医药与食品等生产食品等生产中。中。近年来细胞工程开发和应用主要集中在细胞杂交，快速近年来细胞工程开发和应用主要集中在细胞杂交，快速无性繁殖和细胞育种等方面。细胞工程在新技术革命浪无性繁殖和细胞育种等方面。细胞工程在新技术革命浪潮中对农业、食品等传统工艺革新有着重大影响。潮中对农业、食品等传统工艺革新有着重大影响。21第21页细胞工程所包括主要技术有：细胞工程所包括主要技术有：细胞培养技细胞培养技术、细胞融合技术、细胞器移植和细胞重术、细胞融合技术、细胞器移植和细胞重建技术、染色体工程技术、体外授精、胚建技术、染色体工程技术、体外授精、胚胎移植技术和生物反应器技术等胎移植技术和生物反应器技术等;在食品工业中应用较广泛细胞工程技术主在食品工业中应用较广泛细胞工程技术主要是要是细胞培养技术、细胞融合技术、细胞细胞培养技术、细胞融合技术、细胞重建技术及细胞代谢物生产技术重建技术及细胞代谢物生产技术等。等。细胞工程基本技术细胞工程基本技术22第22页 1细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术是指动物和植物细胞在细胞培养技术是指动物和植物细胞在体外无菌条件下保留和生长。体外无菌条件下保留和生长。即将机体内某一组织取出，使其分散即将机体内某一组织取出，使其分散成单个细胞，在体外人工生长条件下成单个细胞，在体外人工生长条件下培养，使细胞生长和不停增殖。培养，使细胞生长和不停增殖。23第23页细胞培养细胞培养24第24页植物组织培养植物组织培养25第25页2细胞融合技术细胞融合技术 指两种不一样亲株经酶法去除细胞壁得到两指两种不一样亲株经酶法去除细胞壁得到两个原生质体，并在助融剂作用下相互凝集并个原生质体，并在助融剂作用下相互凝集并发生细胞间融合，进而造成基因重组，取得发生细胞间融合，进而造成基因重组，取得新菌株。新菌株。其融合频率显著高于常规杂交数倍至几十倍。其融合频率显著高于常规杂交数倍至几十倍。对促进基因重组、遗传育种、选育优良品系，对促进基因重组、遗传育种、选育优良品系，以到达高产优质含有主要实践意义。以到达高产优质含有主要实践意义。26第26页3细胞器移植和细胞重建技术细胞器移植和细胞重建技术所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞细胞所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞细胞核（或细核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种一胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种一项技术。项技术。克隆羊克隆羊27第27页28第28页29第29页 动物细胞工程动物细胞工程主要应用于主要应用于培养有生理活性物质培养有生理活性物质，如，如病毒疫苗、病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体干扰素、单克隆抗体等。等。因为动物细胞工程复杂性及精密性，促进动物细因为动物细胞工程复杂性及精密性，促进动物细胞大量培养新工艺、新技术不停涌现胞大量培养新工艺、新技术不停涌现;其中关键技术包含：其中关键技术包含：无血清细胞培养基开发，灌无血清细胞培养基开发，灌注悬浮培养、贴壁细胞培养、固定化细胞培养注悬浮培养、贴壁细胞培养、固定化细胞培养等等培养技术应用等。培养技术应用等。30第30页动物细胞结构动物细胞结构31第31页 植物细胞工程植物细胞工程 主要指植物细胞培养技术，以前称之为植物主要指植物细胞培养技术，以前称之为植物组织培养，是一个将植物组织、器官或细胞在组织培养，是一个将植物组织、器官或细胞在适当培养基上进行无菌培养技术。适当培养基上进行无菌培养技术。最常见植物细胞培养技术有最常见植物细胞培养技术有愈伤组织培养、悬愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官培养、基尖分生组织培养、浮细胞培养、器官培养、基尖分生组织培养、原生质体培养和固体化细胞培养原生质体培养和固体化细胞培养几大类型。几大类型。32第32页植物细胞结构植物细胞结构33第33页4、染色体工程、染色体工程 将单个染色体或染将单个染色体或染色体组转入或移出色体组转入或移出受体细胞，从而形受体细胞，从而形成新染色体组合和成新染色体组合和遗传组成。广泛用遗传组成。广泛用于优良品种培育，于优良品种培育，如多倍体育种。如多倍体育种。34第34页5、胚胎工程、胚胎工程胚胎工程是以生殖胚胎工程是以生殖细胞和胚胎细胞为细胞和胚胎细胞为对象进行细胞工程对象进行细胞工程操作，主要技术包操作，主要技术包含体外受精、胚胎含体外受精、胚胎移植、胚胎切割等。移植、胚胎切割等。35第35页6、干细胞与组织工程、干细胞与组织工程干细胞是动物体内含有分化潜能、并能自我更干细胞是动物体内含有分化潜能、并能自我更新细胞，分为胚胎干细胞和组织干细胞。新细胞，分为胚胎干细胞和组织干细胞。36第36页7、转基因与生物反应器、转基因与生物反应器（1）转基因动物）转基因动物（2）转基因植物）转基因植物37第37页二二 细胞培养设施、条件及方法细胞培养设施、条件及方法 主要介绍细胞工程试验室设置及其所需要基主要介绍细胞工程试验室设置及其所需要基本条件。本条件。细胞工程试验室与其它普通试验室主要区分细胞工程试验室与其它普通试验室主要区分在于，要求保持严格在于，要求保持严格无菌环境无菌环境，防止微生物，防止微生物及其它有害原因影响。普通来讲，它应能进及其它有害原因影响。普通来讲，它应能进行行六方面六方面工作：工作：无菌操作、培养、制备、清无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和贮藏洗、消毒灭菌处理和贮藏。38第38页2.1 细胞工程试验室设置细胞工程试验室设置1.无菌操作室无菌操作室 无菌操作室是相对无菌操作室是相对密封、防尘、防菌密封、防尘、防菌工作空间，在结构工作空间，在结构和消毒方面都有基和消毒方面都有基本要求。本要求。2.1.1 动物细胞工程试验室设备动物细胞工程试验室设备39第39页超净工作台超净工作台40第40页2.培养和观察室培养和观察室 需要清洁无灰尘。需要清洁无灰尘。孵育可在培养箱孵育可在培养箱或可控制温度温或可控制温度温室中进行，普通室中进行，普通试验室多采取培试验室多采取培养箱进行。养箱进行。41第41页 3.制备室制备室 该区主要进行培养该区主要进行培养液及相关液体制备，液及相关液体制备，在用天平、在用天平、PH计、计、磁力搅拌器等设备磁力搅拌器等设备下完成制备以后，下完成制备以后，应在无菌操作台进应在无菌操作台进行过滤除菌。行过滤除菌。42第42页 4.储备室储备室 储备室主要设储备室主要设备有冰箱、液备有冰箱、液氮罐、储物柜氮罐、储物柜等，还有一些等，还有一些器皿等，对储器皿等，对储备室要求是取备室要求是取放方便。放方便。43第43页 5.清洗和灭菌室清洗和灭菌室 应与其它区分开，应与其它区分开，主要有消毒柜、主要有消毒柜、干燥箱和纯水制干燥箱和纯水制备等设备，进行备等设备，进行全部细胞培养器全部细胞培养器皿清洗、准备、皿清洗、准备、消毒及纯水制备消毒及纯水制备等工作。等工作。44第44页2.1.2 植物细胞工程试验室设置植物细胞工程试验室设置植物细胞工程试验室除含有与动物细植物细胞工程试验室除含有与动物细胞工程试验室相同无菌操作室、制备胞工程试验室相同无菌操作室、制备室、清洗和灭菌室外，还有其特殊设室、清洗和灭菌室外，还有其特殊设置，如含有光照条件培养室、温室和置，如含有光照条件培养室、温室和驯化室等。驯化室等。45第45页1、无菌操作室、无菌操作室2、培养室、培养室培养室温度应该是可控，普通保持在培养室温度应该是可控，普通保持在25左右。左右。3、判定室、判定室4、清洗室、清洗室5、灭菌室、灭菌室6、制备室、制备室7、驯化移植室、驯化移植室46第46页2.2 惯用仪器与设备惯用仪器与设备1、超净工作台、超净工作台47第47页2、倒置显微镜、倒置显微镜 使用倒置显微镜定时检验培养细胞器皿中细使用倒置显微镜定时检验培养细胞器皿中细胞生长情况，可及时调整培养条件。若发觉胞生长情况，可及时调整培养条件。若发觉污染，可依据污染类型决定补救办法和处理污染，可依据污染类型决定补救办法和处理方案。若能配置带有相机系统高质量相关显方案。若能配置带有相机系统高质量相关显微镜，效果更佳。微镜，效果更佳。48第48页3、电热干燥箱、电热干燥箱 用于细胞培养中有些器械、器皿需要烘干用于细胞培养中有些器械、器皿需要烘干时使用，玻璃器皿也需要干燥消毒。试验时使用，玻璃器皿也需要干燥消毒。试验室惯用是鼓风式电热干燥箱，其优点是温室惯用是鼓风式电热干燥箱，其优点是温度均匀、效果良好，缺点是升温过程较慢。度均匀、效果良好，缺点是升温过程较慢。49第49页4、水纯化装置、水纯化装置 细胞培养对水质量要细胞培养对水质量要求很高，全部与培养求很高，全部与培养细胞接触液体均需要细胞接触液体均需要 纯水配成。水可采取纯水配成。水可采取离子交换纯水装置或离子交换纯水装置或蒸馏器纯化。蒸馏器纯化。50第50页5、冰箱、冰箱 细胞培养室必须配置普细胞培养室必须配置普通冰箱或冷藏柜，最好通冰箱或冷藏柜，最好还有一台低温冰箱（还有一台低温冰箱（-20）。前者用于贮存）。前者用于贮存各种溶液和短期保留组各种溶液和短期保留组织标本等，织标本等，-20低温低温冰箱则用于储存需要冷冰箱则用于储存需要冷冻保持生物活性及较长冻保持生物活性及较长时期存放制剂，如酶、时期存放制剂，如酶、血清、配置抗生素等。血清、配置抗生素等。51第51页6、压力蒸汽消毒器、压力蒸汽消毒器7、细胞计数板和电子细胞计数仪、细胞计数板和电子细胞计数仪8、过滤除菌装置、过滤除菌装置9、离心机、离心机10、移液管和吸管、移液管和吸管11、离心管、离心管12、移液器、移液器13、天平、天平52第52页2.2.2 动物细胞工程试验室惯用仪器设备动物细胞工程试验室惯用仪器设备1、培养箱、培养箱2、显微操作仪、显微操作仪3、细胞融合仪、细胞融合仪4、细胞冷冻储存器、细胞冷冻储存器5、培养用器皿、培养用器皿6、手术器械、手术器械53第53页2.2.3 植物细胞工程试验室惯用仪器设备植物细胞工程试验室惯用仪器设备1、光照培养箱、光照培养箱2、人工气候箱、人工气候箱3、摇床、摇床4、培养瓶、培养瓶54第54页2.3 试验室生物安全试验室生物安全 在进行细胞与组织培养时，尤其是含在进行细胞与组织培养时，尤其是含有病原生物材料培养，不但要确保培有病原生物材料培养，不但要确保培养物不受污染，也要确保培养物不会养物不受污染，也要确保培养物不会对试验人员和环境造成污染。对试验人员和环境造成污染。55第55页清洗主要目标目标是去除培养器皿中杂质和微生物等影响细胞生长成份。清洗后玻璃器皿要洁净、透明、无油质，且无任何残留物质。清洗完成后器皿在消毒前必须进行严密包装，方便消毒及储存，预防落入灰尘及消毒后再次被污染。3 3 清洗与消毒清洗与消毒56第56页严格消毒灭菌对确保细胞培养成功是极为主要。细胞培养过程中主要使用两类消毒方法，即物理灭菌物理灭菌法和化学灭菌法法和化学灭菌法。不一样灭菌方式适合用于不一样物品，如紫外线法适合用于无菌室或超净工作台台面等大面积消毒，高压蒸汽消毒适合用于玻璃器皿，过滤除菌适于含有不耐热成份培养基和试剂消毒，化学消毒适合用于试验室、无菌室桌面、物体表面消毒。57第57页过滤除菌器58第58页3.1 清洗清洗3.1.1 玻璃器皿清洗玻璃器皿清洗3.1.2 胶塞清洗胶塞清洗3.1.3 塑料制品清洗塑料制品清洗3.1.4 G6除菌滤器清洗除菌滤器清洗3.1.5 不锈钢除菌滤器清洗不锈钢除菌滤器清洗3.1.6 包装包装59第59页3.1.1 玻璃器皿清洗玻璃器皿清洗组织细胞培养中使用量最大是玻璃器皿。普组织细胞培养中使用量最大是玻璃器皿。普通玻璃器皿清洗包含通玻璃器皿清洗包含浸泡、刷洗、浸酸和冲浸泡、刷洗、浸酸和冲洗洗四个步骤。清洗后玻璃器皿要求洁净、透四个步骤。清洗后玻璃器皿要求洁净、透明、无油迹，且无任何残留物质。明、无油迹，且无任何残留物质。60第60页1、浸泡、浸泡 新瓶使用前都需要先新瓶使用前都需要先用清水浸泡，以软化和溶用清水浸泡，以软化和溶解附着物。新玻璃器皿在解附着物。新玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面生产过程中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些对细呈碱性，并带有一些对细胞有毒物质（如铅和砷等）胞有毒物质（如铅和砷等），同时常有许多灰尘。可，同时常有许多灰尘。可先用自来水简单刷洗，后先用自来水简单刷洗，后用稀盐酸浸泡过夜。培养用稀盐酸浸泡过夜。培养后器皿马上浸入水中方便后器皿马上浸入水中方便刷洗。刷洗。61第61页2 2、刷洗、刷洗 将浸泡后玻璃器皿放到清洗剂溶液中，用软毛将浸泡后玻璃器皿放到清洗剂溶液中，用软毛刷沾洗涤剂重复刷洗以去除器皿内外表面杂质。刷沾洗涤剂重复刷洗以去除器皿内外表面杂质。需注意两点：一是预防损伤器皿表面光洁度以需注意两点：一是预防损伤器皿表面光洁度以免影响细胞生长；二是不能有死角。免影响细胞生长；二是不能有死角。62第62页3、浸酸、浸酸 清洗液由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制而清洗液由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制而成，含有很强氧化作用，去污能力很强，对成，含有很强氧化作用，去污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用。这是关键一个步骤。玻璃器皿无腐蚀作用。这是关键一个步骤。在配制清洗液时候要小心，注意安全，预防在配制清洗液时候要小心，注意安全，预防烧伤皮肤及烧坏衣服。烧伤皮肤及烧坏衣服。63第63页4、冲洗、冲洗玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗，使之尽可能不留污染或清洁液水充分冲洗，使之尽可能不留污染或清洁液残迹。冲洗最好用洗涤装置，既省力，效果残迹。冲洗最好用洗涤装置，既省力，效果又好。如用手工操作，则需流水冲洗又好。如用手工操作，则需流水冲洗10次以次以上。上。64第64页3.1.2 胶塞清洗胶塞清洗胶塞清洗胶塞清洗新购置胶塞有大量滑石粉，用自来水洗净，新购置胶塞有大量滑石粉，用自来水洗净，再常规处理。再常规处理。常规清洗方法：水中浸泡常规清洗方法：水中浸泡 2%NaOH煮沸煮沸10-20分钟分钟 自来水冲洗自来水冲洗 1%盐盐酸浸泡酸浸泡30分钟分钟 自来水冲洗自来水冲洗 蒸馏水蒸馏水清洗清洗2-3次次 晾干。晾干。65第65页3.1.3 塑料制品清洗塑料制品清洗塑料自制品现多是采取无毒并已经特殊处理包塑料自制品现多是采取无毒并已经特殊处理包装，打开包装即可用，多为一次性物品。但用装，打开包装即可用，多为一次性物品。但用后如用无菌处理后，尚可重复使用后如用无菌处理后，尚可重复使用2-3次，但次，但不宜过多，再用时依然需要清洗和灭菌处理。不宜过多，再用时依然需要清洗和灭菌处理。66第66页3.1.4 G6除菌滤器清洗新G6除菌滤器置玻璃洗液中浸泡二十四小时，流水迟缓冲洗，至pH值为55左右，然后用4倍蒸馏水迟缓冲洗，再用重蒸馏水迟缓冲洗，烤干，包装消毒备用。用过G6除菌漏斗立即浸泡水中(注意：滤器千万不能干涸)过夜，流水迟缓冲洗二十四小时或更长时间，至滤面基本疏通时，50烤干，滤器再置清洁液中浸泡二十四小时，或装满清洁液自然过滤。流水冲洗及其后处理同新G6除菌滤器。67第67页针头滤器除菌滤器68第68页3.1.5 不锈钢除菌滤器清洗清洗液刷洗新或使用后滤器，然后用流水冲洗，去离子水浸泡，最终用三蒸水浸泡二十四小时，然后干燥。69第69页包装材料有皱纹包装纸、硫酸纸、棉包装材料有皱纹包装纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒及金属消毒筒。布、铝饭盒及金属消毒筒。局部包装。局部包装。全包装全包装 小物品装饭盒，注意期限，小物品装饭盒，注意期限，标明物品名。吸管用脱脂棉将管接口标明物品名。吸管用脱脂棉将管接口端堵塞，装入消毒筒，筒底垫棉花。端堵塞，装入消毒筒，筒底垫棉花。3.1.6 包装包装70第70页7271第71页3.2 消毒消毒细胞培养最大危险是发生培养物细菌、真菌和病毒等细胞培养最大危险是发生培养物细菌、真菌和病毒等微生物污染。污染主要因为操作者疏忽而引发。常见微生物污染。污染主要因为操作者疏忽而引发。常见原因有操作间或周围空间不洁，培养器皿和培养液消原因有操作间或周围空间不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底等。因为相关培养每个步骤失误均毒不合格或不彻底等。因为相关培养每个步骤失误均能造成培养失败，细胞培养每个步骤都应严格恪守操能造成培养失败，细胞培养每个步骤都应严格恪守操作常规，预防发生污染。作常规，预防发生污染。消毒方法分为物理灭菌法（紫外线、电离辐射、湿热、消毒方法分为物理灭菌法（紫外线、电离辐射、湿热、干热、过滤等）和化学消毒法（各种化学消毒剂）两干热、过滤等）和化学消毒法（各种化学消毒剂）两类。类。72第72页3.2.1 3.2.1 物理消毒法物理消毒法1 1、紫外线消毒、紫外线消毒2 2、电离辐射消毒、电离辐射消毒3 3、湿热消毒、湿热消毒4 4、干热消毒、干热消毒5 5、过滤除菌、过滤除菌73第73页(1)(1)紫外线消毒紫外线消毒 紫外线消毒用于空气、操作台表面和不能使用其它紫外线消毒用于空气、操作台表面和不能使用其它方法进行培养器皿。紫外线直接照射，方便、效果好，方法进行培养器皿。紫外线直接照射，方便、效果好，经一定时间照射后能够毁灭空气中大部分细菌，不过经一定时间照射后能够毁灭空气中大部分细菌，不过真菌抵抗力最强。紫外线直接作用机制是经过破坏微真菌抵抗力最强。紫外线直接作用机制是经过破坏微生物核酸和蛋白质等而使其失活，间接作用是经过紫生物核酸和蛋白质等而使其失活，间接作用是经过紫外线照射产生臭氧杀死微生物。外线照射产生臭氧杀死微生物。紫外线可产生臭氧，污染空气，对试剂及培养液都紫外线可产生臭氧，污染空气，对试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤、眼睛都有伤害。所以，不能有不良影响，对人皮肤、眼睛都有伤害。所以，不能开着紫外灯进行试验操作。开着紫外灯进行试验操作。74第74页紫紫 外外 灯灯75第75页(2)(2)电离辐射消毒电离辐射消毒这主要是指使用放射性核素产生这主要是指使用放射性核素产生X线和加速器等发线和加速器等发出辐射进行灭菌消毒，适合用于消毒量大和不适于出辐射进行灭菌消毒，适合用于消毒量大和不适于作高压或滤过等培养用具，如培养瓶、培养板、注作高压或滤过等培养用具，如培养瓶、培养板、注射器、移液器吸头、离子管等。电离辐射优点是灭射器、移液器吸头、离子管等。电离辐射优点是灭菌时物品不会升温，可直接对密封包装物品进行灭菌时物品不会升温，可直接对密封包装物品进行灭菌。但因为电离辐射诱变作用很强，不适合消毒生菌。但因为电离辐射诱变作用很强，不适合消毒生物材料。物材料。76第76页电离辐射标志电离辐射标志77第77页(3)(3)湿热消毒湿热消毒即高压蒸汽消毒，是一个使用最广泛、效果最好消即高压蒸汽消毒，是一个使用最广泛、效果最好消毒方式。湿热消毒时，消毒物品不能装得过满，应毒方式。湿热消毒时，消毒物品不能装得过满，应确保其内气体流通，以预防消毒器内气体阻塞而发确保其内气体流通，以预防消毒器内气体阻塞而发生危险。生危险。78第78页干热消毒法是将电热烤箱物品加热到干热消毒法是将电热烤箱物品加热到160以上，并以上，并保持保持90-120分钟以杀死细菌和芽孢。该方法主要用分钟以杀死细菌和芽孢。该方法主要用于消毒玻璃器皿。消毒完成后不能够马上将烤箱门于消毒玻璃器皿。消毒完成后不能够马上将烤箱门打开，以免温度骤冷而使箱内玻璃器皿破裂。优点打开，以免温度骤冷而使箱内玻璃器皿破裂。优点是消毒后器皿干燥、易于储存，缺点是是消毒后器皿干燥、易于储存，缺点是升温较慢。升温较慢。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消毒法。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消毒法。(4)(4)干热消毒干热消毒79第79页(5)(5)过滤除菌过滤除菌过滤除菌是将液体或气体用微孔滤过滤除菌是将液体或气体用微孔滤膜过滤，使大于孔径细菌等微生物膜过滤，使大于孔径细菌等微生物颗粒阻留，从而到达除菌目标。颗粒阻留，从而到达除菌目标。80第80页3.2.2 化学消毒法化学消毒法化学消毒法是利用化学消毒剂那些不能用化学消毒法是利用化学消毒剂那些不能用物理消毒法进行消毒物品和场地，如无菌物理消毒法进行消毒物品和场地，如无菌室空气、台面、操作者皮肤等，操作简单，室空气、台面、操作者皮肤等，操作简单，方便有效。方便有效。81第81页我们都知道，细菌是有机生物，它细胞壁和细胞膜是由磷脂质双分子膜组成，带有负电荷；而银作为重金属，带有活性极强阳离子，也就是正电荷。银杀菌作用，首先表现在物理学中讲到“同性电荷相排斥，异性电荷相吸引”。当银在其材料表面释放出大量正电荷后，漂浮在空气中带有负电荷细菌或其它有机生物，就会被吸附到其表面。正负电荷发生反应后，就抑制了细菌呼吸，同时使细菌细胞壁和细胞膜彻底变形破裂，失去繁殖和生存能力，发生“溶解死亡”。；82第82页 另外，重金属本身含有超强降解功效，当细菌被吸附在银表面时，银离子超强降解功效就会破坏细菌胞内酶系统，影响细菌正常新陈代谢，从而使细菌死亡。普通抗生素平均只能对6种病菌起到作用，但银能毁灭650种病菌。83第83页无菌操作技术是细胞培养基本技术，包含无菌操作技术是细胞培养基本技术，包含试验器具和材料准备、培养室和超净工作试验器具和材料准备、培养室和超净工作台消毒、洗手和着装、无菌培养等操作台消毒、洗手和着装、无菌培养等操作等。等。尤其是操作过程中技术利用要规范，无菌尤其是操作过程中技术利用要规范，无菌概念和无菌操作必须贯通整个培养过程一概念和无菌操作必须贯通整个培养过程一直。直。3.3 3.3 细胞培养基本方法细胞培养基本方法84第84页3.3.1 3.3.1 无菌操作技术无菌操作技术细胞在体外培养中最易被微生物感染。所以，预防细胞在体外培养中最易被微生物感染。所以，预防污染是决定细胞培养成败关键。无菌概念和无菌操污染是决定细胞培养成败关键。无菌概念和无菌操作必须贯通整个培养过程一直。作必须贯通整个培养过程一直。85第85页1 试验器具和材料准备试验器具和材料准备依据试验要求，将所需试验器具和材料准备依据试验要求，将所需试验器具和材料准备好，以适当方法进行消毒和灭菌。好，以适当方法进行消毒和灭菌。86第86页无菌培养室天天都要用新洁而灭拖洗地面一次，紫无菌培养室天天都要用新洁而灭拖洗地面一次，紫外线照射消毒外线照射消毒30-50分钟，超净工作台面每次试验前分钟，超净工作台面每次试验前要用要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒酒精擦洗，然后紫外线消毒30分钟。一些分钟。一些操作用具要经过操作用具要经过75%酒精擦洗后可置于台内同时进酒精擦洗后可置于台内同时进行紫外线照射消毒，不过台面上用具不要放置过多行紫外线照射消毒，不过台面上用具不要放置过多或重合放置，以免降低消毒效果。且勿使培养细胞或重合放置，以免降低消毒效果。且勿使培养细胞和培养液受到紫外线照射。和培养液受到紫外线照射。2 培养室和超净台消毒培养室和超净台消毒87第87页3 洗手和着装洗手和着装进行操作前要更换消毒无菌服、帽子和口罩，进行操作前要更换消毒无菌服、帽子和口罩，以以75%酒精消毒手和前臂。试验过程中手触酒精消毒手和前臂。试验过程中手触及可能污染物品和出入培养室都要重新用消及可能污染物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。平时仅做观察时可着经紫外线照毒液洗手。平时仅做观察时可着经紫外线照射射30分钟后普通工作服。分钟后普通工作服。88第88页培养操作基本要领和要求培养操作基本要领和要求无菌操作无菌操作 成功或失败首要条件成功或失败首要条件培养前准备培养前准备 操作卡片操作卡片 用具置于场地，然后消毒用具置于场地，然后消毒操作野消毒操作野消毒洗手和着装洗手和着装火焰消毒火焰消毒89第89页4 无菌培养操作无菌培养操作培养操作培养操作动作准确灵敏动作准确灵敏不用手触及已消毒物品不用手触及已消毒物品操作面布局合理操作面布局合理操作保持一定次序操作保持一定次序培养用瓶和吸管放置培养用瓶和吸管放置预防各种用液交叉污染预防各种用液交叉污染不向操作者讲话或咳嗽不向操作者讲话或咳嗽90第90页8091第91页9392第92页9793第93页3.4.1 3.4.1 相差显微镜观察相差显微镜观察培养细胞在生活状态下靠近透明，结构之间反差培养细胞在生活状态下靠近透明，结构之间反差很小，所以必须借助于能够增强结构之间反差相很小，所以必须借助于能够增强结构之间反差相差显微镜才能更加好地观察活细胞生长情况。差显微镜才能更加好地观察活细胞生长情况。3.4 3.4 培养细胞观察培养细胞观察94第94页95第95页(1)(1)相差显微镜工作原理相差显微镜工作原理相差显微镜是利用细胞内各结构密度不一样而对光产生折射率由差异原理，即光波在折射率大物体中比在折射率小物体中前进距离较短，此距离差异叫光程差，因为光程差引发光相位改变称为相位差或相差。使用相差显微镜可使用肉眼不能分辨相位查变为可分辨振幅差（即敏感差），使无色透明物体在镜下反差显著、影像清楚。96第96页(2)相差显微镜镜装置（1）环状光阑（2）相板（3）中心望远镜97第97页3.4.2 培养细胞观察(1)细胞计数法细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度一个方法。98第98页(3)细胞分裂指数(4)细胞贴壁率(5)细胞周期(6)MTT比色法测定细胞活力(2)细胞生长曲线99第99页3.3 细胞培养中惯用染色方法细胞培养中惯用染色方法3.3.1 活体染色活体染色体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂（即活体染料）对活组织或细胞进行染色而不（即活体染料）对活组织或细胞进行染色而不影响细胞生命活动一个方法。影响细胞生命活动一个方法。100第100页(1)(1)活体染料类别活体染料类别分为碱性活体染料和酸性活体染料两大类。分为碱性活体染料和酸性活体染料两大类。(2)(2)活体染色方法活体染色方法 台酚蓝染色法和吖啶橙荧光染色法台酚蓝染色法和吖啶橙荧光染色法101第101页3.3.2 染料排除检测法 死细胞细胞膜通透性改变，染料进入不能排出。活细胞能够排出进入细胞内染料。1.台酚蓝排除检测法2.溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法102第102页3.4 细胞培养污染和检测细胞培养污染和检测3.4.1污染路径污染路径空气空气器材器材操作操作血清血清组织样本组织样本103第103页3.4.2 污染对培养影响及检测污染对培养影响及检测污染对细胞影响污染对细胞影响 1、细菌污染、细菌污染培养液浑浊培养液浑浊镜下可见菌体镜下可见菌体2、真菌污染、真菌污染大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面镜下呈丝状、管状或树枝状，纵横交织镜下呈丝状、管状或树枝状，纵横交织104第104页 3、支原体污染、支原体污染最常见、不易觉察最常见、不易觉察大小介于大小介于0.2-2 m，约约1%可经过滤菌器可经过滤菌器对酸耐受性差，对热较敏感，青霉素无效对酸耐受性差，对热较敏感，青霉素无效“正常正常”感觉感觉4、病毒污染、病毒污染5、细胞交叉污染及检测、细胞交叉污染及检测105第105页3.4.3 污染预防1、培养操作前准备2、培养操作时注意事项3、其它注意事项 3.4.4 污染排除1、抗生素应用2、加温处理3、动物体内接种除菌法4、巨噬细胞吞噬法106第106页第二节 动物细胞培养 107第107页 动物细胞与组织培养是从动物体内取出细动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内生理环境，在无菌、适胞或者组织，模拟体内生理环境，在无菌、适温和丰富营养条件下，使离体细胞或者组织生温和丰富营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功效一门技术。存、生长并维持结构和功效一门技术。是动物细胞工程基础。是动物细胞工程基础。动物细胞培养定义动物细胞培养定义108