食品生物技术导论省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

食品生物技术导论食品生物技术导论第1页目 录o第一章第一章 绪绪 论论o第二章第二章 食品与基因工程食品与基因工程o第三章第三章 食品与蛋白质工程食品与蛋白质工程o第四章第四章 食品与酶工程食品与酶工程o第五章第五章 食品与发酵工程食品与发酵工程o第六章第六章 食品与细胞工程食品与细胞工程o第七章第七章 食品生物工程中下游过程食品生物工程中下游过程o第八章第八章 食品生物技术与食品安全检测食品生物技术与食品安全检测o第九章第九章 生物技术与食品工业生物技术与食品工业“三废三废”治理治理第2页第一章第一章 绪绪 论论n第一节第一节 食品生物技术涵义食品生物技术涵义n第二节第二节 食品生物技术研究内容食品生物技术研究内容n第三节第三节 食品生物技术特点食品生物技术特点n第四节第四节 食品生物技术发展简史食品生物技术发展简史n第五节第五节 分子生物学形成和发展分子生物学形成和发展第3页第一节第一节 食品生物技术涵义食品生物技术涵义一、生物技术一、生物技术l所所谓谓生生物物工工程程是是到到达达特特殊殊目目标标生生物物过过程程控控制制性性工工程程 “操操纵纵生生物物（微微生生物物、植植物物、动动物物）细细胞胞、组组织织或或酶酶，进进行行生生物物合合成成及及分分解解转化转化”。二、食品生物技术二、食品生物技术l食食品品生生物物技技术术（food biotechnology）是是利利用用生生物物体体及及其其细细胞胞、亚亚细细胞胞和和分分子子组组成成部部分分，结结合合工工程程学学、信信息息学学等等伎伎俩俩去去研研究究及及加加工工处理或制造食品产品新技术。处理或制造食品产品新技术。第4页第二节第二节 食品生物技术研究内容食品生物技术研究内容一、食品与基因工程一、食品与基因工程l基基因因工工程程又又称称遗遗传传工工程程，它它是是在在体体外外将将异异源源DNA（目目标标基基因因）与与基基因因载体（质粒、病毒等）重组成复制子并转移至宿主细胞过程。载体（质粒、病毒等）重组成复制子并转移至宿主细胞过程。二、食品与酶工程二、食品与酶工程l酶是活细胞产生具高度催化活性和高度专一性生物催化剂。酶是活细胞产生具高度催化活性和高度专一性生物催化剂。l所谓酶工程是把酶或细胞或经过修饰后直接应用于化学反应生物催化所谓酶工程是把酶或细胞或经过修饰后直接应用于化学反应生物催化工程，包含固定化酶、固定化细胞和固定化活细胞体系等。工程，包含固定化酶、固定化细胞和固定化活细胞体系等。l酶工程应用能有效地改造传统食品工业。酶工程应用能有效地改造传统食品工业。第5页三、食品与发酵工程三、食品与发酵工程n发发酵酵工工程程其其涵涵义义是是采采取取当当代代发发酵酵设设备备，使使经经基基因因重重组组技技术术改改良良细细胞胞或或经经其其它它当当代代技技术术改改造造菌菌株株进进行行放放大大培培养养和和控控制制发发酵酵，取取得得工工业业化化生生产产预定食品产品或食品功效成份。预定食品产品或食品功效成份。四、食品与细胞工程四、食品与细胞工程l应用细胞生物学方法，按照人们预定设计，有计划地改造遗传物质和应用细胞生物学方法，按照人们预定设计，有计划地改造遗传物质和细胞培养技术，包含细胞融合技术、细胞拆合技术以及动物、植物大细胞培养技术，包含细胞融合技术、细胞拆合技术以及动物、植物大量控制性培养技术，还包含染色体工程和细胞质工程等内容。量控制性培养技术，还包含染色体工程和细胞质工程等内容。l细胞工程与微生物细胞培养一样，在人工控制条件下在生物反应器中细胞工程与微生物细胞培养一样，在人工控制条件下在生物反应器中大规模培养，取得人类所需要各种食品产品及保健产品大规模培养，取得人类所需要各种食品产品及保健产品 第6页五、食品与蛋白质工程五、食品与蛋白质工程n1983年年美美国国Genex 企企业业KUtrner提提出出蛋蛋白白质质工工程程（protein engineering）概概念念，其其涵涵义义是是指指从从蛋蛋白白质质分分子子结结构构设设计计入入手手，将将待待改改进进蛋蛋白白质质提提纯纯为为结结晶晶，用用x射射线线衍衍射射等等伎伎俩俩研研究究其其空空间间构构象象，确确定定其其需需要要改改变变氨氨基基酸酸残残基基，然然后后再再用用基基因因定定位位突突变变和和体体外外定定向向进进化化等等方方法法到到达达修修饰饰蛋蛋白白质质分分子子空空间结构目标。间结构目标。六、食品与后基因组学六、食品与后基因组学n伴随人类基因组图谱草图绘制成功，为后基因组学（post-genomics）诞生拉开了序幕。而当代研究认为，一个基因能够编码数个蛋白质，随之形成所谓基因组学（genomics）和蛋白质组学（proteomics），近年来，在日本、美国和德国等国又开启了营养基因组学（nutrigenomics）研究。第7页七、食品与食品安全七、食品与食品安全n生生物物技技术术发发展展为为食食品品安安全全检检测测提提供供高高速速高高效效PCR系系统统检检测测技技术术。为为加加强强食食品品安安全全在在食食品品加加工工过过程程除除必必须须严严格格执执行行CAC、HACCP、GMP和和ACP安全体系外。还必须制订切实可行食品安全监督管理体系。安全体系外。还必须制订切实可行食品安全监督管理体系。第8页第三节第三节 食品生物技术特点食品生物技术特点一、食品生物技术与食品产业化紧密相关一、食品生物技术与食品产业化紧密相关l食食品品生生物物技技术术对对改改造造传传统统食食品品工工业业和和农农副副产产品品深深加加工工，含含有有革革命命性性意意义义和和较较大大经经济济价价值值。食食品品生生物物技技术术即即食食品品生生物物工工程程包包含含上上游游工工程程（up stream process）和和下下游游工工程程（down stream process），整整个个过过程程有有多多个个操操作作工工序序，一一环环扣扣一一环环，关关键键技技术术为为生生物物技技术术和和酶酶工工程程，形形成成较较为为完完整整产产业业链链，如图如图1-1所表示。所表示。图图1-1 食品生物技术产业链示意图食品生物技术产业链示意图第9页二、食品生物技术属边缘性交叉学科二、食品生物技术属边缘性交叉学科n生物技术是硕士命科学技术，是生物科学和工程学综合交叉边缘学科。生物技术是硕士命科学技术，是生物科学和工程学综合交叉边缘学科。三、食品生物技术含有三、食品生物技术含有“六高六高”基本特征基本特征l食食品品生生物物技技术术与与其其它它高高新新技技术术一一样样，对对国国民民经经济济发发展展和和食食品品工工业业革革新新含含有有“六六高高”基基本本特特征征：即即高高效效益益，高高智智力力、高高投投入入、高高竞竞争争、高高风风险和高潜力。险和高潜力。四、食品生物技术属高新技术范围四、食品生物技术属高新技术范围l依依据据当当今今世世界界科科技技发发展展对对世世界界经经济济发发展展贡贡献献情情况况。信信息息、能能源源、生生物物技术、航天、材料、汽车和环境等己被列为世界技术、航天、材料、汽车和环境等己被列为世界“七大七大”高科技领域。高科技领域。第10页五、食品生物技术已成为食品科学发展主要研究方向五、食品生物技术已成为食品科学发展主要研究方向n食食品品生生物物技技术术作作为为生生物物技技术术分分支支学学科科，在在自自然然科科学学中中涵涵盖盖范范围围广广为为其其特征。特征。第四节第四节 食品生物技术发展简史食品生物技术发展简史一、史前时期一、史前时期l从从出出土土文文物物发发觉觉，追追溯溯至至距距今今数数千千多多年年前前龙龙山山文文化化时时期期。酿酿酒酒、制制醋醋和制酱等发酵技艺已经发展到世界一流水平。和制酱等发酵技艺已经发展到世界一流水平。第11页二、近代时期二、近代时期n从从19世世纪纪50年年代代开开始始，伴伴伴伴随随欧欧洲洲文文艺艺复复兴兴带带来来科科学学和和工工业业繁繁荣荣。因因为为法法国国科科学学家家巴巴斯斯德德（Pasteur）对对微微生生物物学学创创建建贡贡献献，德德国国科科学学家家柯柯赫赫（Koch）创创造造了了微微生生物物分分离离和和纯纯种种培培养养技技术术和和法法国国学学者者布布合合乃乃尔尔（Buchner）弟弟兄兄俩俩经经过过试试验验揭揭示示了了发发酵酵本本质质是是细细胞胞中中酶酶作作用用。标标志志着着传传统统食食品品生生物物技技术术向向近近代代食食品品生生物物技技术术发发展展。从从传传统统发发酵酵食食品品生生产产靠天然微生物作用靠天然微生物作用。三、当代发展三、当代发展l从从20世世纪纪50年年代代初初开开始始，伴伴伴伴随随生生物物化化学学，遗遗传传学学和和化化学学分分析析技技术术发发展展。尤尤其其是是1953年年“DNA双双螺螺旋旋结结构构”发发觉觉、1969年年酶酶固固定定化化技技术术应应用用结果和结果和1973年基因工程诞生等重大科技成就为标志划时代发展年基因工程诞生等重大科技成就为标志划时代发展 第12页第五节第五节 分子生物学形成和发展分子生物学形成和发展一、细胞学说一、细胞学说n在19世纪中时施莱登和施旺（Schwann）两位学者经过研究绘出相关细胞结构显著图象和细胞组成，从而创建了细胞学说。二、生物进化论二、生物进化论l奥奥地地利利学学者者格格里里哥哥尔尔.孟孟德德尔尔（Gregor Mendel）研研究究认认为为，遗遗传传性性状状是由一对遗传因子决定，是由一对遗传因子决定，第13页四、摩尔根基因学说四、摩尔根基因学说n摩摩尔尔根根提提出出：“物物质质必必须须由由某某种种独独立立要要素素组组成成，正正是是这这些些要要素素我我们们叫叫做遗传因子，或者更简单地叫做基因做遗传因子，或者更简单地叫做基因”。五、基因本质发觉五、基因本质发觉l摩摩尔尔根根提提出出：“物物质质必必须须由由某某种种独独立立要要素素组组成成，正正是是这这些些要要素素我我们们叫叫做做遗遗传传因因子子，或或者者更更简简单单地地叫叫做做基基因因”。多多年年来来研研究究证证实实这这种种转转化化物物质就是质就是DNA，这是基因本质重大发觉。，这是基因本质重大发觉。第14页六、分子生物学诞生六、分子生物学诞生n1953年年美美国国遗遗传传学学家家詹詹姆姆斯斯.沃沃森森（James D.Watson）和和英英国国生生物物物物理理学学家家弗弗朗朗西西斯斯.克克里里克克（Francis crick）依依据据莫莫.休休.弗弗.威威尔尔金金斯斯（M.H.F.wilkins）x-射射线线衍衍射射等等系系列列图图谱谱结结构构分分析析基基础础上上，用用标标度度分分子子模模型型在在英英国国Max Perutz教教授授分分子子生生物物学学试试验验室室进进行行研研究究。其其研研究究结结果果，在在英英国国自自然然杂杂志志上上发发表表DNA结结构构一一文文，提提出出了了“DNA双双螺螺旋旋结结构构模模型型”。首首次次说说明明了了D结结构构与与功功效效，为为遗遗传传信信息息贮贮存存、传传递递和和利利用用提提供供了了科科学学依依据据，创创建建了了当当代代分分子子生生物物学学。这这是是20世世纪纪科科学学史史上上划划时时代代里里程程碑碑。Watson和和crick均均为为诺诺贝贝尔尔奖奖取取得得者者。DNA双双螺螺旋旋结结构构分分子模型如图子模型如图1-1、1-2所表示其结构关键点说明以下：所表示其结构关键点说明以下：图图1-1 DNA分子双螺旋结构模型分子双螺旋结构模型图图1-2 DNA双螺旋结构分子模型双螺旋结构分子模型 第15页n（1）DNA是是由由两两条条极极性性相相反反并并互互补补多多聚聚核核苷苷酸酸链链，围围绕绕中中心心轴轴双双螺螺旋结构。此螺旋为右螺旋，并存在大沟和小沟。旋结构。此螺旋为右螺旋，并存在大沟和小沟。n（2）两两条条链链中中碱碱基基之之间间按按照照A配配对对T、G配配对对C互互补补标标准准，DNA两两链链间间维维系系主主要要靠靠氢氢键键，其其中中A与与T之之间间形形成成二二个个氢氢键键，G与与C之之间间形形成成三三个氢键。个氢键。n（3）双双螺螺旋旋直直径径为为2nm，两两个个相相邻邻碱碱基基间间距距为为0.34nm，每每10个个碱碱基基间间距为距为3.4nm，组成一段完整螺旋结构，其相邻碱基夹角为，组成一段完整螺旋结构，其相邻碱基夹角为36。n（4）两两条条多多聚聚核核苷苷酸酸链链间间碱碱基基配配正正确确互互补补规规律律为为：A配配对对T或或T配配对对A、G配对配对C或或C配对配对G，而且其分子比率为，而且其分子比率为1。第16页n（1）DNA分分子子能能自自我我复复制制依依据据DNA双双螺螺结结构构模模型型，在在两两条条多多聚聚核核苷苷酸酸链链中中，任任何何一一条条都都能能够够作作为为另另一一条条生生物物合合成成模模板板，这这一一点点显显著著地地不不一一样样于于其其它它生生物物大大分分子子。经经过过自自我我复复制制出出来来每每一一个个DNA分分子子中中一一条条链链被被保保留留下下来来。这这种种复复制制，称称为为半半保保留留复复制制（Semi conservative replication）（如图）（如图1-3）。）。n（2）DNA是遗传基因载体是遗传基因载体 能够从分子水平上说明其生物学功效：能够从分子水平上说明其生物学功效：图图1-3 半保留复制示意图半保留复制示意图第17页n（3）DNA双双螺螺旋旋结结构构模模型型为为遗遗传传信信息息保保留留、传传递递和和利利用用提提供供了了基基础础。同同时时，依依据据1970年年Crick等等人人提提出出分分子子生生物物学学中中心心法法则则，如如图图1-4所表示。所表示。n（4）DNA调调整整功功效效1961年年，法法国国分分子子生生物物学学家家F.Jacob和和J.Monod首首次次证证实实在在大大肠肠杆杆菌菌（）基基因因调调整整事事实实，提提出出了了乳乳糖糖操操纵纵子子（Lac Operon）假说。）假说。图图1-4 分子生物学中心法则分子生物学中心法则5l应应用用乳乳糖糖操操纵纵子子假假说说，从从分分子子水水平平上上说说明明基基因因控控制制蛋蛋白白质质诱诱导导合合成成另另一个酶合成调整与酶诱导合成机制不一样，称为酶反馈阻遏。一个酶合成调整与酶诱导合成机制不一样，称为酶反馈阻遏。第18页n第一节 概 述n第二节 工具酶n第三节 目基因制备n第四节 基因载体n第五节 基因重组n第六节 转化、增殖和表达n第七节 基因工程在食品工业中应用n第八节 后基因组学及其应用研究第二章第二章 食品与基因工程食品与基因工程第19页第一节第一节 概概 述述一、基因工程诞生一、基因工程诞生l1973年年S.N.Cohen等等在在美美国国科科学学院院学学报报（PNAS）上上发发表表了了题题为为“Construction of Biological Functional Bacterial Plasmid in Vitro”，说说明明了了体体外外构构建建细细菌菌质质粒粒能能够够在在细细胞胞中中进进行行表表示示，标标志志着着基基因因工工程程诞诞生生 第20页二、基因工程涵义、特点及其操作步骤二、基因工程涵义、特点及其操作步骤n基基因因工工程程（gene engineering）又又称称为为分分子子克克隆隆（molecular cloning）或或重重组组DNA技技术术（recombinant DNA Technology），其其涵涵义义为为：用用酶酶学学方方法法，将将异异源源基基因因与与载载体体DNA在在体体外外进进行行重重组组，将将形形成成重重组组子子DNA导导入入宿宿体体细细胞胞，使使异异源源基基因因在在宿宿体体细细胞胞中中复复制制表表示示，从从而而到到达达改改造造生生物物品品种种或或性性状状，大大量量生生产产出出人人类类所所需需要生物品种和产物。要生物品种和产物。n基因工程操作过程如图基因工程操作过程如图2-1所表示。所表示。图图2-1基因工程操作过程示意图基因工程操作过程示意图2第21页三、基因工程发展三、基因工程发展n1977年英国分子生物学家F.Sanger创造了快速DNA测序技术并首先完成全长5387bp174噬菌体基因组全序列测定。n1982年第一个由基因工程菌生产药品胰岛素已在美国和英国获准使用。n1983年第一个转基因植物培育成功，1992年第一个转基因玉米及转基因小麦植株诞生，1994年转基因番茄上市。1996年完成了酵母基因组DNA（125105bp）全序列测定。人类基因组计划经过20多年努力已宣告草图描绘成功。为后基因组时代诞生拉开了序幕。第22页第二节第二节 工具酶工具酶n在基因工程中应用酶统称为工具酶（在基因工程中应用酶统称为工具酶（enzyme of tools）。）。l一、限制性内切酶种类一、限制性内切酶种类l限制性内切酶有三种类型：限制性内切酶有三种类型：I型酶、型酶、II型酶和型酶和III型酶。型酶。lII型型酶酶分分子子量量较较小小，大大约约20-100kD，是是一一个个简简单单单单功功效效酶酶，作作用用时时无无需需辅辅助助因因子子或或只只需需Mg2+，能能识识别别双双链链DNA上上特特异异核核苷苷酸酸序序列列，同同时时专专一一性性强强，而而且且其其识识别别序序列列与与切切割割序序列列相相一一致致。这这类类酶酶尤尤其其适适合合于于基基因工程操作。因工程操作。l二、限制性内切酶命名二、限制性内切酶命名l1973年，年，H.O.Smith和和Nathaus提出限制性内切酶命名标准提出限制性内切酶命名标准 一、限制性内切酶一、限制性内切酶l限限制制性性内内切切酶酶（restriction endonuclease 简简称称RE）是是一一类类专专一一性性很很强强核酸内切酶核酸内切酶 第23页l三、限制性内切酶作用机制和作用方式三、限制性内切酶作用机制和作用方式n如如图图2-2所所表表示示图图2-2限制性核酸内切酶作用机制限制性核酸内切酶作用机制 l其作用方式及识别位点有以下几个：其作用方式及识别位点有以下几个：l1.识别不一样特异核苷酸序列识别不一样特异核苷酸序列lEcoR I识别识别lHae I识别识别 第24页nAsu I识别识别 nEcoR II识别识别nMbo I识别识别 n注：注：表示切割表示切割5-磷酸二酯键位置。磷酸二酯键位置。n2.识别序列皆含有回文结构识别序列皆含有回文结构n3.切切割割后后形形成成各各种种粘粘性性末末端端或或平平整整末末端端，按按其其切切割割双双链链方方式式可可分分两两种：粘性末端和平整末端。种：粘性末端和平整末端。l限限制制性性内内切切酶酶错错位位切切割割DNA双双链链而而形形成成彼彼此此互互补补单单链链末末端端，称称为为粘粘性末端（性末端（Cohesion ends）。）。第25页n另另一一个个是是在在同同一一位位点点平平齐齐切切割割DNA两两条条链链而而形形成成双双链链末末端端，称称为为平平整整末末端端（Flush ends）。如）。如Alu I识别序列为：识别序列为：l4.切割后形成异源二聚体切割后形成异源二聚体l四、限制性内切酶识别序列及反应系统四、限制性内切酶识别序列及反应系统l限制性核酸内切酶在双链限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别特殊核苷酸序列称为识别序列。上能够识别特殊核苷酸序列称为识别序列。l稀稀切切酶酶（rare cuting enzymes），如如表表2-1所所表表示示，同同裂裂酶酶（isoschizomer）如如表表2-2所表示。同尾酶（所表示。同尾酶（isocaudamer），如表），如表2-3所表示。所表示。第26页表表2-1 部分限制性内切稀切酶部分限制性内切稀切酶2稀切酶切 割 位 点 数识别序列Ad2SV40X174M13mp7PBr322T7TPAA.DFseIGGCCGGCCO30000001NotIGCGGCCGC070000000RsrIICGGWCCG520000110SfiIGGCCN5CCGG031000112SgrICrCCGGyG760001000SwaIATTT/AAAT011010101表表2-2 含有相同切割位点同裂酶含有相同切割位点同裂酶限制性核酸内切酶识别序列及切割位点限制性核酸内切酶识别序列及切割位点AatI，StuIAAGG/CCTBamHI，BstIG/GATCCAccII，FnuDII，MunI，ThaICG/CGBbnIII，ClaIBbuI，SphIAT/CGATGCATG/CAccIII，BspII，MroIT/CCGGABbrPI，PmaCICAC/GTGAcyI，AhaII，AnsII，BbiIIGr/CgyCBcnI，NciIBspRI，HaeIII，PatICC/sGGGG/CCAflI，AuaII，Eco471G/GwCCBstYI，MflI，XhoIIR/GATCyAflII，BfrIC/AATTGCcrI，PaeR71，XhoI，SexIC/TCGAGAhaIII，DraITTT/AAACelII，EspIGC/TnAGCAocI，Bsu361，Crnl,Eco811CC/TnAGGCfoI，HhaICfrI，EaeIGCG/CY/GGCCr第27页AocII，BmyI，Bsp1286，NspII，SduIGdGCh/CDarII，EcoO1091EagI，EclXI，Eco521rG/GnnCCyC/GGCCGAosI，AuiII，PspITGC/GCAEcoT141，StyIC/CwwGGApaLI，SnoIG/TGCACEcoVIII，HindIIIA/AGCTTApyI，BstNI，MvaICC/wGGHapII，HpaII，MspIC/CGGAquI，AvaI，AvrI，NspIIIC/yCrGHincII，HindIIGty/rACAseI，AsnIAT/TAATKsPI，SacII，SstIICCGC/GGAsp7001，XmnIGAAnn/nnTTCNspHI，NsPIrCAtG/yAspHI，HgiAIGwGCw/GPvuI，XorIICGAT/CGAspI，Tth111GACn/nnGTCSacI，SstIGAGCT/CAspI，Cfr131，NspIV，Sau961G/GnCCTaqI，TthHB81XamI，XcyIT/CGAC/CCGGGAsuII，BstBI，NspV，SfuITT/CGAA表表2-3 部分限制性核酸内切同尾酶部分限制性核酸内切同尾酶2黏性末端限 制 性 核 酸 内 切 酶5CATGAflIII，DsaI，NcoI，StyI，BspHI5GATCSau3A，NdeII，BglII，XhoII，BamHI，MleI，BelI5GGCCEclXI，EaeI5CGCGMluI，AflIII，BssHII，DsaI5CCGGCfr10，AgeI，XmaI，AvaI，MorI5TCGASaeI，XhoI，AvaI5GTACSap718，BanI，SphI5CTAGSpeI，NheI，AvrII，StyI，XbaI5CGMaeI，AcyI，HinPI，NarI，HpaII，MspI，TaqI，ClaI，AccI，SfuI5TANdeI，MaeI，MseI，AsnICATG3NlaIII，NspI，SphIAGCT3SacI，BanII，BmyIGGCC3ApaI，BanII，BmyI，AspHITGCA3NsiI，AspHI，BmyI，PstIGCGC3HaeII，BbeI第28页二、基因工程操作中其它酶二、基因工程操作中其它酶（一）、（一）、DNA连接酶连接酶（二）、（二）、DNA聚合酶聚合酶I（三）、碱性磷酸酯酶（三）、碱性磷酸酯酶（四）、（四）、T4多聚核核苷酸激酶多聚核核苷酸激酶（五）、（五）、S1核酸酶核酸酶（六）、反向转录酶（六）、反向转录酶第29页第三节 目基因制备n原原核核生生物物基基因因分分离离多多采采取取前前法法，而而真真核核细细胞胞基基因因分分离离则则采采取取后后两两种种方方法。法。一、生物学方法一、生物学方法l原原核核生生物物中中惯惯用用鸟鸟枪枪射射击击法法或或滔滔弹弹散散射射法法（shotgun cloning）来来克克隆隆分分离离基基因因。此此法法优优点点是是：快快速速简简便便、产产物物纯纯度度高高，是是真真正正天天然然基基因因，兼有外显子和内含子。兼有外显子和内含子。l另另一一个个生生物物学学方方法法是是采采取取分分子子杂杂交交伎伎俩俩。1973年年，Shin和和Martin用用分分子杂交技术分离目标基因取得成功。子杂交技术分离目标基因取得成功。第30页二、化学合成法二、化学合成法化学合成一个循环有以下化学合成一个循环有以下4个步骤：个步骤：l整个合成反应历程如图整个合成反应历程如图2-3表示。表示。图图2-3 固定化亚磷酸三酯法合成寡聚核苷酸固定化亚磷酸三酯法合成寡聚核苷酸第31页三、基因文库法三、基因文库法n基基因因文文库库（gene library）或或称称为为DNA文文库库，它它是是指指用用克克隆隆方方法法将将一一个个生生物物全全部部基基因因组组以以重重组组体体方方式式长长久久保保持持在在适适当当宿宿主主中中。当当需需要要重重组组体体DNA某某一一片片段段时时，便便能能够够在在此此文文库库中中查查找找。基基因因文文库库又又称称为为cDNA文文库库34。cDNA文库构建步骤：文库构建步骤：l1.酶促合成法制取酶促合成法制取cDNAl2.从组织或细胞中制备总从组织或细胞中制备总RNA和和mRNAl3.合成合成cDNA第一条链第一条链第32页l其反应过程为图其反应过程为图2-5所表示。所表示。图图2-5 合成合成cDNA第一链反应过程第一链反应过程第33页l4.cDNA第二条链合成，其反应历程如图第二条链合成，其反应历程如图2-6所表示。所表示。图图2-6 置换法合成置换法合成cDNA反应过程反应过程第34页四、四、PCR扩增法扩增法n1985年年，美美国国Cetus企企业业Mullis等等人人开开发发成成功功聚聚合合酶酶链链式式反反应应（Polymerase chain reaction，PCR）技技术术，这这一一快快速速地地扩扩增增特特异异DNA片片段段系系统统在在分分子子生生物学领域中是一项重大革新。物学领域中是一项重大革新。n其反应历程如图其反应历程如图2-7所表示。所表示。图图2-7 PCR扩增技术基本原理扩增技术基本原理第35页第四节第四节 基因载体基因载体n当当前前，在在基基因因工工程程中中应应用用基基因因载载体体主主要要是是质质粒粒、病病毒毒和和噬噬菌菌体体，它它们们都能担当无性繁殖载体。因为它们均符合作为载体应具备以下条件：都能担当无性繁殖载体。因为它们均符合作为载体应具备以下条件：n（1）本身是一个复制子，能自我复制；）本身是一个复制子，能自我复制；n（2）相对分子质量较小，）相对分子质量较小，n（3）能给宿主细胞（受体细胞）提供可选择标识）能给宿主细胞（受体细胞）提供可选择标识 n（4）只有单一限制性内切酶切点）只有单一限制性内切酶切点一、质一、质 粒粒l质质粒粒（plasmid）存存在在于于细细菌菌、放放线线菌菌及及酵酵母母细细胞胞内内细细胞胞质质中中双双螺螺旋旋共共价价闭闭环环DNA（covalently,closed and circular DNA,缩缩写写为为cccDNA）。它能进行独立复制并保持恒定遗传复制子。它能进行独立复制并保持恒定遗传复制子。第36页（一）质粒载体（一）质粒载体pBR322npBR322是是当当前前应应用用最最广广泛泛人人工工构构建建载载体体之之一一。如如图图2-8所所表表示示5。用用小小写写英英文文字字母母P代代表表质质粒粒，BR表表示示该该质质粒粒 研研究究者者Bolivar 和和Rogigerus，而而322是是详详细细研研究究编编号号。pBR322大大小小为为4363bp，（1bp=1碱碱基基对对）含含有有2个抗生素抗性基因个抗生素抗性基因。npBR322质质粒粒含含有有抗抗菌菌素素抗抗性性基基因因，构构建建pBR325、pBR327如如图图2-9、图图2-10所表示。所表示。图图2-9 pBR325衍生质粒衍生质粒 图图2-10 pBR327衍生质粒衍生质粒第37页（二）质粒载体（二）质粒载体PUCnpUC质质 粒粒 是是 在在 pBR322基基 础础 上上，在在 未未 端端 加加 入入 一一 段段 多多 克克 隆隆 位位 点点（multiple cloning sites,MCS）LacZ基因。基因。二、二、噬菌体噬菌体l噬噬菌菌体体（Phage）是是病病毒毒一一个个，形形态态微微小小，只只能能在在电电子子显显微微镜镜下下才才能能观察到。观察到。三、三、M13噬菌体噬菌体四、病毒四、病毒第38页第五节第五节 基因重组基因重组n基因重组即将目基因（或外源基因）与载体在体外结合构建形成重组子。图图2-11 DNA体外重组方式体外重组方式 第39页第六节第六节 转化、增殖和表示转化、增殖和表示一、转化一、转化1、宿主细胞、宿主细胞2、感受态、感受态3、扩增检筛、扩增检筛n R.K.Saiki和K.B.Mullis分别于1985年和1987年发展了一种“多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）”。n PCR技术操作步骤为：反复将目基因片段进行热变性处理，令其双股链解开；进行反链杂交、退火、形成单链；用Taq DNA多聚酶沿DNA链全程全成出两股双链DNA分子；然后开始第二个反应周期。第40页二、基因表示二、基因表示 克隆克隆DNA最终目标是表示最终目标产物。所以，经过最终目标是表示最终目标产物。所以，经过DNA重组重组技术使特定基因片段在受体细胞内大量增殖，拷贝数目大大增加，就技术使特定基因片段在受体细胞内大量增殖，拷贝数目大大增加，就必须使特点基因深入转录、翻译为对应蛋白质（或酶），进而取得它必须使特点基因深入转录、翻译为对应蛋白质（或酶），进而取得它们代谢产物，这一过程们代谢产物，这一过程称为基因表示。称为基因表示。第七节第七节 基因工程在食品工业中应用基因工程在食品工业中应用一、转基因微生物食品一、转基因微生物食品转基因微生物菌株则称为工程菌（转基因微生物菌株则称为工程菌（engineering strain）。）。第41页（一）应用于提升食品产品品质（一）应用于提升食品产品品质第第一一个个采采取取基基因因工工程程改改造造食食品品微微生生物物为为面面包包酵酵母母（saccharomyces cerevisiae）。1991年年，英英国国政政府府同同意意经经过过了了DNA重重组组面面包包酵酵母母工工程程菌菌商商业业化化应应用用7。在在啤啤酒酒酿酿造造中中一一乙乙酰酰乳乳酸酸经经过过自自发发氧氧化化作作用用形形成成双双乙乙酰酰，双双乙乙酰酰形形成成机机理理及及其其基基因因重重组组控控制制双双乙乙酰酰如如图图2-12、图图2-13所所表示。表示。图图2-12 啤酒酿造中双乙酰形成机理啤酒酿造中双乙酰形成机理图图2-13 啤酒酵母导入啤酒酵母导入-乙酰乳酸脱羧酶基因后双乙酰酶促转化乙酰乳酸脱羧酶基因后双乙酰酶促转化第42页（二）应用于简化工艺，缩短生产周期（二）应用于简化工艺，缩短生产周期近年来，在一个啤酒酵母菌株中表示了一个内源性近年来，在一个啤酒酵母菌株中表示了一个内源性PGUI基因，结果发基因，结果发觉这个重组菌株能够分泌有活性内聚半乳糖酸酶，能够大大缩短葡萄酒过滤觉这个重组菌株能够分泌有活性内聚半乳糖酸酶，能够大大缩短葡萄酒过滤时间。时间。（三）应用于食品抗菌和防腐保鲜（三）应用于食品抗菌和防腐保鲜现将工程菌在食品工业应用较多菌株如列表现将工程菌在食品工业应用较多菌株如列表2-4所表示。所表示。表表2-4 基因工程改良微生物工程菌基因工程改良微生物工程菌工程菌名称n改造方式用 途Lactobacillus修饰细菌素合成乳制品生产、无污染物质生产Lactococcus修饰蛋白酶活性乳制品生产加速干酪熟化n防止噬菌体感染n提升菌种稳定性修饰溶菌酶合成干酪生产，预防杂菌感染第43页Saccharomycesn葡聚糖酶基因导修啤酒酵母中表示啤酒生产，缩短发酵时间Cerevisiae饰豌豆脂肪氧化酶增强面团流变学物性及稳定性Saccharomyces Carlsbergensisn修饰来自Enterobacter aerogenes或Aceto-bacter pasteurianusa-乙酸乳酸脱羧酶基因缩短酿造周期n修饰来自Aspergieeus niger 葡萄糖淀粉酶基因n应用于淀粉降解和低热量啤酒生产n修饰来自Schwanniomyces occidentalis淀粉酶和葡萄糖淀粉酶n应用于淀粉酒精和低热量啤酒生产葡聚糖酶应用于葡聚糖降解和啤酒过滤澄清Saccharomyces Cerevisiaen-1,4-葡聚糖酶基因导入葡萄酒酵母中表示n增加酿制酒果香味n萜类化合物形成（四）应用于食品级酶制剂生产菌改良（四）应用于食品级酶制剂生产菌改良 凝乳酶（凝乳酶（chymosin）是第一个应用基因工程技术把小牛胃中凝乳）是第一个应用基因工程技术把小牛胃中凝乳酶基因转移至细菌或真核微生物生产一个酶。酶基因转移至细菌或真核微生物生产一个酶。现将现将NovoNordisk、Gist-Brocades等企业采取基因工程改良霉菌等企业采取基因工程改良霉菌种列于表种列于表2-5、表、表2-6、表、表2-7。第44页表表2-5 丹麦丹麦Novo Nordisk企业利用基因工程改良产酶微生物菌种企业利用基因工程改良产酶微生物菌种12第45页第46页（5）应用于生产保健食品有效成份）应用于生产保健食品有效成份n现现在在，能能够够采采取取转转基基因因伎伎俩俩，在在动动、植植物物或或其其细细胞胞中中，得得到到基基因因表表示示而而制制造造有有益益于于人人类类健健康康保保健健成成份份或或有有效效因因子子。采采取取基基因因重重组组构构建建军军一一株株高高表表示示单单链链蛋蛋白白2.5-DKG还还原原酶酶，以以加加速速催催化化生生成成维维生生素素C前前体体2-KLG，便可有效地缩短生产维生素，便可有效地缩短生产维生素C生产周期。生产周期。n超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶（SOD）能能有有效效消消除除氧氧自自由由基基，Brehm等等人人将将BStearothermophilusMn-SOD基基因因克克隆隆入入大大肠肠杆杆菌菌中中，其其重重组组体体Mn-SOD在在大大肠肠杆杆菌菌高高效效达达，产产生生SOD占占可可溶溶性性蛋蛋白白49%。采采取取基基因因重重组组技技术术克克隆隆破破囊囊壶壶菌菌（Thraustochy triumroseum）DHA合合成成关关键键酶酶基基因因，进进而而在在酵酵母母真真核核细细胞胞中中表表示示。Anammartet14克克隆隆了了毕毕氏氏酵酵母母9脂肪酸脱饱和酶基因及其调整机制。脂肪酸脱饱和酶基因及其调整机制。第47页（6）应用于食品微生物快速检测）应用于食品微生物快速检测n伴伴随随DNA分分子子检检测测技技术术和和PCR等等技技术术应应用用，可可使使沙沙门门氏氏菌菌、李李斯斯特特氏氏菌、致泻性菌、致泻性E.coli等食源性微生物检测已发展到一个新水平。等食源性微生物检测已发展到一个新水平。二、转基因动物食品二、转基因动物食品l转转基基因因动动物物食食品品是是由由转转基基因因动动物物产产生生食食物物或或利利用用转转基基因因动动物物为为原原料料生生产产食食品品或或食食品品添添加加剂剂。1985年年，第第一一例例转转基基因因家家畜畜研研制制成成功功因因为为转转基基因因家家禽禽及及其其生生产产食食品品是是人人类类较较直直接接食食物物，基基因因重重组组技技术术改改进进牛牛奶奶成成份份如表如表2-8所表示。所表示。第48页表表2-8 基因重组技术改进牛奶成份基因重组技术改进牛奶成份18第49页三、转基因植物食品三、转基因植物食品n所所谓谓转转基基因因植植物物食食品品是是指指由由转转基基因因植植物物产产生生食食物物或或利利用用转转基基因因植植物物为为原原料料生生产产食食品品或或食食品品添添加加剂剂。1983年年，世世界界上上第第一一例例转转基基因因植植物物即即转转抗抗虫虫基基因因烟烟草草