氯唑沙宗杂质的遗传毒性研究.pdf
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1、16氯唑沙宗杂质的遗传毒性研究*刘洋,汪玉馨,王瑶,李晓洁,孟长虹江苏省食品药品监督检验研究院,国家药品监督管理局化学药品杂质谱研究重点实验室,南京2 10 0 19摘要目的:本试验在体外条件下研究氯唑沙宗杂质是否具有遗传毒性,为临床用药安全提供依据。方法:采用Derek和Sarah方法,从定量构效关系(Q)SAR的角度对氯唑沙宗杂质进行分类和评价。对于软件预测结果为阳性的杂质,进一步采用细菌回复突变试验验证上述结果。结果:氯唑沙宗杂质6(CAS:889884-60-0)、杂质7(CAS:2 8 443-50-7)的Derek和Sarah软件预测结果为阳性。细菌回复突变试验中,杂质6、杂质7
2、在1512 50 g/血剂量范围内,在代谢活化系统S9存在或不存在的情况下,五种菌株的回变菌落数均未超过自发回变菌落数2 倍以上,试验结果为阴性。结论:氯唑沙宗杂质6、杂质7 体外细菌回复突变试验结果均为阴性,可以按照非遗传毒性杂质进行控制。关键词遗传毒性杂质;细菌回复突变;氯唑沙宗;定量构效关系中图分类号R927.11;R991文献标志码马A文章编号1673-7806(2024)01-016-04药品在生产合成和贮运过程中可能会引人和产生对人体有害的杂质,由于杂质的存在会带来潜在的安全性风险,需要在充分研究基础上加以有效控制。遗传毒性杂质在很低的浓度下即可诱导基因突变以及染色体的断裂和重排,
3、具有潜在的致癌性2 ,因而是杂质研究和控制的重点。图1中的氯唑沙宗是用于治疗各种急性、慢性软组织(肌肉、韧带、筋膜)扭伤、挫伤,运动后肌肉酸痛,肌肉劳损所引起的疼痛,由中枢神经病变引起的肌肉挛以及慢性筋膜炎3。目前未见文献报导氯唑沙宗杂质的遗传毒性,因此呕需研究氯唑沙宗杂质的遗传毒性,建立适当合理的约束,以确保其临床用药安全。来自欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药品管理局(FDA)的新近指导方针都要求对药品中杂质进行遗传毒性评估,对具有警戒结构的杂质,则需要进行体外基因突变研究4.5。按照ICHM7指导原则的要求,需采用计算机定量构效关系模型(Q)SAR技术对氯唑沙宗杂质进行筛选评估。本文通
4、过Derek和Sarah软件,发现在氯唑沙宗所有杂质中,杂质6 7-氨基-5-氯-2(3H)-苯并嗯唑酮 和杂质7(2-氨基-5-氯苯酚)(图1)存在引起遗传毒性的可能性。进一步采用细菌回复突变试验(鼠伤寒沙门氏*基金项目中国药典药品标准提高(编号2 0 16-10)作者简介刘洋,女,副主任药师E-mail:l i u y a n g 19 8 6 s i n a.c o m*通信作者孟长虹,女,主任药师E-mail:收稿日期2023-09-12修回日期2023-01-18组氨酸营养缺陷型菌株TA97、T A 9 8、T A 10 0、TA102、T A 1535)进行验证。HHHONH2氯唑
5、沙宗杂质6杂质7图1氯唑沙宗和杂质6、杂质7 的化学结构1材料与方法1.1仪器1300A2生物安全柜(美国赛默飞公司);BD115恒温培养箱(德国宾得公司);MLS-3781L-PC全自动高压灭菌器(日本松下电器);SYG-1210恒温水浴锅(美国精骐公司)。1.2主要试剂杂质6 7-氨基-5-氯-2(3H)-苯并唑酮(CAS:889884-60-0,批号:6-RCD-17-4,加拿大TRC公司);杂质7(2-氨基-5-氯苯酚)(CAS:28443-50-7,批号:KKNXL-RS,梯希爱上海化成工业发展有限公司);大鼠肝微粒体S。(批号:6-12 0 2,齐氏生物科技);营养肉汤培养基(批号
6、:19 0 8 2 9,北京陆桥技术股份有限公司);营养琼脂培养基(批号:190902,北京陆桥技术股份有限公司);琼脂粉(批号:2 0 19 0 7 0 1)、辅酶(批号:2 0 19 0 7 31)、1,8-二羟基葱醌(批号:30 0 6 2 9 8 1)均购自国药集团化学制剂有限公司);6-磷酸葡萄糖(批号:WXBC6423V,美国PharmaceuticalandClinicalResearch药学与临床研究VETEL公司);敌克松(批号:SZBD022XV);甲基磺酸甲酯(MMS,批号:P1085020,美国Acros公司);叠氮钠(批号:2 6 6 2 8-2 2-8)、二氨基苏(
7、2-AF,批号:021547)、环磷酰胺(CP,批号:12 0 M1253V)均购自美国Sigma-Aldrich公司。1.3菌株鼠伤寒沙门氏杆菌TA97、T A 9 8、T A 10 0、T A 10 2和TA1535五种菌株,均购自齐氏生物,经鉴定均符合要求。1.4遗传毒性预测软件Derek软件(版本6.0.1,英国)通过系统知识预测杂质的遗传毒性。Sarah软件(版本3.0.0,英国)通过数据模型预测杂质的遗传毒性。1.5细菌回复突变试验方法采用平板掺人法试验,将五种鼠伤寒沙门氏杆菌分别接种于5mL营养肉汤培养基,37 恒温振荡培养10 h。设5个剂量组(12 50、417、139、46
8、、15g/皿),同时设阴性对照组(DMSO),剂量为0.1mL/皿。阳性对照组敌克松(50 g/皿)、叠氮钠(2 g/)、二氨基芬(2 0 g/皿)、环磷酰胺(2 0 0 g/皿),各自分别在有无S9(0.5mL)代谢活化条件下开展。每管分别加人各剂量组溶液0.1mL,增菌液0.1mL,非代谢活化系统加0.5mL磷酸盐缓冲液,代谢活化系统则加0.5mLS9,再加人2.5mL顶层培养基,混匀后迅速倾入底层培养基上,使其均匀分布,每个剂量平行3次,待顶层培养液基凝固后,将平板翻转,所有样本于37 培养48 h,计算菌落数,以(xs)表示。在有或无代谢活化的情况下,受试物所诱发的回复突变菌落数至少在
9、一个菌株上出现浓度依赖性的增加和/或在一个或多个浓度组上出现可重复性的增加,可判定为阳性结果2 结 果2.1(Q)SA R软件预测结果采用Derek和Sarah软件对氯唑沙宗相关杂质进行遗传毒性预测,其中杂质6 和杂质7 的Derek预测结果,分别显示阳性和阴性,Sarah预测结果均为阳性,其余杂质预测结果均为阴性,见表1。杂质6、7(Q)SA R软件预测结果为阳性,存在引起遗传毒性的可能性,需进行进一步毒理试验研究2.2AMES试验结果在抑菌作用预试验中,采用TA97、T A 9 8、TA100、T A 10 2 和TA1535五株菌种,杂质6、杂质7在每皿50 0 0、2 50 0、12
10、50 g剂量组中都具有一定的细菌毒性,依据药物遗传毒性研究技术指导原则,表1氯唑沙宗杂质Derek和Sarah毒性预测结果化合物结构式Derek预测结果Sarah预测结果NCI氯唑沙宗阴性阴性OHH杂质1CI阴性阴性NOHCI杂质2阴性阴性OHNCI杂质3阴性阴性OHH2NCI杂质4阴性阴性HOH杂质5阴性阴性OHCI阳性杂质6阳性(有警示结构)ONH,H2N杂质7阴性阳性HOCIH,杂质:HNCI阴性阴性HOHNBr阴性杂质9阴性福O高剂量选择对细菌毒性作用较低的浓度,因此正式试验选择的浓度为每皿12 50、417、139、46、15g,剂量间隔为3,每个剂量均平行3次。另设阴性对照组(剂量
11、为0.1mL/皿)、阳性对照组,每组均为3皿,结果见表2、表3。从表中可以看出,在加入和不加人代谢活化系统的条件下,五种菌株阳性对照组的回变菌落数均显著增加,超过阴性对照组的2 倍以上,表明试验结果有效。杂质6、7 在加人或不加入代谢活化系统的条件下,五种菌株的回变菌落数均未超过阴性对照组菌落数2 倍以上,并且无剂量一效应关系。在本次试验中,氯唑沙宗杂质6 和杂质7的AMES试验结果为阴性。3讨论药物杂质可能会影响药物的有效性和稳定性,还可能损害患者健康。遗传毒性杂质会直接或间接损害细胞DNA,并产生基因突变具有潜在遗传毒性7.8。因此,为了确保患者用药安全,有必要识别潜在的遗传毒性杂质,并设
12、定限值。中国药典2 0 2 018氯唑沙宗杂质的遗传毒性研究表2氯唑沙宗杂质6 的AMES试验结果(回变菌落数,xS,n=3)TA97TA98TA100TA102TA1535组别(g/)S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9阴性对照94 2345109 8262 19323一阳性对照1828 30701469 1780155725621748 2091343 184125091 528798 122583229341798126 7113 6302 35325一1399923351196317 4431 4一4692 432 4120 9293 1931 3一1597
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