血细胞分离技术.doc
《血细胞分离技术.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《血细胞分离技术.doc(7页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、第十八章 血细胞分离技术(Separation technique of the blood cell)一、原理在体外进行细胞免疫检测时,首先必须进行淋巴细胞的分离。分离淋巴细胞的方法很多,但不管采用哪种方法,均要求分离的淋巴细胞纯度高、产量多,而且不丧失活性,同时也要求分离技术简单、操作方便。外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至上千比一,两类细胞的大小和密度不同,其沉降速度也就不同。红细胞的自然沉降率较快,加入高分子量的聚合物,如明胶、右旋糖酐等还可以加速其凝聚。利用自然沉降法、密度梯度离心法或二者结合,可以将淋巴细胞从血液中分离出来。这种分离出的淋巴细胞一般包括单核细胞。除去单核细胞,
2、可以利用单核细胞的吸附功能,如铁颗粒、玻璃面或尼龙网等,除去(或分离)单核细胞,从而提纯淋巴细胞。二、采血(一)材料与试剂1抗凝剂(1)肝素:肝素是含硫酸基的粘多糖,常用其钠盐或钾盐,它能阻止凝血酶原转化为凝血酶,进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白,从而阻止血液凝固。常用的肝素溶液浓度为1 000U/ml,市售肝素多为100U126Umg。(2)乙二胺四乙酸(EDTA):是一种螯合剂。用生理盐水配制成4的溶液备用。(3)阿氏液(Alsever液),配方如下: 枸橼酸钠(Na3C6H5O75H2O) 0.80g 枸橼酸 0.0325g 葡萄糖 2.05g 氯化钠 0.42g H2O 加至 100.0
3、0ml混匀溶解后,114.3高压蒸汽灭菌10min备用。阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂,又含有细胞生存的营养,所以它既可做抗凝剂,又可做血细胞的保存液。2针头 根据不同动物和采血部位,采用不同型号的针头,用前必须灭菌或消毒。3采血容器 注射器或三角瓶等。4采血动物。(二)操作方法1采血法 各种动物采血方法不一。马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血,猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血,家禽由翼下静脉或心脏采血,兔由心脏或耳静脉采血,犬由颈静脉或四肢静脉采血,豚鼠由心脏采血,小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。2抗凝 采集血液最关键的问题是抗凝,采用什么方法进行抗凝,则根据实验的要求和条件而定。
4、最常用的方法如下:(1)肝素抗凝:采血时,使每ml血液含15U20U肝素即可。计算采集的血液量,按1 000U/ml的量加入肝素,直接放入采血容器中,采血时,边采血边轻轻摇动,使抗凝剂和血液混匀。对于采少量的血液或小动物采血,可直接用注射器抽取一定量的肝素液,再采血直接抗凝。(2)EDTA抗凝:采血前,用灭菌生理盐水将EDTA配制成4溶液,然后按预采血液的量,以每ml血液加入1mg2mg的EDTA的液体量于采血容器内。采血,并不断摇动采血容器,使之混匀。(3)玻璃珠法:预先将适量的玻璃珠(根据采血量多少而定)清洗后,装入采血容器中,灭菌后备用。采血过程中,边采边摇采血瓶,以使小玻璃珠在血液中滚
5、动,以机械地除去纤维蛋白,使血液不能凝固。本法虽较麻烦,但对淋巴细胞的活性影响最小,且可减少血小板的混杂。(4)阿氏液采血:以阿氏液和采血量以11比例采集血液,边采边轻轻摇动采血瓶,使之混匀。用阿氏液采血,除了抗凝外,多用于红细胞的保存。一般在4条件下,阿氏液中保存的红细胞2周其活性和特性不变。三、红细胞的分离技术(一)材料与试剂1肝素等抗凝剂23明胶液 取明胶3g,溶于0.9灭菌盐水100ml中,114.3灭菌10min,冷却后4冰箱保存。临用时,37预热10min。3阿氏液(二)操作方法1采血抗凝,即为红细胞。由于红细胞与白细胞的比例相差悬殊,一般白细胞混杂在其中,忽略不计。2根据红细胞的
6、用途,可做进一步的处理。如计算红细胞,可直接稀释计数。如需做补体结合反应,或其它溶红细胞反应,则需将红细胞进行充分的清洗,以除去附着在红细胞膜表面的血浆。一般用等渗的稀释液连续清洗,2 000r/min离心10min,重复34次。3如需储藏备用,则以阿氏液做抗凝剂采血,混匀后置4冰箱保存,可保存2周,其活性尚可。四、淋巴细胞的分离技术(一)材料与试剂 1淋巴细胞分层液有两种: (1)聚蔗糖泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成401(W/V)水溶液,也有干粉出售。应用时,用蒸馏水配制9溶液。泛影葡胺溶液(Meglumi
7、ni diatrizoici),商品名Vrografin,结构式为3,5二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1去氧甲氨基山梨醇。含量为60或75,每安瓶为20ml装,常用于人的脏器造影。应用时,取60泛影葡胺原液20ml,加双蒸馏水15.38ml,即为33.9泛影葡胺。1.0770.001聚蔗糖泛影葡胺的配制:9聚蔗糖液 24份33.9泛影葡胺液 10份混合即可。必要时,可测比重。需要备用,可用G5漏斗过滤除菌或114.3高压灭菌15min,4保存。一般可保存3个月。如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算:式中dm为分层液的比重,d1和d2分别为9聚蔗糖和33.9泛影葡胺的比重,V1和V2分别为
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 血细胞 分离 技术
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【精***】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【精***】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。