综合实验--化能异养微生物的分离与纯化(实验要求).doc

化能异养微生物的分离与纯化(综合)安排说明：本实验要求以实验小组为单位完成。第8周起，各小组应该下载相关资料，做好预习（器材申报与领用）。集中实验时间：11周13周。11周：提交实验材料要求清单一式两份，一份上交，并根据清单领取器材。12周：开展实验，实验完成后整理实验结果，撰写实验报告。13周：完成整个实验器材归还。本次实验考评占实验总成绩的20%！ 考评内容包括实验纪律、操作技术、实验报告。实验结果组内共用，实验报告自己写。注意：期末实验课成绩=实验考试（卷面成绩、操作各占50%）50%+实验报告20%+综合、设计实验成绩20%+平时成绩10%）第一部分：实验原理及目的要求目的要求1掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。 2学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。4学习平板菌落计数法。 基本原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥，偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；白面曲(发面用的引子)或酒曲或果园土中分离酵母菌。1） 为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。2） 其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品中各类微生物的相互干扰，通常需要使用不同的培养基，进行富集和选择培养。如细菌或放线菌在中性或微碱性环境较多但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10%酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌(如加链霉素25-50g /mL以抑制细菌；添加制霉菌素50gmL或多菌灵30gmL以抑制霉菌)；酵母菌和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5时生长极快。细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以分离酵母菌时只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率，霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前须添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。3） 要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。四大类微生物的分离培养基、培养温度、培养时间见表1。表1 四大类微生物的分离条件样品来源分离对象稀释度培养基名称培养温度（）培养时间/d土样细菌10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨303612土样放线菌10-3，10-4，10-5高氏1号2857土样霉菌10-2，10-3，10-4马丁氏培养基283035面曲或土样酵母菌10-4，10-5，10-5豆芽汁培养基283023细菌分离平板细菌单菌落牛肉膏蛋白胨303712注：本实验的目标在于两项核心实验操作技能（按美国微生物学会核心课程实验操作技能第3条）：1）无菌操作技术包括灭菌技术及保持相关器具的无菌状态；无菌操作技术；获得微生物样本；2）梯度稀释技术估算微生物的数目正确选择和使用移液管和移液装置；正确涂布样本以准确计数；估计所需要稀释的倍数；根据平板计数值推测出起始样本的CFU或PFU。第二部分：综合性实验化能异养微生物的分离纯化（自主实验设计与要求）一、分离四大类微生物（细菌、放线菌、酵母、霉菌），要求每类型微生物各分离到2株菌，纯化后以斜面（8支）的形式交验；计算所采集土壤中的细菌含量（CFU，要求交验计数所用的12块平板）。二、技术达标1.培养基的配制：根据不同微生物的营养需要特点，配制相应的培养基，并进行培养基的验证。2.掌握梯度稀释法、划线法基本技术，其中划线法要求每人独立完成一份。3.对所分离的菌株其菌落特征的表述（列表）。4.小组的管理与合作。三、实验结果与汇报1.综合报告：全组撰写一份综合报告。含预方案（主要是器材计划、时间安排），执行记录，结论以及综合分析。可按需要自行设计表格，规范执行、规范记录。报告的写作，请严格按照我院报告的格式要求，并参考网络课程中“实验报告互评的评分要求”中的相关要求执行。2.个人实验报告：每人一份实验报告，重点报告实验现象、观察思考，结果分析，综合体会等，不涉及方案及实验原理、步骤等的记录。3 实验汇报，以实验小组为单位，制作PPT，交流。小组互评，推优。四、实验安排与完成时间1. 本周完成方案学习与器材申请，并填写附表1、2相关内容。（见附录）本周、下周为集中实验时间，在实验课所安排的时间，由实验老师集中指导。各组也可自行安排实验时间，在实验小班科代表的统一安排下，联系实验室开展实验。2. 完成时间：十五周前。本次练习中建议同学们利用实验室提供的材料，自己练习棉塞的制作。第三部分 实验内容（技术要求参考资料）提示：本次实验所提供的方案仅供参考。各组在达到目的的情况下，可以自行设计自己的方案，但本方案中所提到的实验操作细节，对实验质量的把握很有帮助，值得关注。 材料与用品1.菌源 选定采土地点后，铲去表土层23cm，取310cm深层土壤10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。从面曲中分离酵母菌,也可用酒曲等替代。2培养基 肉膏蛋白胨培养基（）、马丁氏培养基、高氏合成一号培养基、豆芽汁葡萄糖培养基(注意：需要制平板和斜面，划线法所用固体培养基，建议琼脂浓度为22.5%，使平板具有一定的硬度，便于划线操作)3无菌水或无菌生理盐水 配制生理盐水分装于250mL锥形瓶中，每瓶装99mL(或95mL分离霉菌用)，每瓶内装10粒玻璃珠；分装试管，每管装约4.55mL(不超过试管高度的1/5)。4其他试剂与用品 无菌培养皿、无菌移液管、无菌涂棒(刮刀)、称量纸、药匙、洗耳球、10酚溶液。各组根据实验要求，统计后以表格形式申报所需要材料（参考表2） 1 微生物的分离及纯化培养微生物的分离与纯化常用技术主要包括稀释分离法、划线分离法。稀释分离法将样液进行梯度稀释后，结合所需要分离的菌种特点，选择一定稀释度的样液进行接种培养，或涂布法或混菌法，对已经稀释的样液中的菌体进行培养，获得菌落纯的细胞。划线法可以直接获得单菌落。*稀释分离法 通过稀释，结合平板分离的纯化菌株的方法有倾注法和涂布法两种。本次实验分离细菌、放线菌、霉菌时采用倾注法，酵母菌分离采用涂布法。以下以细菌及放线菌的分离为例说明技术要点：1)细菌的分离 A 制备土壤稀释液 ：称取土样1 g，在火焰旁加入盛有99mL并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中振荡1020min，使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成102稀释度的土壤稀释液，然后按10倍稀释法进行稀释分离。具体操作技术要点如下：取4.5 mL无菌水试管6支，按10-210-7顺序编号，放置在试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套 中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除下段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面，以右手拇指、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰23次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夹在手上，不能乱放在桌上)，将1mL移液管的吸液端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸二次(吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面)，然后准确吸取0.5mL 10-2土壤稀释液（吸管插入稀释液不低于2.5cm反复冲洗10次左右，吸液高于所需要刻度少许，然后提起吸管贴于容器内壁取出所需要体积；靠近液面但不接触液面的情况下将液体缓慢吹出到第二个容器（第一级稀释液所用吸管不得接触第二级稀释液），右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有4.5mL无菌水的试管，依前法在火焰旁拔除试管帽(或棉塞)，将0.5mL 10-2土壤稀释液注入4.5mL无菌水试管内，制成l0-3的土壤稀释液，将此移液管通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。另取一只未用过的无菌移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽。右手持10-3稀释液试管在左手十敲打2030次。混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已很匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出0.5mL 10-3的稀释液置于第二支装有4.5 mL无菌水试管中，制成10-4土壤稀释液。同法再制成 10-5、10-6、10-7的土壤稀释液(为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，最好每一个稀释度更换一支移液管)。用完的移液管重新放人纸套内。最后应该统一待灭菌后，再洗刷或将用过的移液管放在废弃物筒中用3%-5%来苏尔浸泡l h后再洗涤。 B 倾注法分离 取无菌培养皿69套，分别于培养皿底面按稀释度编号。稀释完毕后，可用原来的移液管从菌液浓度最小的10-7土壤稀释液开始吸取1mL稀释液，按无菌操作技术加到和应编号的无菌培养皿内。再依同方法分别吸取1mL l0-6、10-5的土壤稀释液，各加到和应编号为10-6、10-5的无菌培养皿内。将已灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷却至4550左右(医学标准的要求是451 )，分别倾入到已盛有I0-5、10-6、10-7土壤稀释液的无菌培养皿内。注意：温度过高易将菌烫死，且皿盖上冷凝水太多，会影响分离效果；低于45培养基易凝固，平板易出现凝块、高低不平。用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入培养基约1215 mL，将培养皿在桌面上轻轻转动（标准要求是:以约15cm直径范围，顺时针方向轻轻移动平皿6次，再以15cm直径范围前后移动平皿6次，并重复往返1次），使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀混匀后静置桌上，待凝。 C 培养 待平板完全冷凝后，将平扳倒置于3537恒温培养箱中，倒置培养2448h观察结果。(2)放线菌、酵母的分离 A 制备土壤稀释液 称取土样l g，加入盛有99mL并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中并加人10滴10酚溶液抑制细菌生长（也可用l的重铬酸钾溶液代替10%酚溶液效果更好)。振荡后静置5min，即成10-2土壤稀释液。B1 倾注法 按前法将土壤稀释液分别稀释为10-3、10-4、10-5三个稀释度，然后用无菌移液管依次分别吸取lmL 10-5、l0-4、10-3土壤稀释液于对应编号的无菌培养皿内，用高氏合成1号培养基依前法倾倒平板，每个稀释度做23个平行培养皿。酵母分离时可选择面曲溶解在生理盐水内，振荡20min，即成10-2的面曲稀释液。若选用果园土样分离酵母，也依前法称取土样，制成10-2壤稀释液。 B2 涂布法 依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45-50的豆芽汁葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取上述l0-6、l0-5、10-4三个稀释度菌悬液0.1mL，依次滴加于对应编号已制备好的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。右手持无菌玻璃涂棒，左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。 C 培养 接种后，将平板倒置于30恒温培养箱中，培养23 d观察酵母培养结果，57d观察放线菌培养结果。1.2划线分离法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。此法将蘸有混合菌悬液（10-2）的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。平板制作方法如前所述。划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍于后方可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20mL培养基（较之一般培养数量稍多），培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。同时，可以增加琼脂的用量到22.5%。有必要时，应该将平板放置于培养箱内24小时左右，除去皿盖上的水珠，并使平板的表面干燥。划线分离主要有连续划线法和分区划线法两种。 (1)连续划线法 连续划线法适用于菌浓度较低的样品的分离。方法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种环上的菌。以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线。划线时平板面与接种环面成3040的角度，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线。接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠)。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温培养箱内培养(可以免培养过程中皿盖冷凝水滴下，重新混乱巳分离的菌落)。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。 (2)分区划线法 平板分四区，故又称四分区划线法，适用于菌浓度较高的样品的分离。划线时每次将平板转动6070划线，每换一次角度，应将接种环上的菌烧灭后，再在上次划线末尾处继续划线。取菌、接种、培养方法与连续划线法相似。分区划线法划线分离的平板分4个区，其中第四区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第四区内划线与l、2、3区线条和接触，应使4区线条与l区线条和平行，这样区与区间线条夹角最好保持120左右。先将接种环沾取少量菌在平板1区划35条平行线，取出接种环，左手关上皿盖将平板转动6070，右手把接种环上多余菌体烧灭，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第二次早行划线。第二次划线完毕，同时再把平皿转动约6070，同样依次划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。本次实验可在分离细菌的平板上选取单菌落。于肉膏蛋白胨平板上再次划线分离，使菌进一步纯化。划线接种后的平板，倒置于30恒温培养箱中培养24h后观察结果。酵母及霉菌的分离方法基本步骤同上，但注意细菌、放线菌、霉菌时可采用倾注法，酵母菌分离采用涂布法。 2微生物菌落计数(平板菌落计数法，细菌) 说明：这一部分的内容，可以结合1中的内容一并完成。含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，根据平板上菌落的数目，推算出每克含菌样品中所含的活菌总数。每克菌样品中微生物的活细胞数(同一稀释度的3个平板上菌落平均数稀释倍数)/含菌样品克数。一般由三个稀释度计算出的每克含菌样品中的总活菌数和同一稀释度出现的总活菌数均应很接近，不同稀释度平板上出现的菌落数应呈规律性地减少。如相差较大，表示操作不精确。菌落计数法要求计数平板中的菌落数以50300为准，通常以第二个稀释度的平板上出现50个左右菌落为好。3其它要求完成的内容3.1平板菌落形态及个体形态观察 从不同平板上选择不同类型菌落用肉眼观察，区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态特征;用接种环试挑菌，看其与基质结合紧密程度;用接种环挑取不同菌落制片，在显微镜下进行个体形态观察;记录所分离的含菌样品中明显不同的各类菌株的主要菌落特征和细胞形态。3.2分离纯化菌株转接斜面(斜面接种) 在分离细菌、放线菌，酵母菌和霉菌的不同平板上选择分离效果较好，认为已经纯化的菌落各挑选一个用接种环接种斜面，操作时注意左手同时拿住平板与斜面试管，单人完成从平板至斜面的转接。将细菌接种于肉膏蛋白胨斜面，放线菌接种于高氏1号斜面，酵母菌和霉菌接种于豆芽汁葡萄糖斜面上。贴好标签，在各自适宜的温度下培养，培养后观察是否为纯种，记录斜面培养条件及菌苔特征。交验后，值得保存的菌株置冰箱保藏，其余灭菌后，将器皿清洗交还实验室。实验报告1. 简述分离微生物纯种的原则及列出分离操作过程的关键无菌操作技术。2. 将记录四大类微生物的分离方法及培养条件填入表中（参考表1，注意标明表序号,表格的说明，下同）。3. 将你所分离的微生物平板菌落计数结果填入表中。4. 将你所分离样品中单菌落菌株的菌落培养特征与镜检形态填入表中。5. 将斜面培养条件及菌苔特征(包括纯化结果是否上交保藏)填入表中。思考题1. 使用倾注法进行稀释分离时为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到4550左右才能倾入到装有菌液的培养皿内?2. 为什么对细菌、放线菌和霉菌的稀释分离采用倾注法，而对酵母菌的稀释分离采用涂布法?3. 划线分离时为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉? 划线时为何不能重叠?4. 在恒温箱中培养微生物时为何培养皿均需倒置?5. 分离某类微生物时培养皿中出现其他类微生物，请说明原因。应该如何进一步分离和纯化；经过次分离的菌种是否皆为纯种，若不纯，应采用哪种分离方法最合适?6. 根据哪些菌落特征可区分细菌、放线菌、酵母菌与霉菌（可参考周德庆版教材）?它们的细胞结构表现在菌落形态上有什么联系？ 实验讨论 附：表格示例表X 分离获得的菌株特征记录表分离日期 地点 分离培养基菌株编号菌落特征镜检形态说明表X平均每克样品所含微生物数培养皿号菌落数每克样品所含菌数表X四大类微生物的斜面培养条件及菌苔特征生科院 2014年秋微生物学综合设计实验实验器材领用申请表器材名称数量规格说明(领用依据)备注器材储置小组长tel: 教师确认附表2 生科院 2014年秋微生物学综合设计实验 实验小组实验安排时间分布情况表时间第 组第 组第 组第 组第 组第 组星期一器材储置地（门号、柜别）说明本表格由各班科代表组织填写,各组填写时应写明实验内容，一般应按计划进行实验。在实验中应管理好所领器材，并于实验完成后交还实验室。班级 实验小班 （注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）