从动物肝脏组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶(由三个不同亚基组装成-为结合酶-等电点为6.2)的技术路线(.ppt
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1、生物大分子的分离纯化和特定酶分离纯化技术路线的设计16级长学制临床三班 范佳祺 常钰涵 赵瑾 冯璞12目录1.研究目的2.主要内容3.研究方法和手段4.文献综述5.工作进度安排6.预期成果22024/6/17 周一1.研究目的锻炼自主学习和查阅文献的能力锻炼设计实验的能力32024/6/17 周一2.主要内容自主设计从生物样品中分离纯化生物大分子的技术路线设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶的技术路线并理解实验各步骤的原理42024/6/17 周一3.研究方法和手段研究方法:文献研究法搜集整理相关研究资料为研究做准备研究手段:以传统文献检索手段为主,辅以网络、数据库等手段,开展资
2、料、搜集数据整理等工作52024/6/17 周一4.文献综述生物大分子的分类:蛋白质、核酸、脂质、糖类接下来分类讲解如何从生物样品中分离纯化以上四类生物大分子的技术路线62024/6/17 周一4.1.1蛋白质的分离纯化分离方法:透析超滤除蛋白质溶液中的小分子化合物浓缩方法:丙酮沉淀、盐析、免疫沉淀纯化方法:电泳、层析72024/6/17 周一4.1.2核酸的分离纯化DNA先将饥饿数天的实验动物杀死以除去肝糖原;然后利用淀粉酶除去多糖;在浓磷酸盐存在下,以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液,以钙盐沉淀DNA,再以草酸钾处理,使之形成DNA钾盐回收,然后用离子交换法吸附DNA,使之与多糖分离;利用去污
3、剂或氯仿-戊/辛醇或苯酚处理后除去蛋白质;利用胰脏核糖核酸酶或钙盐或活性炭除去RNA。82024/6/17 周一4.1.2核酸的分离纯化RNA前四步与DNA的分离纯化方法相同,之后可通过苯酚水溶液抽提或脱氧核糖核酸酶处理除去DNA。可再利用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法提取所需种类RNA。92024/6/17 周一4.1.3脂质的分离纯化利用Folch Method从组织中分离和纯化脂质先配制氯仿/甲醇=2/1(v/v),取组织液1:20的量和氯仿/甲醇一起组织匀浆,分层后在室温下在摇床中摇动15到20分钟匀浆通过滤纸过滤或者离心获得液体在离心获得的液体中加入0.2倍体积(4ml)的水或者0
4、.9%的生理盐水涡旋几秒钟后混匀,然后2000rpm离心得到两相溶液,通过虹吸去掉上层用作神经节苷脂类的分析和有机小的极性分子的分析,如果需要的话用甲醇/水(1/1)的溶液将两相界面洗一到两次,洗的过程不要让甲醇/水与下层混合通过离心和虹吸去掉上层后,下层氯仿相中含有脂质,如果体积在2到3ml以下,则通过真空旋转蒸发器或在氮气下浓缩102024/6/17 周一4.1.4糖类的分离纯化提取:动物多糖和微生物多糖多有脂质包围,一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂,释放多糖。分离:分级沉淀法、金属络合物法、制备性区域电泳、色谱分离法和膜分离法。其中分级沉淀法主要有有机溶剂分步
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