动物寄生虫病PCR诊断技术.doc
《动物寄生虫病PCR诊断技术.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《动物寄生虫病PCR诊断技术.doc(13页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、 动物寄生虫病PCR诊断技术 聚合酶链反映(Polymerase Chain Reaction, PCR)技术是一种既敏感又特异的DNA体外扩增方法,它可将一小段目的DNA扩增上百万倍,其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或仅部分虫体的微量DNA。通过设计种、株特异的引物,此法只扩增出种、株特异的PCR产物,具有很高的特异性。并且PCR技术的操作过程也相对简便快捷,无需对病原进行分离纯化;同时可以克服抗原和抗体连续存在的干扰,直接检测到病原体的DNA,既可用于虫种、株的鉴别,动物寄生虫病的临床诊断,又可用于动物寄生虫病的分子流行病学调查。随着PCR技术的不断完善与发展,它已广泛应用于分子生物学
2、、生物技术、临床医学等各个领域,具有广泛的应用前景。一、实验目的规定掌握PCR诊断技术所涉及实验的基本原理,全面熟悉PCR诊断技术的操作过程,其中涉及寄生虫DNA的提取、PCR引物的设计、PCR条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电泳及结果分析、PCR产物的纯化等等。二、实验仪器和材料(一)寄生虫基因组DNA的提取及纯化1.虫体材料。 单个虫体。2.器具。 超净工作台、恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、旋涡振荡器、微量取液器及配套吸头、微量离心管、一次性注射器、微型眼科镊、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有机架等。3.试剂。(1) 乙二胺四乙酸( Ethylene diaminete
3、tra acetic acid,EDTA)、十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tri (Hydroxymethyl) Aminomethane-HCl,Tris-HCl)、氯化钠、蛋白酶K(25g/l)、异丙醇(80%)、双蒸水、灭菌超纯水等。(2) DNA裂解液:500 mM NaCl 70 l 、100 mM Tris-HCl(pH 8.0)30 l、50 mM EDTA(pH 8.0)150 l、10%SDS 30 l。(3) WizardTM DNA Clean-Up 试剂盒或类似的DNA提取试剂盒。(二)PCR扩增及琼
4、脂糖电泳1材料。 提纯的虫体DNA。2器具。 超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器(2/20/200/1000 l)、PCR扩增仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4/-20冰箱、紫外透射仪、微型离心管(200/500/1500 l)、有机架、一次性手套、透明胶带、量筒(100 ml)、三角瓶(500 ml)等。3试剂。(1) 10PCR Buffer(无Mg2+)、dNTP(2.5 mM each)、ddH2O 、MgCl2(25 mM)、Primers、Ex Taq酶(5 U/ml)、琼脂糖、EB(10mg/ml)、Tris碱、硼酸(Boric acid)、去离子水、EDTA(
5、0.5 mol/L,pH 8.0)、10载样缓冲液。(2) 0.5TBE缓冲液:准确秤取Tris碱5.4g,硼酸2.75g,充足溶解于800 ml去离子水中,加10ml 0.5 mol/L EDTA(pH8.0),用去离子水定容至1000ml。(三)PCR扩增产物的纯化1材料。 PCR扩增产物。2器具。 TGL-16G高速台式离心机;三用电热恒温水箱;微量取液器(2/20/200/1000 l)、琼脂糖电泳系统、微波炉、电子天平、4/-20冰箱、紫外透射仪、微型离心管(500/1500 l)、有机架、透明胶带、一次性注射器、量筒(100ml)、三角瓶(500ml)、手术刀、保鲜纸等。3试剂。
6、琼脂糖;0.5TBE缓冲液;UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒;UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒;异丙醇(80%)等。三、实验方法、环节和操作要领(一) 寄生虫基因组DNA的提取及纯化1.实验原理。 应根据研究目的来决定是从单个虫体还是多个虫体提取基因组DNA。寄生虫虫体的各个部位都可以作为基因组DNA的抽提材料,假如虫体较大的话可取其中部而保存其头部及尾部,以备形态学鉴定以验证其种类。假如虫体较小(小于1 cm),则应使用整条虫体抽取DNA。若虫体特别细小(例如幼虫),可用多条虫体来提取DNA。为了获得高含量、高纯度的DNA,最佳使用新鲜材料。从冻干或50%-70%乙醇保存的寄生虫材
7、料中也可较容易地提取DNA。寄生虫DNA的抽提方法有多种,不同种类的寄生虫虫体都有其最适合的抽提方法,但各种方法的基本原理都同样,即先用机械的方法将虫体组织破碎,然后加入DNA裂解液和蛋白酶K,充足作用后,虫体组织中的细胞膜破裂,蛋白质变性,将虫体基因组DNA释放到溶液中。在裂解过程中,虫体细胞碎片及大部分蛋白质会互相缠绕成大型复合物,后者被DNA裂解液中的SDS包盖,通过离心沉淀,这些复合物会从溶液中沉淀下来,变性剂也同时被除去,从而就可从上清中回收虫体基因组DNA溶液。回收后的虫体基因组DNA液用WizardTM DNA纯化试剂盒进行纯化。纯化时,DNA溶液与纯化试剂盒中的清洗树脂混合后,
8、其混合液在通过微型柱时DNA会结合在柱上,而其它杂质会通过微型柱排出;再用80%异丙醇进行冲洗,去除残余杂质。最后,在微型柱中加入预热的TE缓冲液或超纯水,使结合在微型柱上的DNA充足溶解,通过离心,其洗脱液即为纯化的虫体基因组DNA溶液。2实验方法、环节和操作要领。(1) 虫体材料的解决(若为新鲜或冻干保存的虫体,则不需要此环节)。若虫体较大,用镊子将保存在70%的酒精溶液中的虫体材料取出,剪取其中部,保存其头端或尾端部分。用双蒸水反复吹打冲洗2次后,再用超纯水反复冲洗23次,置于一新的1.5ml的离心管中。若虫体较小,取一整条虫体经如上洗涤解决。对于鸡球虫,将保存在2.5%重铬酸钾溶液的卵
9、囊悬液以2023g离心10min,弃重铬酸钾溶液。以双蒸水重悬,同法离心洗涤三次后,用20%次氯酸钠解决卵囊20min,2023g离心沉淀卵囊,用适量饱和盐水重悬卵囊沉淀,1500g离心10min,上清液加入4倍体积的灭菌双蒸水,3000g离心10min。卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗涤一次。用少量灭菌双蒸水重悬卵囊沉淀,然后将其轻轻地加在0.6M无菌蔗糖溶液之上,2023g离心5min,取上层卵囊加5倍体积的水,3000g离心10min,沉淀再用无菌蔗糖溶液漂浮一次,即可得纯净的卵囊,可立即用于裂解以提取DNA。(2) 虫体材料的裂解。用灭菌且经紫外灯照射过的微型眼科剪刀将虫体组织剪碎,加
10、入280l的SDS裂解缓冲液,轻轻混匀,再加入20l(25g/l)的蛋白酶K溶液。对于原虫如鸡球虫、隐孢子虫,将纯化好的卵囊3000rpm/min 离心10min,去掉大部分上清后加入与卵囊体积相同的玻璃珠,漩涡震荡直到有95卵囊破壁后,即可加入SDS裂解缓冲液及蛋白酶K溶液。混匀后,放于恒温培养箱中,37作用1248 h,其间不时摇动离心管,使虫体组织裂解充足。(3) 虫体DNA的抽提和纯化。一方面进行虫体DNA提取,然后按Promega公司试剂盒WizardTM DNA Clean-Up System使用说明对DNA进行纯化。方法如下: 取出于恒温培养箱中作用了约20小时的离心管,旋涡震荡
11、器震荡混匀,10000rpm离心2min,上清即为虫体DNA溶液。将上清转移至一新的离心管中,加入1ml清洗树脂(按50500l悬液/1 ml清洗树脂的比例),旋涡震荡混匀。 取一支5ml的一次性注射器,去针头,拔出注射器内芯推液筒,接上WizardTM微型柱。 将DNA-树脂混合液所有转移到注射器中,用注射器内芯推液筒,慢慢地将DNA-树脂混合液推过微型柱,排出废液。 将注射器从微型柱上拔出后,拿去注射器内芯推液筒,再将注射器套在微型柱上,向注射器内加入2 ml 柱洗溶液(80%的异丙醇),用注射器内芯推液筒慢慢将洗柱液通过微型柱,以洗涤DNA-树脂样品。 拔去注射器,将微型柱套在洁净的1.
12、5ml离心管上,10000rpm离心20sec,以除去残留的异丙醇。 将微型柱从注射器上转移到一新的离心管上,在柱中央加入3050l预热(6070)的超纯水或1TE缓冲液,静置1 min,10000rpm离心20sec。离心管内的液体即为DNA溶液。可将DNA溶液转移至0.5 ml离心管中于-20冰箱保存备用。(二)寄生虫DNA的PCR扩增及琼脂糖电泳1.实验原理。(1) PCR引物设计。 PCR反映成功扩增的一个关键条件在于寡核甘酸引物的对的设计。PCR引物设计的目的是找到一对合适的寡核甘酸片段,使其能有效地与目的片段两端的序列互补。设计引物时要遵循以下原则: 长度不能太长,也不能太短,一般
13、在1825个碱基左右; G+C含量及Tm值:引物的G+C含量以40%60%为宜。引物的Tm值是指寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下50%寡核苷酸双链的解链温度。PCR引物应保持合理的G+C含量。具有50%G+C的20个碱基的引物其Tm值约界于5662,这可为有效退火提供足够的温度。由于G+C间的氢键数较A+T间多,因此,G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。对于短于20个碱基的引物,Tm值可按Tm=4(G+C)+2(A+T) 计算。而对于较长的引物,Tm值的计算较为复杂。由于PCR扩增的特异性取决于两条引物与相应模板的结合,因此,反映中退火温度应根据两个Tm值折衷选择。 碱基的组成尽量随
14、机,尽量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在;特别是3 末端不应超过3个连续的G或C; 引物内部不应有互补序列,否则引物自身会折叠形成发夹结构或引物自身复性。这样二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若引物自身连续互补碱基达3个以上,就容易形成发夹结构。 两个引物之间不能互补,特别应避免3 末端的互补重叠以防止形成引物二聚体。两个引物不应有4个以上的碱基连续相同或互补; 引物的3 末端应与目的片段完全相配。这对于获得好的扩增结果非常重要。假如能拟定一个保守氨基酸,可将其密码子的前2个碱基作为3 末端。 引物的5末端可不与目的片段互补,可被修饰而不影响扩增的特异性。引物的5末端修饰涉及:加酶切位
15、点,标记生物素、荧光、同位素、地高辛等。还可引入蛋白质结合DNA序列、引入突变位点、引入翻译起始密码子、启动子序列等。所附加的限制性酶切位点应是不会在引物以外的DNA上切割的。为了有效地切割限制性酶切位点,在限制性酶辨认序列的5端常需添加2-3个非特异的额外碱基。 若是设计种或株特异性引物,引物与非特异序列的相似性不能超过70%或有连续8个以上的互补碱基相同。可用DNAstar、MegAlign软件比较相似性,用Oligo50来设计引物。(2) PCR的基本原理。 在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液(Mg2+)的反映混合物中,在热稳定DNA聚合酶的催化下,对一对寡核苷酸引物所界定的D
16、NA片段进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性,退火(复性),延伸三步反映为一周期(cycle),循环进行,使目的DNA片段得以扩增。由于每一周期所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板,故PCR产物以指数方式增长,经30个周期后,特定DNA片段的数量在理论上可增长109倍。在实际应用中,一般多用3035个循环。(3)琼脂糖电泳的基本原理。 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,于沸水中溶解,45开始形成多孔性滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场的作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA,其分子
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 动物 寄生虫病 PCR 诊断 技术
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【快乐****生活】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【快乐****生活】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。