利用实时定量技术通过方法分析相对基因表达差异.doc
《利用实时定量技术通过方法分析相对基因表达差异.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《利用实时定量技术通过方法分析相对基因表达差异.doc(11页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、运用实时定量 PCR技术通过2 -CT 方法分析相对基因表达差异Kenneth J. Livak and Thomas D. Schmittgen Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy. Washington State University, Washington 99164-6534 现在最常用的两种分析实时定量 PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较通过解决的样品和未经解决的样品目的转录本之间的表达差异。 2 - CT 方法是实时定量 PCR
2、 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导,假设及其应用。此外,在本文中我们还介绍了两种 2 - CT 衍生方法的推导和应用,它们在实时定量 PCR 数据分析中也许会被用到。 关键词:反转录 PCR 定量PCR 相对定量 实时PCR Taqman 反转录 PCR ( RT-PCR )是基因表达定量非常有用的一种方法( 1 3 )。实时 PCR 技术和 RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术( 4 , 5 )。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种:绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来拟定我们所感爱好的转录本的拷贝数;相对定量方法则是用来拟定通过
3、不同解决的样品目的转录本之间的表达差异或是目的转录本在不同时相的表达差异。 绝对定量通常在需要拟定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道( 6 9 ),涉及已发表的两篇研究论文( 10 , 11 )。在有些情况下,并不需要对转录本进行绝对定量,只需要给出相对基因表达差异即可。显然,我们说 X 基因在通过某种解决后表达量增长 2.5 倍比说该基因的表达从 1000 拷贝 / 细胞增长到 2500 拷贝 / 细胞更加直观。 用实时 PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。 2 - CT 方法可用于定量 PCR 实验来计算基因表达
4、的相对变化: 2 - CT 公式的推导 , 以及实验设计,有效性评估在 Applied Biosystems User Bulletin No.2(P/N4303859) 中有介绍。用 2 - CT 方法分析基因表达数据在文献中也有报道 (5, 6) 。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。此外,本文还介绍了 2 - CT 两种衍生方法的推导和应用,它们在实时定量 PCR 数据分析中都也许被用到。 2 - CT 方法 2 - CT 方法的推导 PCR 指数扩增的公式是: Xn 是第 n 个循环后目的分子数。 X 0 是初始目的分子数。 Ex 是目的分子扩增效率。 n 是循环数 C T 代表目的
5、扩增产物达成设定阈值所经历的循环数 因此: X T 是目的分子达成设定的阈值时的分子数。 C T,X 是目的分子扩增达成阈值时的循环数。 Kx 是一个常数 对于内参反映而言,也有同样的公式: 用 X T 除以 R T 得到: 对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言, X T 和 R T 的值由一系列因素决定:涉及探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数 K 并不一定等于 1 。 假设目的序列与内参序列扩增效率相同: 或: X N 代表通过均一化解决过的初始目的分子量; C T 表达目的基因和内标基因 C T 值的差异( C T,
6、X -C T,R ) 整理上式得: 最后用任同样本 q 的 X N 除以参照因子( calibrator , cb )的 X N 得到: 在这里 对于一个少于 150bp 的扩增片断而言,假如 Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优化,扩增效率接近于 1 。因此目的序列的量通过内均一化解决之后相对于参照因子而言就是: 1.2 方法的假设和应用 要使 C T 计算方法有效,目的序列和内参序列的扩增效率必须相等。看两个反映是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释后扩增产物 C T 如何变化。 图 1 显示的是 cDNA 样品在 100 倍稀释范围内的实验结果。对于每一个稀释样本,都用
7、GAPDH 和 c-myc 特异的荧光探针及引物进行扩增。计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均 C T 值以及 C T 值,通过 cDNA 浓度梯度的 log 值对 C T 值作图,假如所得直线斜率绝对值接近于 0 ,说明目的基因和内标基因的扩增效率相同,就可以通过 C T 方法进行相对定量。在图 1 中,直线斜率是 0.047 ,因而假设成立, C T 方法可以用来分析数据。假如两个扩增反映效率不同,则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量;或者也可以重新设计引物,优化反映条件使得目的序列和内参序列具有相同的扩增效率。 1.3 内标和参照因子的选择 使用内标基因的目的是为了
8、对加入到反转录反映中的 RNA 进行均一化解决。标准的看家基因一般都可被用作内标基因。适合于实时 PCR 反映内标基因涉及 GAPDH , -actin, 2 -microglobulin 以及 rRNA 。当然,其它的看家基因也同样能被用作内标。我们推荐在应用某一基因作为内标之前一方面确证该基因的表达不会受实验解决的影响。验证实验解决是否对内标基因表达产生影响的方法在 2.2 部分有描述。 方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简朴的设计就是把未经解决的样品作为参照因子( calibrator )。经内标基因均一化解决后,通过 方法计算,目的基因表达差异通过通过解决的样本相对于
9、未经解决的样本的倍数来表达。对于未经解决的参照样, C T 0 ,而 2 0 1 。 所以根据定义,未解决样本的倍数变化为 1 。而对于那些通过解决的样本, 相对于参考因子基因表达的倍数为 。同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异,在这种情况下,一般选 0 时刻的样本作为参照因子。 有些情况下,并不是比较不同解决样本基因表达差异。例如,有的是想看某一器官中特定 mRNA 的表达。在这种情况下,参照因子也许是另一器官中该 mRNA 的表达。表 1 显示了大脑和肾脏总 RNA 中 c-myc 和 GAPDH 转录本的 CT 值。在这一个例子中,大脑被人为的选择为参照因子,通过计算得到肾脏 c-m
10、yc 表达量经 GAPDH 校正后相对于大脑的表达量的结果。尽管相对定量方法可用于这种组织之间的比较,但结果的生物学解释是相称复杂的。不同种类细胞中目的和参照转录本单一的相对量变化也许在任何特定的组织中都存在。 1.4 方法的数据分析 实时定量 PCR 所得到 C T 值可以很容易的输出到表格程序如 Microsoft Excel 中去。为了显示数据分析过程,我们在这里给出了一个基因表达定量的实验数据和样本列表。通过 -actin 均一化解决,我们对目的基因 fos-glo-myc 的表达变化进行了监测。在 8h 的时间范围内,在每一时间点都取 3 个反复样本,每同样本在 cDNA 合成之后都
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 利用 实时 定量 技术 通过 方法 分析 相对 基因 表达 差异
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【天****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【天****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。