赖氨酸乙酰转移酶7的冷冻电镜全长结构分析.pdf
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1、Vol.43 No.9 Sept.2023上海交通大学学报(医学版)JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)http:/上海交通大学学报(医学版),2023,43(9)赖氨酸乙酰转移酶7的冷冻电镜全长结构分析郑国培1,曹骎2,沈键锋11.上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科,上海 200011;2.上海交通大学生命科学技术学院Bio-X研究院,上海 200030摘要 目的利用冷冻电镜技术分析人源性赖氨酸乙酰转移酶7(lysine acetyltransferase 7,KAT7)的全长蛋白结构,获得人源KAT7的轮廓信
2、息。方法使用pGEX-4T1载体和人源KAT7全长基因构建重组蛋白表达质粒pGEX-4T1-GST-KAT7,在原核蛋白表达体系BL21(DE3)中表达KAT7蛋白,使用GST亲和层析获得GST-KAT7重组蛋白;在利用TEV蛋白酶去除GST蛋白标签后,通过HiLoad 16/600 Superdex 75 pg体积排阻色谱进一步分离纯化KAT7蛋白。将获取的蛋白样品利用蛋白质印迹法(Western blotting)对KAT7进行鉴定,使用负染电镜筛选样品并初步观察蛋白形貌;使用冷冻电镜收集数据,利用冷冻电镜数据分析软件CryoSparc挑选蛋白颗粒并分析KAT7全长蛋白的空间结构;通过UC
3、SF Chimera软件将蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)中KAT7的MYST结构域模型(5GK9)、AlphaFold预测模型与生成的结构模型进行匹配分析。结果利用亲和层析成功纯化人源性KAT7的全长蛋白,并通过体积排阻色谱获得高纯度的KAT7蛋白;在通过Western blotting鉴定KAT7后,利用负染电镜、冷冻电镜及单颗粒重构技术初步解析了KAT7全长蛋白的空间结构,并通过三维优化处理获得了分辨率约为10 的初步三维结构模型;KAT7全长蛋白空间结构呈不规则的半环状,已有的MYST结构域模型(PDB:5GK9)可匹配入KAT7全长模型的C端部分,调整后的A
4、lphaFold预测模型也可匹配KAT7全长结构模型。结论利用冷冻电镜技术初步分析了人源性KAT7的全长蛋白空间结构模型。关键词赖氨酸乙酰转移酶;蛋白质翻译后修饰;乙酰化;冷冻电镜技术DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.09.004 中图分类号Q518.2;R34 文献标志码AStructural analysis of full-length lysine acetyltransferase 7 by cryo-electron microscopyZHENG Guopei1,CAO Qin2,SHEN Jianfeng11.Department of Opht
5、halmology,Shanghai Ninth Peoples Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2.Bio-X Institutes,Key Laboratory for the Genetics of Developmental and Neuropsychiatric Disorders,Ministry of Education,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200030,ChinaAbstract Object
6、ive To analyze the full-length protein structure of human-derived lysine acetyltransferase 7(KAT7)using cryo-electron microscopy(Cryo-EM)and to obtain the profile information of human-derived KAT7.Methods The recombinant protein expression plasmid pGEX-4T1-GST-KAT7 was constructed by using the pGEX-
7、4T1 vector and the full-length gene of human-derived KAT7,and the KAT7 protein was expressed in the prokaryotic protein expression system BL21(DE3).The GST-KAT7 recombinant protein was obtained by using GST affinity chromatography.After removing the GST protein tag with TEV protease,KAT7 was further
8、 isolated and purified by HiLoad 16/600 Superdex 75 pg volume exclusion chromatography.The obtained protein samples were identified by Western blotting,and the samples were screened.The protein morphology was observed under negative-stain electron microscopy,and data were collected by using Cryo-EM.
9、The protein particles were selected and the spatial structure of the full-length KAT7 was analyzed with the Cryo-EM analysis software CryoSparc.The MYST structural domain model(5GK9)in the Protein Data Bank(PDB)and AlphaFold prediction model of KAT7 were matched with the generated structural model b
10、y UCSF Chimera software.Results The full-length protein of human-derived KAT7 was successfully purified by affinity chromatography,and high purity KAT7 was obtained by volume exclusion chromatography.After identifying KAT7 by Western blotting,the spatial structure of KAT7 full-length protein was ini
11、tially resolved by Cryo-EM and single-particle reconstruction techniques,and a preliminary three-dimensional structure model with a resolution of about 10 was obtained by three-dimensional optimization.The spatial structure of KAT7 full-length protein was irregular and semi-loop-shaped,and the exist
12、ing MYST domain model(PDB:5GK9)can be matched into the C-terminal part of the KAT7 full-length model.The adjusted AlphaFold prediction model can also 论著 基础研究基金项目 国家自然科学基金面上项目(81972667);上海交通大学医学院“双百人”项目(20191817)。作者简介 郑国培(1996),男,硕士;电子信箱:。通信作者 沈键锋,电子信箱:。Funding Information General Program of National
13、 Natural Science Foundation of China(81972667);“Two-hundred Talents”Program of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine(20191817).Corresponding Author SHEN Jianfeng,E-mail:.10992023,43(9)上海交通大学学报(医学版)Vol.43 No.9 Sept.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)match the KAT7
14、 full-length structure model.Conclusion A preliminary analysis of the spatial structure model of full-length protein of human-derived KAT7 is performed by using Cryo-EM.Key words lysine acetyltransferase;post-translational protein modification;acetylation;cryo-electron microscopy组蛋白乙酰化是一种普遍存在的蛋白质翻译后
15、修饰;当组蛋白乙酰化后,染色质结构和动力学改变,从而影响细胞周期、基因转录、信号转导和细胞代谢等 各 种 细 胞 生 命 活 动1-2。组 蛋 白 乙 酰 转 移 酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)分别对组蛋白添加或去除乙酰化修饰,两者共同调控组蛋白的乙酰化水平3-4。HAT根据不同的结构特点分为4个主要家族:Gcn5/PCAF、MYST、p300/CBP 和 Rtt1095-6。赖氨酸乙酰转移酶 7(lysine acetyltransferase,KAT7)是MYST家族的典型成员;KAT7
16、通常也被称作HBO1、HBOA、MYST2或ZC2HC7,其主要对组蛋白H3和H4进行乙酰化修饰,进而调控基因复制或转录7-8。KAT7具有多种功能,除参与组蛋白乙酰化外,还可以对蛋白质进行丙酰化9和泛素化修饰10。此外,KAT7还具有促进组织特异性基因表达11、促进T细胞发育12、调控细胞衰老7等功能。正常情况下,KAT7介导组蛋白乙酰化,使转录因子结合染色质并调节转录起始13,或 KAT7复合物占据编码区并在转录延伸中起直接作用14。KAT7也可使复制因子乙酰化,改变DNA复制起始复合物中的蛋白质-蛋白质相互作用,从而影响DNA复制15。目前对于KAT7乙酰转移酶复合物在转录激活或抑制中的
17、确切作用机制尚不清楚,KAT7本身的乙酰转移酶活性调节在基因复制或转录中的影响仍需进一步阐明。人源性KAT7具有611个氨基酸残基,主要由2个结构域组成:N端结构域包含1个短的锌指DNA结合域,它 主 要 与 MCM2(minichromosome maintenance complex component 2)和 ORC1(origin recognition complex subunit 1)相互作用;C端为MYST乙酰基转移酶结构域,主要负责结合乙酰辅酶A并催化对应的乙酰化反应16。MYST结构域是MYST家族共有的乙酰转移酶结构域,其在多种 HAT 蛋白如 MYST1(MOF/KAT
18、8)、MYST2(HBO1/KAT7)和 MYST3(MoZ/KAT6A)中高度保守17。HAT通常与支架蛋白和其他辅助蛋白相互作用,形成HAT复合物并发挥功能18。已经鉴定的 KAT7 复合物主要由辅助蛋白MEAF6(MYST/esa1 associated factor 6)、ING4(inhibitor of growth family member 4)或ING5(inhibitor of growth family member 5)以及2种与染色质结合的支架 蛋 白 JADE(jade family PHD finger)和 BRPF(bromodomain and PHD fin
19、ger)组成19。支架蛋白是KAT7 和辅助蛋白的连接点,其相互作用可以调节HAT复合物的底物特异性和活性;KAT7通过与不同的支架蛋白结合形成多种HAT复合物,调控不同组蛋白的乙酰化。例如KAT7-JADE复合物可以使染色质中的组蛋白H3和H4乙酰化,但对H4更有特异性,而KAT7-BRPF复合物则更倾向于乙酰化组蛋白H320-21。目前已有多项晶体结构研究16,22-23阐明了KAT7的MYST结构域,但KAT7的全长蛋白结构仍未被解析。研究24表明,全长KAT7的乙酰化活性低于单独的MYST结构域,说明KAT7的N端结构域可能对KAT7的活性具有调节功能。KAT7具有乙酰化酶活性,其自身
20、也可被乙酰化修饰,如KAT7的Lys199、Lys277和Lys432等位点已被证实可发生乙酰化修饰,并与转录调节功能有关25。目前仍不清楚哪些乙酰转移酶可使KAT7发生乙酰化,KAT7的乙酰化修饰也可能是其自身的内在调节,进而导致KAT7空间结构变化并影响酶活性26。KAT7 的 N 端结构域与MYST结构域的相互作用可能阻碍了其乙酰转移酶活性,而乙酰化、磷酸化、辅因子结合等蛋白质构象变化会使N端结构域和MYST结构域分离并释放MYST结构域的活性。因此,解析全长KAT7的分子结构将有利于揭示KAT7活性调节的机制。多项研究9-12表明,KAT7 在 DNA 复制、基因转录、免疫调节、癌症与
21、衰老等方面具有重要功能。然而,关于KAT7乙酰转移酶激活的机制及其底物特异性,尤其是N端结构域在KAT7酶活性调节中的作用还需要进一步的研究。KAT7的全长结构对于破译KAT7的激活机制、N端与MYST结构域之间的相互作用、辅因子的结合以及基于结构的药物设计至关重要。通过解析KAT7的全长结构,有助于扩展人们对KAT7功能调控的认知,并对药物研发与疾病治疗具有重要意义。1100郑国培,等赖氨酸乙酰转移酶7的冷冻电镜全长结构分析http:/上海交通大学学报(医学版),2023,43(9)1材料与方法1.1实验材料1.1.1主要试剂与仪器DNA聚合酶、限制性核酸内 切 酶、DNA 连 接 酶、三
22、羧 乙 基 膦、Tris 碱(Thermo Fisher Scientific,美国),盐酸(Adamas,中国),氯化钠、十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇、无水乙醇、异丙醇、LB液体培养基、LB固体培养基、磷酸缓冲盐溶液、GST预装色谱柱(生工生物工程上海有限公司),HiLoad 16/600 Superdex 75 pg层析柱(Cytiva,美 国),鼠 源 抗 KAT7 单 克 隆 抗 体(Proteintech,美国),质粒抽提试剂盒(南京诺唯赞医疗科技有限公司),乙酸双氧铀、碳膜铜网(北京中镜科仪技术有限公司)。微量分光光度计(Implen,德国),120 kV 透射电镜(型号 Talos
23、 L120C G2)、200 kV冷冻透射电镜(型号Glacios)、300 kV冷冻透射电镜(型号 FEI Titan Krios G3i)均来自 Thermo Fisher Scientific(美国)。1.1.2菌株与载体pGEX-4T1质粒来自北京擎科生物科技有限公司,大肠埃希菌 DH5 菌种和 BL21(DE3)菌种来自生工生物工程上海有限公司。1.2实验方法1.2.1引物合成和DNA序列测定实验所用引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成,DNA序列测定由上海铂尚生物技术有限公司完成。1.2.2 质 粒 构 建 利 用 PCR 从 人 宫 颈 癌 细 胞 系(HeLa)的 cDNA
24、文库中获得人源性 KAT7全长序列(氨基酸残基:1611)。利用双酶切方法将基因插入含有GST蛋白标签的pGEX-4T1载体中,获得pGEX-4T1-GST-KAT7重组蛋白表达质粒;使用DH5菌种扩增纯化质粒,并通过测序确认序列无误。1.2.3蛋白质表达将pGEX-4T1-GST-KAT7重组蛋白表达质粒转化入BL21(DE3)菌种,并将菌种涂布到含氨苄青霉素抗性的LB平板上,于37 C培养12 h。挑取单克隆加入10 mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基进行菌体扩增,于37 C、220 r/min培养12 h,再将菌液加入1 L相同培养基中继续培养,直到在600 nm波长处的吸光度值达到0
25、.60.8。将培养温度降低至16 C,并在培养基中加入异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG),180 r/min培养12 h,培养完毕后在4 C下通过离心收集菌体。同时表达仅含GST蛋白标签的pGEX-4T1作为对照。1.2.4KAT7蛋白质纯化按如下条件配制平衡缓冲液:20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L三羧乙基膦(tris 2-carboxyethyl phosphine,TCEP),pH 7.4。将收集的菌体在平衡缓冲液中进行超声破碎。于 4 C、17 000g 下离心 30 min 并收集上清液,在GST亲和层析色谱柱上用含20 mmol
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