蔬菜农药残留的快速检测方法原理及检验标准.doc

蔬菜农药残留的快速检测方法原理及检查标准1、目前农药在蔬菜中残留的问题1.1、农药是把“双刃剑”，对促进农业增产有极其重要的作用。但由于农药自身固有的化学属性和对其使用不妥，导致农产品农药残留严重超标，严重危害到广大人民群众的健康。1.2、在我国农药中，70%为有机磷农药，而在我国生产使用的有机磷农药中，70%为剧毒、高毒类，并且较多是严禁在蔬菜作物上使用的。2、 农药中毒事件常有报道，究其因素2.1、农产品不按规定的用药量、次数、方法或安全间隔期施药，或施用不允许在蔬菜上使用剧毒、高毒类农药；2.2、现在标准施行的农药残留测定需要通过有机溶剂提取、净化和用大型分析仪器进行，无法对便宜的蔬菜进行随时随地或快速检测而形成的监管不到位。3、 农药分类：3.1、矿物源农药3.1.1、有效成分起源于矿产无机物和石油的农药。3.1.2、代表有硫酸铜、硫磺、石硫合剂、磷化铝、磷化锌和石油乳剂等。3.2、生物源农药3.2.1、涉及植物源农药和动物源农药及微生物源农药。3.2.2、植物类别有植物毒素、植物内源激素、植物源昆虫激素、拒食剂、引诱剂、驱避剂、绝育剂、增效剂、植物防卫素、易株克生物质等。3.2.3、动物资源开发的农药涉及动物毒素、昆虫激素、昆虫信息素和天敌等。3.3、按作用方式分类3.3.1、胃毒素农药（敌百虫、敌敌畏、甲胺磷、马拉硫磷）3.3.2、触杀性农药（对硫磷、敌敌畏、甲胺磷、马拉硫磷）3.3.3、内吸性农药（乐果、甲胺磷、氧乐果、久效磷）3.3.4、熏蒸性农药（溴甲烷、磷化铝、敌敌畏）3.3.5、特异性农药（乙烯利、毒霉素、灭幼脲）4、 目前所使用的农药按其化学结构大体可以分为以下几类：有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、杂环类化合物、其他（苯氧羧酸类、脲类化合物）等。A、 有机磷类敌敌畏、甲拌磷、乐果、对氧磷、对硫磷、喹硫磷、优杀硫磷、敌百虫、氧化乐果、磷胺、甲基嘧啶磷、马拉硫磷、辛硫磷、亚胺硫磷、甲胺磷、地亚农、甲基毒死蜱、毒死蜱、倍硫酸、杀扑磷、乙酰甲胺磷、巴胺磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、异柳磷、异柳磷等。B、有机氯类 -666、 -666、-666、-666、op -DDE、pp-DDE、op-DDD、pp-DDT、op-DDT、异菌脲、五氯硝基苯、林丹、乙烯菌核利、三氯杀螨醇、功夫、氯硝胺、百菌清、粉锈宁、甲氯菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯等。C、氨基甲酸酯类涕灭威砜、涕灭威亚砜、灭多威、3-羟基呋喃丹、涕灭威、呋喃丹、甲萘威、叶蝉散、仲丁威、速灭威等。d、拟除虫菌酯类联苯菊酯、二氧苯醚菊酯、功夫菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰菊酯、氟氯氰菊酯，戊菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、呋喃菊酯、苄呋菊酯、右旋丙烯菊等。5、 最大残留限量标准最大残留限量（Maximum Residue Limit，MRL）在农畜产品中农药残留的法定最高允许浓度，又称最高残留限量，以每公斤农畜产品中农药残留的毫克数（毫克/公斤）表达。目的：控制食品中过量农药残留以保障食用者安全，对超标的产品采用措施，即严禁食用。执行和指导合理用药，农产品监测超标时，表白未按规定用药。减少国际贸易纠纷，各国均制订本国的MRL。食品中农药最大残留限量标准A、GB2763-2023，规定了387种农药最高残留限量。国家标准作为一项加强农药管理的措施。B、其中，针对蔬菜、水果、茶叶等鲜食农产品农药残留超标多发、易发问题，新标准重点增了蔬菜、水果等鲜食农产品的限量标准。水果农药残留限量增长473项，蔬菜（涉及食用菌）农药最大残留限量增长431项。6、 高毒农药禁限用管理措施6.1、农业部、工业和信息化部、环境保护部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检查检疫总局与2023年6月15日发布第1586号公告，决定对高毒农药采用进一步禁限用管理措施。6.2、停止受理苯线磷、地虫硫磷、甲基硫环磷、磷化钙、磷化镁、磷化锌、硫线磷、蝇毒磷、治螟磷、特丁硫磷、杀扑磷、甲拌磷、甲基异柳磷、克百威、灭多威、灭线磷、涕灭威、磷化铝、氧乐果、水胺硫磷、溴甲烷、硫丹等22种农药新增田间实验申请、登记申请及生产许可证申请；停止批准具有上述农药的新增登记证和农药生产许可证（生产批准文献）。6.3、撤消氧乐果、水胺硫磷早柑橘树，灭多威在柑橘树、苹果树、茶树、十字花科蔬菜，硫线磷在柑橘树、黄瓜，硫丹在苹果树、茶树，溴甲烷在草莓、黄瓜上的登记。6.4、本公告发布前已生产产品的标签可以不再更改，但不得继续在已撤消登记的作物上使用。6.5、自2023年10月31日起，撤消（撤回）苯线磷、地虫硫磷、甲基硫环磷、磷化钙、磷化镁、磷化锌、硫线磷、蝇毒磷、治螟磷、特丁硫磷等10种农药的登记证、生产许可证（生产批准文献），停止生产。6.6、自2023年10月31日起，停止销售和使用。根据以上情况，制定出有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速检测方法，加强对农药残留的快速检测一成为十分必要的监管措施。7、 农药残留重要检测方法有两种：7.1、色谱检测法：色谱检测法用作农残定量分析，可为农药残留执法提供依据。色谱法（涉及气相色谱、液相色谱、气质联用等）。优点：灵敏度高、准确、定性定量；缺陷：成本高、操作复杂、时间较长。7.2、速测仪法：速测仪法只能作为农残定性分析，易于在基层推广等特点，是目前我国控制高毒农药残留的一种有效方法，也是目前国内和我省应用最广泛的农药残留快速检测方法。A、速测仪法的重要优点：1、 该方法具有快速方便、前解决简便、成本较低等优点，合用于现场定性测定，特别适合在蔬菜生产基地、批发市场及农产品检测部门开展快速检测工作。2、 该方法可对有农药残留的蔬菜进行粗筛，将一部分农药残留含量较高的蔬菜控制在市场之外，避免因农药残留发生中毒事件。B、速测仪法的重要缺陷：1、 酶试剂易失活，导致反映不稳定，检测结果误差较大，反复性不好，实际应用中的确认率大约为60%70%左右；2、 存在检测盲区，只能检测有机磷和氨基甲酸酯两类农药，不能检测有机氯类、菊酯和其它类别的剧毒农药；3、 不适合检测葱蒜类、香菜、韭菜、番茄、胡萝卜、茭白、蘑菇、花椒等14种容易出现假阳性的农产品。8、 速测仪的检测方法有两种：1、 速测卡法（纸片法）2、 酶克制率法（分光光度法）9、 两种快速检测方法的技术原理9.1、根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能克制昆虫中枢和周边神经系统中乙酰胆碱酶的活性导致神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，导致昆虫中毒致死的原理而设计。9.2、假如蔬菜中不具有机磷和氨基甲酸酯类农药，乙酰胆碱酶水解后，水解产物可与显色剂反映产生颜色。9.3、假如蔬菜中具有可以克制乙酰胆碱的活性的有机磷和氨基甲酸酯类农药，这种酶就不能被水解，从而无显色反映。9.4、在溶液中加入乙酰胆碱酶和显色剂，用此判断有机磷和氨基甲酸酯类农药残留是否存在。10、 速测卡法（纸片法）1、 试剂1.1、固有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（速测卡）。1.2、pH7.5缓冲液溶液：分别取15.0g磷酸氢二钠与1.59g无水磷酸二氢钾用500mL蒸馏水溶解。2、 仪器2.1、常量天平 有条件配备372恒温装置。3、 分析环节3.1、整体测定法3.1.1、选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见放碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL缓冲溶液，震摇50次，静置2min以上。3.1.2、取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反映，有条件时在37恒温装置中放置10min，预反映后的药片表面必须保持湿润。3.1.3、讲速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置3min，使红色药片与白色药片叠合反映。3.1.4、每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。3.2、表面测定法（粗筛法）3.2.1、擦去蔬菜表面泥土，滴23滴缓冲溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。3.2.2、取一片速测卡，讲蔬菜上的液滴滴在白色药片上。3.2.3、放置10min以上进行预反映，有条件时在37恒温装置中放置10min。预反映后的药片表面必须保持湿润。3.2.4、将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片叠合反映。3.2.5、每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。结果鉴定：1、 结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药克制（为阳性）、未克制（为阴性）表达。2、 与空白对照卡比较，白色药片不变色或略浅蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。3、 对阳性结果的样品，可用其他分析方法进一步拟定具体农药品种和含量。速测卡法（纸片法）注意事项1、有些蔬菜如生姜、葱、蒜、辣椒和番茄等汁液中具有破坏酶活性或者使蓝色产物褪色的物质，解决这类蔬菜时，不要让其汁液太多释放出来，不要剪得太碎，浸提时间不易过长，必要时可采用整枝蔬菜浸提或采用表面测定法进行测定。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可以采用整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。2、试纸上的提取液不可太多而溢出试纸，亦不可太少而使反映不完全。3、最佳将每一批样品解决好后一起加样，一面时间过长蒸干。4、当温度条件低于37，酶反映的速度随之放慢，药片加液后放置反映的时间相对延长，延长时间的拟定，应以空白对照卡用（体温）手指捏3分钟时可以变蓝，即可往下操作。注意样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。5、空白对照卡不变色的因素：一是药片表面缓冲溶液加的少，预反映后的药片表面不够湿润，二是温度太低。6、如有条件，将农药速测卡放在10以下保存效果会更好，每小包产品开封后最佳在三天内用完，如用不完，可放入将有变色硅胶吸潮剂的瓶中密封保存，如发现农药测速卡的红色药片由鲜红橙色变为暗淡的褐红色，说明纸片已吸潮失效。PR-3便携式农药残毒快速检测仪操作环节：1、 接通电源，右侧开关拨至“开”，打开上盖按“START”键预热；2、 当预热达成设立反映温度TEMP时，听到“哗”一声，屏幕显示“TEMP1”，预热结束，等待倒计时；3、 去试纸外模，插入试纸（白片在下端），在白片上分别加1-2滴提取液；4、 再次按“START”键，单片电脑开始“TEMP1”倒计时；5、 当听到连续“哗、哗、哗”声，屏幕显示“CLOS”，提醒合上前盖，进入“TEMP2”倒计时；6、 当听到六声“哗。哗、哗”音，本次操作结束，打开上盖观测试纸颜色变化；7、 试纸显示蓝色为阴性，浅蓝色为弱阳性，白色为阳性；8、 测试完毕，向上取下试纸进行下一次的检测。酶克制率法（分光光度法）1、 试剂1.1、pH8.0缓冲溶液：分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解。1.2、显色剂：分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20m了缓冲溶液溶解，4冰箱中保存。1.3、底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置4冰箱中保存备用。保存期不超过两周。1.4乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，3min的吸光度变化Ao值应控制在0.3以上。摇匀后置4冰箱中保存备用，保存期不超过四天。1.5、可选用由以上试剂制备的试剂盒。乙酰胆碱酯酶的Ao值应控制在0.3以上。2、 仪器2.1、分光光度计或相应测定仪及常量天平。3、 分析环节3.1、样品解决：选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取液瓶中，加入5mL缓冲溶液，振荡1-2min，倒出提取液，静置35min，待用。3.2、对照溶液测试：先于试管中加入2。5mL缓冲溶液，再加入0.1mL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37放置15min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1mL底物摇匀，此时检液开始显色反映，应立即放入仪器比色池中，记录反映3min的吸光度变化值Ao。3.3、样品溶液测试：先于试管中加入2.5mL样品提取液，其他操作与对照溶液测试相同，记录反映3min的吸光度变化值At。结果的表述计算1、 检测结果按公式计算：2、 克制率（%）=（Ao-At）/Ao1003、 式中：Ao对照溶液反映3min吸光度的变化值：4、 At样品溶液反映3min吸光度的变化值：结果鉴定1、结果以酶被克制的限度（克制率）表达。当蔬菜样品提取液对酶的克制率50%时，表达蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阴性结果的样品需要反复检查2次以上。对阳性结果的样品，可用其他方法进一步拟定具体农药品种和含量。酶克制率法注意事项1、 葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，具有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。解决这类样品时，可采用整株（体）蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采用整株（体）蔬菜浸提方法，减少色素的干扰。2、 当温度条件低于37，酶反映的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反映的时间应相对延长，延长时间的拟定，应以胆碱酯酶空白对照测试3min的吸光度变化Ao值在0.3以上，即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。胆碱酯酶空白对照溶液3min的吸光度变化Ao值0.3的因素：一是酶的活性不够，二是温度太低。3、 当吸光度大到无法读取时，说明测定液浑浊有干扰。4、 待测样品放入分光光度计速度的影响。待测样品加入底物后，应立即摇匀，放入测定仪，否则影响数据的准确性。5、 比色杯的透光度影响。保持比色杯的清洁，使比色杯有好的透光度是减少检测误差的必要性。比色杯可定期用乙醇进行清洗。6、 微量移液器的影响。微量移液器要专用，贴上标签，避免交差使用导致实际污染：坚持只吸不进的原则，防止试剂污染。7、药品配制过程中的影响。磷酸盐缓冲液的配制一定要用蒸馏水、纯净水或者离子水，不可使用矿物质水，否则在测量过程中干扰较大，影响准确性。