兰州百合多糖与有氧运动对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾组织的保护机制.pdf
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1、营养卫生 食品科学 2023,Vol.44,No.15 165兰州百合多糖与有氧运动对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾组织的保护机制李守汉1,高文峰1,崔治家2(1.兰州大学体育教研部,甘肃 兰州 730000;2.甘肃中医药大学药学院,甘肃 兰州 730000)摘 要:目的:观察兰州百合多糖(Lanzhou lily polysaccharide,LLP)与有氧运动(aerobic exercise,AE)对糖尿病(diabetes mellitus,DM)模型大鼠肾脏组织保护作用的影响。方法:50 只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(10 只)和DM模型组(40 只),糖尿病模型组腹腔内
2、注射链脲佐菌素(60 mg/kg mb)诱发糖尿病,正常对照组腹腔内注射相同剂量的柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L、pH 4.2)。糖尿病模型建模成功后,将糖尿病模型组分为糖尿病对照组(DM组)、有氧运动组(DMAE组)、LLP给予组(DMLLP组)和综合治疗组(DMLLPAE组),每组10 只。服药组灌胃LLP(每天150 mg/kg mb),未服药组灌胃相应量的蒸馏水。DMAE组与DMLLP AE组大鼠进行6 周游泳训练,于最后一次运动后恢复24 h,然后宰杀所有组大鼠,左心室取血,同时取左右两侧肾脏进行组织病理学观察。结果:与DM组比,DMLLPAE组空腹血糖浓度显著降低(P0.05),
3、血清胰岛素浓度显著升高(P0.05);血清总胆固醇、甘油三酯、血清肌酐和血尿素氮浓度显著降低(P0.05),肾脏SOD活力显著增加(P0.05),MDA浓度显著降低(P0.05),肾组织结构和形态特征得到改善。Western blot检测结果显示,与DM组相比,DMLLPAE组大鼠肾组织Bax/Bcl-2和Caspase-3相对表达量显著下调(P0.05)。结论:LLP联合有氧运动能降低DM大鼠空腹血糖,增加胰岛素的分泌,有效降低DM大鼠血脂水平,增加肾组织抗氧化酶的活性,使肾组织的结构和形态特征得到改善和恢复,明显抑制糖尿病肾脏细胞凋亡。关键词:兰州百合多糖;有氧运动;糖尿病肾病;氧化应激R
4、enal Protective Effects of Lanzhou Lily(Lilium davidii var.unicolor)Polysaccharide and Aerobic Exercise in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats LI Shouhan1,GAO Wenfeng1,CUI Zhijia2(1.Department of Physical Education,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China;2.College of Pharmacy,Gansu University of Ch
5、inese Medicine,Lanzhou 730000,China)Abstract:Objective:To investigate the protective effect of Lanzhou lily polysaccharide(LLP)and aerobic exercise(AE)on the kidney in a rat model of diabetic mellitus(DM).Methods:Fifty Wistar male rats are randomly divided into a normal control group(n=10)and a DM m
6、odel group(n=40).The rats in the diabetic group were intraperitoneally injected with streptozocin(STZ,60 mg/kg mb),whereas those in the control group were given the same amount of 0.1 mol/L citrate buffer solution at pH 4.2.After successful induction of diabetes,the diabetic rats were divided into a
7、 DM control group,a DM+AE group,a DM+LLP group,and a DM+LLP+AE group,each containing 10 animals.LLP was orally given at a dose of 150 mg/kg mb on a daily basis,and the same amount of distilled water was used as control.The rats in the DM+AE and DM+LLP+AE groups were subjected to swimming training fo
8、r six weeks,and allowed to recover for 24 h after the last exercise.Afterwards,all rats were sacrificed and left ventricular blood was collected for biochemical testing.Bilateral kidneys were excised for histopathological observation.Results:Compared with the DM group,fasting blood glucose(FBG)in th
9、e DM+LLP+AE group significantly decreased(P 0.05),serum insulin(INS)concentration significantly increased(P 0.05),and serum total cholesterol(TC),triglyceride(TG),serum creatinine(SCr)and blood urea nitrogen(BUN)significantly decreased(P 0.05).Moreover,the activity of superoxide dismutase(SOD)in the
10、 kidney increased significantly (P 0.05),the content of malonaldehyde(MDA)decreased significantly(P 0.05),and the structure and morphological 收稿日期:2022-06-30第一作者简介:李守汉(1973)(ORCID:0009-0004-9687-7030),男,副教授,硕士,研究方向为运动康复。E-mail:166 2023,Vol.44,No.15 食品科学 营养卫生characteristics of the renal tissue were i
11、mproved.Western blot showed that the renal expressions of Bax/Bcl-2 and caspase-3 were significantly reduced in the DM+LLP+AE group compared with the DM group(P 0.05).Conclusion:Lanzhou lily polysaccharide combined with aerobic exercise can reduce FBG,increase insulin secretion,effectively reduce bl
12、ood lipid levels,increase the activity of antioxidant enzymes in the kidney tissue of diabetic rats,improve and restore the structure and morphological characteristics of the kidney tissue,and significantly inhibit the apoptosis of kidney cells in diabetic rats.Keywords:Lanzhou lily polysaccharide;a
13、erobic exercise;diabetic nephropathy;oxidative stress DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220630-346中图分类号:TS201.4 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)15-0165-07引文格式:李守汉,高文峰,崔治家.兰州百合多糖与有氧运动对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾组织的保护机制J.食品科学,2023,44(15):165-171.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220630-346.http:/LI Shouhan,GAO Wenfeng,CUI Zhijia.
14、Renal protective effects of Lanzhou lily(Lilium davidii var.unicolor)polysaccharide and aerobic exercise in streptozotocin-induced diabetic ratsJ.Food Science,2023,44(15):165-171.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220630-346.http:/糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种具有长期性的代谢紊乱疾病,并
15、伴有多种并发症1,其特点是血糖高,是由胰岛素(insulin,INS)分泌缺陷、INS功能下降或两者同时引起的。INS分泌不足和血液中高浓度葡萄糖的产生还可能造成一些器官衰竭,甚至功能丧失2。DM可通过代谢应激、组织损伤和细胞死亡的自催化循环而导致自由基产生的抑制作用及清除机制受损,从而进一步加剧氧化应激3。糖尿病治疗的主要目标是使血糖、血脂和脂蛋白水平接近正常水平,并清除自由基,使各组织功能得到恢复。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最重要的并发症之一。糖尿病的微血管并发症与高血糖有关,其原因是高血糖通过代谢紊乱导致DN的发生与发展4。DN由多因素导致,
16、而以高血糖、晚期糖基化终产物和氧化应激为主要因素,造成的免疫细胞浸润和肾脏慢性炎症是公认的病理机制5。从植物中提取的多糖由于其低毒性和多种药理活性而受到研究人员的广泛关注6。多糖由单糖单元组成并通过糖苷键连接,其具有的抗糖尿病特性已成为一个重要的研究领域7。已有研究表明,百合多糖既可提高糖代谢酶的活性,促进葡萄糖的摄取和利用;又可增加INS分泌,调节1型糖尿病大鼠的血糖8。兰州百合(Lilium davidii var.unicolor)为多年生鳞茎类草本植物,是百合科百合属川百合的一个变种,仅适宜在兰州周边二阴山区种植;研究发现,兰州百合多糖(Lanzhou lily polysacchar
17、ide,LLP)含有乙酰基葡萄糖与甘露糖结合的结构9,具有治疗支气管扩张、抗肿瘤、抗疲劳、调节免疫、降血糖、抗氧化、抑菌等作用10。目前,运动疗法是一种安全、简单、有效的治疗糖尿病的方法,其有效性已在基础研究和临床应用中得到证实11。然而对LLP与有氧运动(aerobic exercise,AE)降血糖及对糖尿病并发症作用的研究报道较少。本研究旨在研究LLP 与AE结合对糖尿病链脲佐菌素所致糖尿病大鼠空腹血糖、脂质过氧化及肾脏保护作用的影响。1 材料与方法1.1 动物、材料与试剂清 洁 级 健 康 成 年 雄 性 W i s t a r 大 鼠,体 质 量200220 g,来自甘肃中医药大学动
18、物实验中心,合格证号:N062000800000023,生产许可证号:SYXK(甘)2020-0009。兰州百合购自兰州市黄河药材市场。LLP的制备方法:兰州百合废弃鳞茎粉碎(过100 目筛)干燥称质量超声波协同复合酶提取酶灭活抽滤、取上清液4 000 r/min离心15 min,取上清液减压浓缩真空干燥至恒质量兰州百合多糖12。实验前以蒸馏水为溶剂配制成一定浓度样品,4 低温保存,备用。链脲佐菌素(streptozocin,STZ)美国Sigma公司;柠檬酸 北京华越洋生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde
19、,MDA)、INS试剂盒 南京建成生物工程研究所;苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)试剂盒、Western blot二抗 北京索莱宝科技有限公司。1.2 仪器与设备Accu-Chek血糖测定仪 瑞士罗氏集团;血糖仪 美国强生公司;7600-010全自动生化分析仪 日本日立公司;H54AR分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;Biofuge fresco低温离心机 德国Heraeus公司;Vanox光学显微镜 日本Olympus公司;RY-2235病理切片机 徳国Leica公司。营养卫生 食品科学 2023,Vol.44,No.15 1671.3 方法1.3.1 实验分
20、组选取大鼠50 只,遵循相关伦理学要求,所有动物实验均在标准笼中饲养并保持室温(241)、相对湿度(5010)%,自然光照,自由饮食饮水。动物房及用具等定期用紫外灯消毒灭菌。适应性喂养1 周之后随机分为正常对照组(n10)和DM模型组(n40),前者腹腔注射一定剂量(60 mg/kg mb)0.1 mol/L pH 4.2柠檬酸缓冲液,后者腹腔内注射STZ(60 mg/kg mb)诱发糖尿病,48 h后,大鼠出现多饮、多食、多尿,尿液检验试纸检测尿糖为到,再以空腹尾静脉采血,用血糖仪测定大鼠空腹血糖浓度在16.6726.00 mmol/L之间则确认糖尿病建模成功。之后将糖尿病组再分为糖尿病对照
21、组(DM)、有氧运动组(DMAE)、LLP给予组(DMLLP)和综合治疗组(DMLLPAE)4 组。1.3.2 动物运动训练与喂药注射STZ 1 周后,DMAE组和DMLLPAE组大鼠进行6 周游泳训练,水池水温在3436 左右,水深50 cm,为保证游泳期间能够持续活动,大鼠在水面活动的面积平均为250 cm2。每周游泳5 d,游泳时间为:第12周每日40 min,第34周每日60 min,第56周维持在90 min。这两组每日进行游泳训练结束后,用吸水纸将大鼠身体上水擦干并用电吹风机烘干大鼠毛发。糖尿病建模成功后,DMLLP组和DMLLPAE组以LLP 150 mg/kg mb灌胃,用蒸馏
22、水将LLP配制成质量浓度为15 mg/mL溶液,灌服量为1 mL/l00 g mb,每天1 次;正常对照组、DM组、DMAE组每天灌服蒸馏水1 mL/100 g mb。1.3.3 样本采集第6周训练结束后,休息24 h。然后所有组大鼠利用2.5%戊巴比妥纳注射液以50 mg/kg mb注射量腹腔注射麻醉。处死、破腹、左心室取血,离心(3 500 r/min)20 min,取上清液,4 保存备用。血液采集后,进行腹部切口取双肾,一部分肾组织固定于4%中性甲醛溶液中,其余肾组织于80 液氮中保存,以备肾脏组织学观察。1.3.4 生化指标测定血糖测定仪检测空腹血糖(fasting blood glu
23、cose,F B G)浓 度,全 自 动 生 化 分 析 仪 检 测 甘 油 三 酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,SCr)浓度;利用试剂盒检测血清INS浓度、SOD活力和MDA浓度。1.3.5 肾脏组织病理学观察在室温下,肾组织在4%中性甲醛溶液中固定24 h后,从不同的组中采集小部分肾组织,通过梯度乙醇(体积分数分别为70%、80%、90%、95%、100%)系列脱水,然后在二甲苯中脱水透明,嵌入石蜡中,切成4 mm厚的切片。组织
24、切片用HE染色,光学显微镜下观察。1.3.6 Western blot法测定Bax/Bcl-2和Caspase-3的表达量按照总蛋白提取试剂盒说明书裂解肾组织细胞,提取总蛋白。BCA法测定总蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离蛋白质;经湿转将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上;然后将膜用TBST溶液(含质量分数5%脱脂奶粉、0.1%Tween-20)室温封闭2 h。置于稀释一抗中,4 振荡过夜
25、,用TBST溶液洗4 次,在二抗中孵育30 min后,用TBST溶液洗3 次;在暗室中将显色液ECLA和ECLB以体积比1 1混合后覆盖在膜上,12 min后去尽残液,进行曝光。曝光后的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。依不同的发光强度调整曝光条件。用图像分析系统对Western Blot结果进行灰度扫描,以目的蛋白条带灰度值和内参蛋白条带灰度值的比值作为相应样本的蛋白表达量。1.4 数据统计分析采用SPSS 19软件对所有数据进行处理,结果用平均值标准差表示,利用单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)检验结果的差异显著性,P0.05表示差异显
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