12《仪器分析》高效液相色谱法(3课时).doc
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1、章节名 称装 订 线第三篇、色谱分离技术授 课安 排授 课时 数3授 课时 间授 课方 法讲授授 课 教 具教 学目 的1、了解高效液相色谱法特点2、了解高效液相色谱仪教 学重 点高效液相色谱法特点教 学难 点高效液相色谱仪项目十九 现代高效液相色谱仪的认知一、 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法(HPLC)是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术。在常压下操作的液相色谱,分离一个样品往往长达几小时至几十小时,因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速,以缩短分离时间,但是结果失败了。根据液相色谱理论,因为随着流动相流速的提高,板高则增大,所
2、以柱效会显着降低。随着生产技术的提高,人们制成了细小(10m)而高效的填充物,从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小,柱压降显着增大,为了得到合理的流动相流速,使用了高压;输液泵,使流速达到110 mL/min。从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器以及电子技术和计算机技术的应用,70年代以来逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱,以区别于经典液相色谱。与气相色谱相比高效液相色谱具有如下特点:1分析范围广 气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物,它们仅占有机物总数的2
3、0。对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质,目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 2可选择的流动相多 气相色谱采用流动相是惰性气体,它对组分没有亲和力,即不产生相互作用力,仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体,选择余地大,它对组分可产生一定亲和力,并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此,流动相对分离起很大作用,相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数,这为选择最佳分离条件提供了极大方便。3操作温度低 气相色谱一般都在较高温度下进行的,而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。总之,高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点,并用现代化
4、手段加以改进,因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质,例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。二、高效液相色谱仪装 订 线高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分:高压输液系统,进样系统,分离系统和检测系统(图1210)。 图1210 高效液相色谱流程示意图(一)高压输液系统高压输液系统的作用是提供足够恒定的高压,使流动相以稳定的流量快速渗透通过固定相。高压输液系统由贮液器、高压泵、过滤器和梯度洗脱装置组成,其核心部件是高压泵,要求高压泵应具有输出压力高,输出流量恒定,流量设定范围可调。梯度洗脱装置的
5、作用是在分离过程中,按一定的程序连续改变流动相中多种不同性质溶剂的配比,以改变流动相的极性、离子强度或酸度等,从而提高试样的分离效率,缩短分离时间,使色谱峰形得到改善,提高测定的灵敏度和定量的准确度。(二)进样系统在高效液相色谱中,一般采用旋转式六通阀于高压下进样。其优点是进样量可变范围大,耐高压,宜于自动化,但易造成色谱峰柱前扩展。(三)分离系统液相色谱柱一般采用内壁抛光的不锈钢管或厚壁玻璃管。为使工作压力不致过高,柱长都比较短,一般在530cm,柱径为45mm。柱子的填充取决于柱填料的性能,对于生物胶或离子交换树脂等,因遇到溶剂会膨胀,所以必须采用匀浆湿法填充。(四)检测记录系统装 订 线
6、高效液相色谱检测器要求具有灵敏度高、噪声低、线性范围宽、响应快、死体积小等特点,且对温度和流量变化不敏感。但至今还没有一种像气相色谱那样高灵敏度的通用型检测器。因此应当根据试样的性能来选用相适宜的检测器。目前,液相色谱常用检测器有紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光检测器和电化学检测器等。1紫外光度检测器(UV) 其作用原理是依据被分析组份对特定紫外光的选择性吸收,组分浓度与吸光度的关系服从比尔定律。紫外光度检测器具有较高的灵敏度,最小检测限可达g。对温度和流量不敏感,可用于梯度洗脱,几乎所有的高效液相色谱都配有紫外光度检测器。图1211是一种双光路结构的紫外光度检测器光路图。 图1211紫外
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