壳聚糖基碳点纸芯片检测槐米中芦丁含量.pdf
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1、260 2023,Vol.44,No.16 食品科学 成分分析壳聚糖基碳点纸芯片检测槐米中芦丁含量乐 薇,蒙利秀,王 源,覃永薇(武汉工商学院环境与生物工程学院,湖北 武汉 430065)摘 要:基于黄酮类物质芦丁对天冬酰胺热解法制备的荧光碳点有选择性的猝灭作用,研究一种壳聚糖基碳点纸芯片快速检测槐米中芦丁含量的方法。滤纸浸没于含碳点与壳聚糖的铸膜液中,干燥后滤纸表面形成碳点壳聚糖薄膜,获得壳聚糖基碳点纸芯片,直接点样后,样品斑点可限制在一定区域内且显色均匀,在365 nm紫外灯照射下拍照,分析显色斑点的红(R)、绿(G)、蓝(B)值,优化纸芯片的制备条件和检测条件。结果表明优化条件为:铸膜液
2、组成为壳聚糖质量浓度20 mg/mL、碳点质量浓度1.0 mg/mL、样品溶剂为50%乙醇溶液、显色时间20 min,该优化条件下芦丁质量浓度(C)在4120 mg/mL范围时,样品斑点与溶剂斑点的G值差值(G)和C呈线性关系。按该法测得3 批次槐米中芦丁相对含量平均值分别为23.85%、22.83%、20.30%,平均相对标准偏差分别为6.1%、5.6%、6.7%,回收率为91.27%107.5%,与高效液相法测定结果接近。该法简便快速,可用于槐米芦丁含量测定的快速现场测定。关键词:碳点;壳聚糖;纸芯片;芦丁Detection of Rutin in Flower Buds of Sopho
3、ra japonica by Using Chitosan-Based Carbon Dot Paper Chip YUE Wei,MENG Lixiu,WANG Yuan,QIN Yongwei(College of Environmental and Biological Engineering,Wuhan Technology and Buniness Universtity,Wuhan 430065,China)Abstract:Based on the selective quenching effect of the flavonoid rutin on the fluoresce
4、nce of carbon dots prepared by asparagine pyrolysis,a method for rapid detection of rutin content in the flower buds of Sophora japonica by using chitosan-based carbon dot paper chip was developed.A filter paper was immersed in the casting solution of carbon dots and chitosan.After drying,a carbon d
5、ot chitosan film was formed on the surface of the filter paper,so that the chitosan-based carbon dot paper chip was obtained.After samples were dripped on the chip,chromogenic reaction occurred uniformly within a limited region,and pictures were taken under an ultraviolet(UV)lamp at 365 nm for analy
6、sis of the red(R),green(G),and blue(B)values of the colored spots in order to optimize the preparation conditions and detection conditions.The results showed that the optimal conditions were as follows:chitosan concentration of 20 mg/mL,carbon spot concentration of 1.0 mg/mL,50%ethanol as sample sol
7、vent,and reaction time of 20 min.Under these conditions,the difference(G)in G-value between sample and solvent spots had a linear relationship with rutin concentration(C)in the range of 4 to 120 mg/mL.Using this method,the average contents of rutin in the flower buds of S.japonica from three batches
8、 were determined to be 23.85%,22.83%and 20.30%,the average relative standard deviations(RSDs)were 6.1%,5.6%and 6.7%,and the recoveries were 91.27%to 107.5%,which were close to the results of high performance liquid chromatography(HPLC).The proposed method is simple and rapid,and can be used for rapi
9、d on-site determination of rutin content in the flower buds of S.japonica.Keywords:carbon dots;chitosan;paper chip;rutinDOI:10.7506/spkx1002-6630-20221015-141中图分类号:TS207.3;O657.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)16-0260-07引文格式:乐薇,蒙利秀,王源,等.壳聚糖基碳点纸芯片检测槐米中芦丁含量J.食品科学,2023,44(16):260-266.DOI:10.7506/spkx1002-
10、6630-20221015-141.http:/YUE Wei,MENG Lixiu,WANG Yuan,et al.Detection of rutin in flower buds of Sophora japonica by using chitosan-based carbon dot paper chipJ.Food Science,2023,44(16):260-266.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221015-141.http:/收稿日期:2022-10-15基金项目:湖北省自然科学基
11、金项目(2019CFC920);湖北省优势特色学科群“资源环境与智能化工程”项目;武汉工商学院学术团队项目(XSTD2015003)第一作者简介:乐薇(1979)(ORCID:0000-0002-3266-5600),女,教授,硕士,研究方向为生物分析。E-mail: 成分分析 食品科学 2023,Vol.44,No.16 261芦丁是一种天然黄酮类化合物,广泛存在植物中,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、清除自由基、降血糖、促进血管舒张等多种药理作用,同时也可用作食品抗氧化剂和色素等,在药物和食品中的应用越来越广泛1-3。槐米是豆科植物槐树(Sophora japonica L.)的干燥花蕾,有凉血
12、止血、清肝泻火等功效,是一种药食同源的 药材4。槐米是提取芦丁的主要原料,槐米中芦丁含量的高低成为决定槐米品质的重要指标5-6。由于芦丁含量受品种、产地、栽培过程和槐米加工技术等多种因素 影响7-9,因此开发一种简便快捷、低廉、现场化的芦丁检测方法很有必要。芦丁含量的测定方法主要有高效液相色谱法10-11、荧光法12-13和电化学法14-15等。随着新技术的发展,碳点因其具有出色的荧光特性、光稳定性、制备原料来源广泛、制备过程简单多样等优点16,在荧光法高效快速测定芦丁含量中的应用已引起不少学者关注,如Li Huiyu等17 使用多壁碳纳米管作为载体,吗啉乙磺酸为前体,通过固态热裂解法合成了碳
13、点,以此碳点的荧光响应检测了芦丁片剂、人尿和人血清样品中的芦丁;Sinduja等18利用非必需氨基酸天冬酰胺合成碳点,计算了该碳点与芦丁的猝灭常数和结合常数,并应用于芦丁片中芦丁含量测定;丁志杰19和王靖原20等分别以生物质银杏叶、红枣为碳源采用水热法制备了能用于芦丁荧光检测的碳点;此外Xie Xiaoqian等6以反蛋白石光子晶体为骨架,以碳点为荧光响应材料,制备了一种对芦丁有特定识别能力的碳点包埋的分子印迹光子晶体水凝胶,并应用于槐花中芦丁含量的测定。纸芯片具有成本低、便携、操作简便等优点,与智能手机联用的微流控纸芯片分析传感方法被广泛认为是快速检测发展的主流方向21-22。目前已有将碳点
14、和纸芯片结合制备碳点纸芯片的报道,如Rossini等23采用蜡印并加热熔化蜡的方法在滤纸上形成疏水屏障,荧光碳点溶液滴加在亲水区,制备出检测血清和尿液的葡萄糖碳点纸芯片;Liu Cui等24用碳点溶液做油墨,通过喷墨打印制备碳点纸芯片;Yen-Linh25和Du Xiaoyan26等则将剪切法获得的圆形滤纸片直接滴加或浸泡于碳点溶液制备碳点纸芯片。上述蜡印法和喷墨法需要特殊的仪器,剪切法得到的纸芯片每片仅能测试一个样品,且蜡印法和剪切法中碳点溶液直接滴加于纸基材料上,碳点与纸基材料的作用力不强,有可能有碳点不耐受样品液的冲洗出现显色不均的情况。基于此,本研究开发一种壳聚糖基碳点纸芯片,选择对芦
15、丁有高选择性的荧光碳点,利用壳聚糖的成膜性,于滤纸表面形成碳点壳聚糖薄膜,使碳点均匀的固定于纸芯片中,点样后样品斑点由于壳聚糖膜适宜的疏水作用可限制在一定区域内均匀显色,可同步实现芦丁标准溶液和多个样品的检测。1 材料与方法1.1 材料与试剂槐米 广齐生物科技有限公司;D-天冬酰胺(纯度98%)、壳聚糖(脱乙酰度95%)上海麦克林生化科技有限公司;芦丁、槲皮素、山柰酚(纯度99%)天津一方科技有限公司;异鼠李素、绿原酸(纯 度99%)金测分析(天津)有限公司;甲醇(色 谱纯)天津市凯通化学试剂有限公司;其他试剂均为国产分析纯;实验用水为超纯水。1.2 仪器与设备JYO2S型紫外分析仪 北京君意
16、东方电泳设备有限公司;721型分光光光度计 上海光谱仪器有限公司;F97Pro荧光分光光度计 上海棱光技术有限公司;小米12智能手机 北京小米科技有限责任公司;定性滤纸(中速)杭州通用电气生物有限公司;LC-201A高效液相色谱仪 美国英特矽尔公司。1.3 方法1.3.1 碳点溶液的制备根据文献18,稍作修改。称取天冬酰胺0.5 g,加热至200 保温10 min,冷却后得到棕色固体粉末,加适量水溶解后10 000 r/min离心,取上清液用0.22 m滤膜过滤,干燥后用0.1 mol/L NaOH溶液溶解配制成一定浓度的碳点溶液,4 保存备用。1.3.2 碳点-芦丁二元荧光光谱及碳点-壳聚糖
17、-芦丁三元荧光光谱准确移取5 mg/mL的碳点溶液0.2 mL,一定浓度的壳聚糖溶液(1%HAc溶液为溶剂)0.1 mL和一定浓度的芦丁溶液(50%乙醇溶液为溶剂)1.0 mL,加水稀释至10 mL,10 min后于激发波长365 nm处扫描各体系的荧光发射光谱。1.3.3 壳聚糖基碳点纸芯片的制备量取16 mL一定质量浓度的壳聚糖溶液(1%HAc溶液为溶剂)和4 mL不同质量浓度的碳点溶液,磁力搅拌30 min,得含一定浓度的壳聚糖和碳点的铸膜液。将裁剪好的滤纸条浸入铸膜液1 min,取出,均匀地刮去滤纸条两面多余的铸膜液,平铺于已洗净并干燥的玻璃板上,晾干即得壳聚糖基碳点纸芯片。1.3.4
18、 壳聚糖基碳点纸芯片法的可行性分析芦丁标准溶液的制备:准确称取20 mg芦丁,加30%乙醇溶液溶解并定容50 mL,得0.4 mg/mL芦丁溶液。准确移取0.4 mg/mL芦丁溶液0、0.5、1 mL,加30%乙醇溶液补充体积至1 mL,再加水定容至10 mL,得到0、20、40 mg/mL芦丁溶液。按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯,其中壳聚糖质量浓度25 mg/mL、碳点质量浓度10 mg/mL。另将滤纸浸入2 mg/mL碳点溶液中后取出,晾干,即得不含壳聚糖的碳262 2023,Vol.44,No.16 食品科学 成分分析点纸芯片。在不含壳聚糖的碳点纸芯片和壳聚糖基碳点纸芯片上各点样0、
19、20、40 mg/mL芦丁标准溶液4 mL,30 min后在波长365 nm处紫外灯照射下观察显色斑点情况。1.3.5 单因素试验优化为提高碳点纸芯片测定芦丁的灵敏度,以配制芦丁溶液的溶剂(即芦丁质量浓度为0 mg/mL)为空白,考察芦丁点样后显色斑点的红(R)、绿(G)、蓝(B)值的差值(R、B、G),以其为评价指标进行单因素优化试验。1.3.5.1 壳聚糖浓度的优化按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯片,壳聚糖终质量浓度分别为5、10、15、20 mg/mL,碳点的终质量浓度为5 mg/mL。在纸芯片上加入4 L 20 mg/mL芦丁溶液(配制方法同1.3.4节),显色30 min后拍摄36
20、5 nm波长处的荧光图片。1.3.5.2 碳点质量浓度的优化按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯片,壳聚糖终质量浓度为20 mg/mL,碳点终质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL。在纸芯片上各加入4 L 10、20 mg/mL芦丁溶液(配制方法同1.3.4节),显色30 min后拍摄365 nm波长处的荧光图片,并分析显色斑点的R、G、B值。1.3.5.3 溶剂优化按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯片,壳聚糖终质量浓度为20 mg/mL,碳点终质量浓度为1.0 mg/mL。在纸芯片上各加入4 L 10、20 mg/mL芦丁溶液,芦丁的溶剂分别为0%、30%、50%、70%
21、乙醇溶液,显色30 min后拍摄365 nm波长处的荧光图片,并分析显色斑点的R、G、B值。1.3.5.4 点样体积优化按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯片,壳聚糖终质量浓度为20 mg/mL,碳点终质量浓度为1.0 mg/mL。在纸芯片上滴加不同体积(2、3、4、5、6、7 L)20 mg/mL芦丁溶液(溶剂为50%乙醇溶液),显色30 min后拍摄365 nm波长处的荧光图片,并分析显色斑点的R、G、B值。1.3.5.5 显色时间优化按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯片,壳聚糖终质量浓度为20 mg/mL,碳点终质量浓度为1.0 mg/mL。在纸芯片上滴加4 L 20 mg/mL芦丁溶液(
22、溶剂为50%乙醇),在不同显色时间(10、15、20、25、30、40、60 min)下拍摄365 nm波长处的荧光图片,并分析显色斑点的R、G、B值。1.3.6 壳聚糖基碳点纸芯片测定槐米中芦丁的含量1.3.6.1 芦丁待测液制备采取超声波法27制备芦丁待测液,略有修改。槐花粉碎后准确称取0.1 g,加60%乙醇溶液10 mL,提取温度45,超声时间60 min,提取后,自然冷却至室温,过滤后取上清液0.5 mL,加50%乙醇溶液定容至25 mL。1.3.6.2 芦丁含量测定在壳聚糖基纸芯片上,依次滴加4 mL 0、4、10、20、40、60、80、100 mg/mL的芦丁标准溶液(50%乙
23、醇溶液为溶剂)和供试液,20 min后,将待测纸芯片水平置于紫外分析仪的暗箱中,于365 nm波长处将智能手机镜头置于紫外分析仪的相机拍照口,每次拍摄均采用2 倍焦距拍照模式。用Adobe Photoshop CS5.1软件处理得到整个显色区域的R、G、B平均值,然后再将计算得到的对应差值,代入最优浓度的拟合方程中,得到供试液中芦丁质量浓度,按下式计算槐米样品中芦丁含量:C?V?nm?100?/%?式中:V为槐米待测液体积/mL;n为稀释倍数;m为槐米样品质量/mg;C为槐米待测液中芦丁质量浓 度/(mg/mL)。1.3.7 高效液相色谱法测定槐米中芦丁的含量1.3.7.1 芦丁标准溶液及槐米
24、待测液配制芦丁标准溶液:精密称取芦丁对照品10 mg,加甲醇定容至100 mL,配制成0.1 mg/mL的芦丁溶液。再分别取2、4、6、8 mL上述溶液,加甲醇稀释至10mL,得0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL的芦丁溶液。槐米待测液:将槐米研碎,用100 目筛子过筛,称取50 mg,加甲醇50 mL,超声60 min,冷却,用甲醇定容至100 mL,摇匀。经0.45 m滤膜过滤即得槐米待测液。1.3.7.2 高效液相色谱条件28Inertsil ODS-SP色谱柱(4.6 mm250 mm,5 mm);流动相:甲醇-1%冰醋酸(32 68,V/V);检测波长257 nm;室温
25、;流速1 mL/min;进样体积10 mL。1.4 数据处理每组实验至少重复3 次,用Excel 2019软件进行数据的统计分析,结果表示为 s,采用Origin Pro 2015软件进行谱图绘制。2 结果与分析2.1 可行性分析2.1.1 碳点-芦丁二元荧光光谱及碳点-壳聚糖-芦丁三元荧光光谱纸芯片点样后在365 nm紫外灯照射下观察荧光显色斑点,考察存在或不存在壳聚糖时,芦丁对碳点的荧光猝灭情况。由图1A可知,芦丁对碳点有明显的荧光猝灭现象,质量浓度远高于芦丁的壳聚糖也表现出较弱的猝灭作用,芦丁和壳聚糖的加入均不改变碳点的发射峰位置。当向碳点-芦丁体系加入壳聚糖时,发现碳点的荧光强度继续下
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