景宁木兰TCP家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析.pdf
《景宁木兰TCP家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《景宁木兰TCP家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析.pdf(11页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、热带亚热带植物学报 2023,31(5):623 633 Journal of Tropical and Subtropical Botany 收稿日期收稿日期:2022-04-28 接受日期接受日期:2022-06-15 基金项目基金项目:浙江省“十四五”育种专项(2021C02071-3)资助 This work was supported by the Special Project for the 14th Five Breeding of Zhejiang(Grant No.2021C02071-3).作者简介:任明杰(1997 年生),男,硕士研究生,从事景宁木兰濒危机制研究。E-
2、mail:*通讯作者 Corresponding author.E-mail: 景宁木兰景宁木兰 TCP 家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析 任明杰,陆丹迎,吴超,朱森宇,陈小珺,邬宇峰,申亚梅,马晶晶*(浙江农林大学风景园林与建筑学院,浙江省园林植物种质创新与利用重点实验室,南方园林植物种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室,杭州 311300)摘要:摘要:为明确 TCP 转录因子家族在景宁木兰(Magnolia sinostellata)遮阴胁迫中的作用,通过模拟自然生境对景宁木兰 3 a 生嫁接苗进行遮阴处理,基于转录组分析 TCP 转录因子相关信息,利用转录
3、组表达量和 qRT-PCR 分析遮阴胁迫下的表达模式。结果表明,从景宁木兰转录组中筛选出 12 个 TCPs 基因,编码蛋白长度为 228558 个氨基酸,分子量为 23.752.7 kDa,TCPs蛋白均为不稳定蛋白、亲水性蛋白;TCPs 均定位于细胞核,MsTCP20-a/b 蛋白还定位于叶绿体。TCPs 成员分为 2 大类,Class 包含 10 个 TCPs 成员,Class 包含 2 个 TCPs 成员。所有成员均含有 TCP 保守结构域,亲缘关系较近的成员具有相似的保守基序;克隆得到 TCPs 启动子序列,其序列含有大量光响应和激素响应元件。在遮阴处理后景宁木兰 TCPs 基因存在
4、差异表达,其中 MsTCP9-a 与 MsTCP2 在遮阴后显著上升,MsTCP8、MsTCP9-b、MsTCP7-a、MsTCP15 在遮阴后显著下降。因此,景宁木兰 TCPs 可能在响应遮阴胁迫过程中发挥重要功能。关键词:关键词:TCP 转录因子家族;景宁木兰;遮阴;基因表达 doi:10.11926/jtsb.4663 Identification of TCP Family in Magnolia sinostellata and Expression Patterns of TCPs Under Shading Stress REN Mingjie,LU Danying,WU Cha
5、o,ZHU Senyu,CHEN Xiaojun,WU Yufeng,SHEN Yamei,MA Jingjing*(School of Landscape Architecture,Zhejiang Provincial Key Laboratory of Germplasm Innovation and Utilization for Garden Plants,Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Germplasm Innovation and Utilization for Southe
6、rn Garden Plants,Zhejiang A&F University,Hangzhou 311300,China)Abstract:In order to investigate the role of TCP transcription factors family of 3-year-old Magnolia sinostellata grafted seedlings under simulated natural shading,the bioinformation of TCP transcription factors were analyzed based on tr
7、anscriptome data,as well as their expression patterns under shading stress.The results showed that 12 TCPs were identified from the transcriptome data of M.sinostellata,encoding 228-558 amino acids with protein size of 23.7-52.7 kDa.All of 12 TCPs proteins were unstable and hydrophilic.The 12 TCPs l
8、ocated in cell nucleus,and MsTCP12-a/b also located in chloroplast.MsTCPs could be divided into two types,Class I contained 10 TCP members,and Class II with two TCP members.All members contained TCP conserved domains and the closely TCP members had similar conserved motifs.Meanwhile,the TCP promoter
9、 sequences of M.sinostellata were cloned and analyzed,which contained a large number of light response elements and hormone response elements.The MsTCPs were differentially expressed under shading treatment.MsTCP9-a,MsTCP2 were significantly up-regulated and MsTCP8,MsTCP9-b,MsTCP7-a,MsTCP15 were sig
10、nificantly down-regulated.624 热带亚热带植物学报 第 31 卷 Therefore,MsTCPs might play an important role in response to shade stress.Key words:TCP transcription factor family;Magnolia sinostellata;Shading;Gene expression 光照是植物生长发育所必须的外界环境因子,植物通过光合作用合成有机物满足自身营养需求,在森林群落中,上层常绿植物的冠层遮阴往往会减弱光强和改变光质进而影响下层植物的生长发育。遮阴会对不
11、耐阴的植物造成一种重要的非生物胁迫,影响植物的营养生长1、花色2以及叶色34等性状。木兰科(Magnoliaceae)植物是一类古老的植物种群,由于全球气候变化、亚热带常绿阔叶林的演替,多数木兰科植物都面临灭绝的危险。木兰科濒危物种生境多呈破碎化,多分布于阳光充足的林缘与溪沟边,在林下生长势弱或幼苗较少58。景宁木兰(Magnolia sinostellata)是木兰科木兰属植物,其自然分布区狭窄,属于浙江省极小种群濒危物种。景宁木兰属偏阳性树种9,多生于针叶群落,在针阔叶群落中分布数量相对稀少,在常绿落叶群落中零星分布10,群落中上层乔木的遮阴环境可能是削弱景宁木兰生长势,从而造成其濒危的重
12、要因素之一。TCP 是植物特有的一类转录因子家族,广泛参与植物生长发育、激素信号传递和逆境胁迫等多个生物学过程。根据 TCP 结构域的不同,TCP 家族可分为 Class I(PCF 或 TCP-P)和 Class II(TCP-C)两大类,Class II 类进一步分为 CIN 亚类和 CYC/TB1 亚类1112。在 Class I 类基因当中,水稻(Oryza sativa)PCF1 和 PCF2 参与 DNA 复制和控制细胞周期13。拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP8 在调控花期中发挥作用14,AtTCP14 和 AtTCP15 影响拟南芥的节间长度和叶片形状,
13、同时介导赤霉素途径促进种子萌发15。菊花(Chrysanthemum morifolium)CmTCP20过表达能够增加菊花中侧根的数量和长度,并对侧根中生长素的积累产生积极作用16。Class II 类中,CIN 亚类基因参与调控叶形态,AtTCP2、AtTCP3、AtTCP4、AtTCP10 和 AtTCP24 受 miR319 的调控从而协调叶的发育17;CYC/TB1 亚类基因 AtTCP18/BRC1 在控制腋芽分枝发育中发挥作用18,AtTCP1能够结合油菜素内酯合成酶基因 DWARF4的启动子,进而调控其表达19。迄今为止,已对拟南芥20、茶(Camellia sinensis)
14、21、棉花(Gossypium raimondii)22等多种植物的 TCP 转录因子开展研究,而在遮阴胁迫下的相关研究鲜有报道。本研究模拟景宁木兰野外林下光照强度对其进行遮阴处理并进行转录组测序,通过分析差异表达基因,发现景宁木兰 TCPs在遮阴胁迫下呈现差异表达,推测景宁木兰 TCPs可能响应遮阴胁迫从而调控景宁木兰的生长发育。因此本研究基于景宁木兰遮阴转录组数据,对景宁木兰 TCPs 转录因子家族开展鉴定分析,探究其生物信息学特性及遮阴环境下的表达模式,为深入了解景宁木兰 TCPs在遮阴下的调控网络奠定基础,最终为解释景宁木兰的濒危机制提供理论依据。1 材料和方法 1.1 材料材料 供试
15、材料来自浙江省杭州市青山湖花园中心苗圃(3025 N,11981 E)培育的景宁木兰3 a 生嫁接苗。挑选长势、性状一致且无病害的嫁接苗作为材料,置于浙江省临安区浙江农林大学(3026 N,11973 E)人工气候室进行培养,设置温度为(252)、相对湿度为 40%60%、光照强度为 648 mol/(m2s)。为模拟景宁木兰野外遮阴环境,采用 3 层黑色遮阳网及竹竿搭建遮阴处理装置25%全光照,162 mol/(m2s),对照组幼苗不进行遮阴处理,其他条件保持不变。所有幼苗叶片间无重叠,每处理设置 3 个生物学重复。分别自处理的第 0、5、15 天采集景宁木兰中层叶片。所有样品取样后立即用锡
16、箔袋包好,并迅速置于液氮中速冻,随后转入80 冰箱保存,用于后续 RNA 提取及荧光定量 qRT-PCR 反应,并委托深圳华大基因股份有限公司进行转录组测序,转录组测序中每个样本设置 3 个重复。1.2 TCPs 基因的筛选与理化性状分析基因的筛选与理化性状分析 景宁木兰 TCPs 基因的鉴定基于转录组测序数据。在转录组注释文件中的 NR、NT、Swiss-Prot等 3 个数据库中进行关键词筛选,初步筛选到 133个 TCPs 相关基因。用 TBtools 软件批量提取转录组氨基酸序列文件中对应基因的氨基酸序列,不存在氨基酸序列的基因不进行后续分析。通过 Pfam 和SMART 工具进一步分
17、析结构域,剔除不含有 TCP 结构域的序列。通过 DNAman 进行对比,去除相同基因的冗余转录本,最终获得 12 个景宁木兰 TCPs 基因,并根据 TCP 拟南芥命名法及 NCBI blast 比对结第 5 期 任明杰等:景宁木兰 TCP 家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析 625 果进行命名。利用 ExPASy 中的 ProtParam 在线工具(https:/web.expasy.org/protparam/)预测景宁木兰 TCPs的氨基酸数量、等电点及分子量等理化性状;利用在线网站 Cell-PLoc 2.0(http:/ inf/Cell-PLoc-2/)预测亚细胞定位。1.3 TCP
18、s 系统发育进化树构建系统发育进化树构建 利用 MEGA 6.0 将景宁木兰、拟南芥、望春玉兰(M.biondii)、水稻的 TCPs 氨基酸序列进行系统发育分析,采用邻接法(neighbor-joining),1 000 次bootstrap检测,利用在线工具iTOL(https:/itol.embl.de/)对系统发育进化树进行优化。拟南芥、水稻的TCPs 氨基酸序列均下载自 PlantTFDB 网站(http:/planttfdb.gao-lab.org/index.php),望春玉兰 TCPs 氨基酸序列筛选自望春玉兰基因组23。1.4 TCPs 氨基酸序列比对与保守结构域基序分析氨基
19、酸序列比对与保守结构域基序分析 利用 Clustal Omega 在线工具(https:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对 12 个景宁木兰 TCPs 的氨基酸序列进行序列对比,利用 jalview 软件对多序列比对图谱进行优化;利用在线网站 MEME(https:/meme-suite.org/meme/tools/meme)对景宁木兰 TCPs蛋白进行保守基序预测分析,设置参数为:任意重复次数,最多基序数量为 10;利用 NCBI CDD 工具(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析
20、景宁木兰 TCPs 蛋白保守结构域。1.5 TCPs 的启动子克隆及顺式作用元件预测的启动子克隆及顺式作用元件预测 利用DNA提取试剂盒提取景宁木兰基因组DNA;利用同属物种望春玉兰的基因组数据,从 pfam 数据库中下载 TCP 转录因子的 HMM(Hindden Markov Model,隐马尔科夫模型)文件,利用 hmmer 3.0 软件检索望春玉兰 TCPs 转录因子家族基因。调取望春玉兰基因组内景宁木兰同源 TCPs 基因上游 2 000 bp的启动子序列,根据望春玉兰 TCPs 启动子序列设计引物(表 1),以景宁木兰 DNA 为模版,利用高保真酶扩增景宁木兰 TCPs 成员启动子
21、片段,连接pCE2-TA 载体并转化大肠杆菌感受态,将阳性菌送往公司进行测序,获得景宁木兰 TCPs 启动子序列。通过 PlantCARE(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线网站对景宁木兰 TCPs启动子序列进行预测,利用 TBtools 进行可视化分析。表 1 景宁木兰 TCPs 启动子克隆引物 Table 1 Primers for TCPs promoter cloning of Magnolia sinostellata 基因 Gene 上游引物序列(53)Forward primer sequen
22、ces 下游引物序列(53)Reverse primer sequence MsTCP8 CATTGGACCCACCCCTATTTGATTA CTACCCACATCCTGCTGGTCTGAAG MsTCP9-a ATTTAGGAGAGCCTGCATATCAACC TCTTCTTCCTTCTGCGGTTCCATTC MsTCP4 TGCACACTTCATGCCTGAGTTCCTA GTGGACTCATCTCTCGATTGACGGT MsTCP9-b CTGCTACGCTGATAGAAGTTGGAAG GACCTTCTTCATCTTCTTCCTCGCT MsTCP7-a CTGCTTGCGCCTA
23、CAACTACCCATA GGGCGTCAGAGGTAGACATAGAGCT MsTCP20-b AATAATAGCATGCAGGGGAGAGAAA GCTTGGGATCCATTGGAAAACAGAG MsTCP11 GTATTTAGGCATGTCCTGAAGTTTC GAGAGAGAGACTTCTAGGGTTTTAT MsTCP19 TTCAACGAGACGAACAAGAAATCCT CTCGGACATCTTGAAGAGAACCCTA MsTCP7-b AGTCGTGATTCTACTAGTGCGCAAG TTGTTTGGTGGAGAGTCTTGGGTAG MsTCP2 CGGGGCTTTGG
24、ATCAAGATTATATT CGCCATTAATAGCCGTTGATTTCGA MsTCP15 TCTCTCTGTAGTAAGCAAGTGGTGA ATGTGCGTATGTATATCTATCGTCG 1.6 TCPs 在遮阴胁迫下的表达分析在遮阴胁迫下的表达分析 在转录组中获得 12 个景宁木兰 TCPs 基因的FPKM 表达量数据,取平均值后利用 TBtools 软件进行归一化转换,利用 HeatMap 工具绘制热图。根据转录组数据结果,选取在遮阴处理第 5 和 15 天时表达量趋势一致的基因进行实时荧光定量实验。采用植物 RNA 提取试剂盒提取样品总 RNA,利用反转录试剂盒进行第 1
25、链 cDNA 的合成。根据景宁木兰转录组数据,利用 Premier 5.0 软件设计特异性引物(表 2),景宁木兰 EF1-基因作为内参基因2425,引物均交由生物公司进行合成。利用Light Cycler 480II(Roche)仪器进行目的基因荧光定量 qRT-PCR 表达分析。实时定量反应体系为10 L,包括 2 L cDNA、5 L BCG qPCR Master Mix、上、下游引物(10 mol/L)各 0.4 L、ddH2O补足至 10 L,设置 3 个重复。反应程序为:95 预变性 30 s,然后 95 变性 5 s,58 30 s,共40 个循环。反应程序结束后,65 95
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 景宁 木兰 TCP 家族 鉴定 遮阴 胁迫 表达 模式 分析
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。