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抗菌肽的抗菌机制及在水产中的应用.pdf
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1、164综述饲料研究FEEDRESEARCHNO.19 2023抗菌肽的抗菌机制及在水产中的应用任金美美温赛*(北京工商大学轻工科学技术学院,北京10 0 0 48)摘要:抗菌肽(AMPs)是具有广泛来源和广谱抗菌活性的独特分子,可以通过多种作用机制发挥抗菌作用,包括靶向细胞壁、细胞膜、细胞内成分和生物膜。AMPs普遍存在于自然界的单细胞和多细胞生物中,被认为是可以通过正向选择而提取的有效免疫效应物。AMPs除了具有广谱抗菌活性,能够快速杀灭微生物外,还能够中和内毒素,不受传统抗生素耐药机制和细胞选择性的影响。文章主要从抗菌肽的生物活性、作用机制及在水产中的应用进行阐述,以期为抗菌肽作用机制的研
2、究及在水产中的应用提供参考。关键词:抗菌肽;抗菌活性;抗菌机制;水产应用中图分类号:S816.7文献标识码:A文章编号:10 0 2-2 8 13(2 0 2 3)19-0 16 4-0 6Doi:10.13557/ki.issn1002-2813.2023.19.032Antibacterial mechanisms of antimicrobial peptides and their application in aquacultureREN Jin-meiWENSaiAbstract:Antimicrobial peptides(AMPs)are unique molecules wi
3、th a wide range of sources and broad-spectrumantibacterial activity that can exert antimicrobial effects through a variety of mechanisms of action,including targeting cellwalls,cell membranes,intracellular components and biofilms.Due to their prevalence in unicellular and multicellularorganisms in n
4、ature,AMPs are potent immune effectors that can be extracted by positive selection.AMPs not only havebroad-spectrum antibacterial activity and can quickly kill microorganisms,but also can neutralize endotoxins,unaffectedby traditional antibiotic resistance mechanisms and cell selectivity.The aricle
5、focuses on the biological activity,mechanism of action and application of AMPs in aquaculture,with a view to providing reference for the study of themechanism of action of AMPs and the application of them in aquaculture.Key words:antimicrobial peptides;antibacterial activity;antibacterial mechanism;
6、aquatic applicationsAMPs又称多肽抗生素,无高度保守的序列,大多是12100个氨基酸残基的两亲性和高度阳离子的小分子多肽。AMPs最早发现于北美天蚕的滞育蛹的免疫系统内,由于这类物质具有非常高效的抗菌效果,因而被命名为AMPs。A M Ps 多含疏水性氨基酸,其来源广泛,是一组可以在体外表现出较高抗微生物活性的小分子物质,并且是原核生物和真核生物先天免疫系统中的关键效应分子。近些年,抗生素的不规范使用造成了微生物的耐药性,严重制约水产养殖的可持续发展。抗菌肽可以作为抗生素替代品应用于养殖行业。目前已经发现30 0 0 多种动物AMPs,A M Ps 在水产养殖及保鲜方面具
7、有广泛的应用前景。本文主要从抗菌肽的生物活性、作用机制及在水产中的应用进行阐述,以期为抗菌肽作用机制的研第一作者:任金美,硕士,研究方向为游离型毕赤酵母中溶菌酶的筛选和表达。通信作者:温赛,博士,副教授,博士生导师。基金项目:国家重点研发计划(项目编号:2 0 2 1YFC2102800);国家自然科学基金面上项目(项目编号:2 2 17 8 0 0 6)收稿日期:2 0 2 3-0 4-0 2究及在水产养殖中的进一步应用提供参考1抗菌肽的生物活性AMPs是先天免疫系统中抵御病原体感染的第一道防线,对多种细菌、真菌和病毒具有很强的抗菌活性 2。与传统抗生素相比,AMPs通常表现出更高的广谱抗菌
8、活性且不易产生耐药性。AMPs与传统抗生素联合使用可以促进抗生素的吸收,表现出协同作用 3。许多AMPs还显示出抗病毒活性,具有抗病毒活性的AMPs被称为抗病毒肽(AVP)。A VP能够克服病毒对普通药物的耐药性。一些AVP可以通过融入病毒包膜和细胞膜而中和病毒,从而破坏病毒膜的稳定性并预防感染 4。AVP还可以抑制病毒的增殖,从而模仿病毒的感染过程。抗真菌肽(A FPs)被认为是一组具有广谱活性的生物活性分子,具有低毒性、强热稳定性、高溶解度、低分子量和不易产生抗药性等优点 5。AFPs可有效治疗真菌感染。大多数AFPs通过膜相关机制和特定靶标发挥其活性。2抗菌肽的作用机制AMPs通常具有正
9、电荷和两亲性结构,可与疏水表面和膜发生强相互作用(。疏水残基在与膜相互作用时形成典型的两亲性结构与高正电荷密集区域,使阳离子AMPsNO.192023饲料研究FEEDRESEARCH165综述养能够发挥其抗菌作用。这种净电荷与疏水比的改变可以改变许多微生物的活性。AMPs的抗菌作用模式很复杂,不同的AMPs可以靶向微生物中的不同位点。AMPs可以抑制细胞壁、核酸和蛋白质合成,抑制酶活性,调节宿主免疫应答 7,进而发挥抗菌活性。2.1细胞壁靶向机制AMPs可以干扰细胞壁成分肽聚糖唐(PGN)的生物合成,从而对细胞壁造成损害。细菌PGN层对细菌的完整性和存活至关重要,是许多抗生素的主要靶标。脂质是
10、合成PGN的重要组成部分,位于细胞膜的细胞质侧,通过细胞膜运输细胞壁亚基进行聚合并插入现有细胞壁。AMPs中的杆菌肽(Bacitracin)和万古霉素(Va n c o my c i n)可选择性地与脂质结合,并抑制细胞壁的合成。Schneider等 10 研究发现,菌丝霉素(Pl e c t a s i n)将脂质作为细胞靶点,并通过直接与脂质I结合发挥作用。AMPs可通过抑制膜壁酸的生物合成来破坏细胞壁的完整性。AMPs不仅抑制了细胞壁的合成,还可以破坏已形成的细胞壁结构,2.2细胞膜相互作用机制AMPs通过膜的阴离子成分和肽的正电荷之间的静电相互作用附着在细菌的细胞壁上。同时,AMPs与
11、带负电荷的微生物表面静电相互作用,两者结合并穿透细菌膜,形成肽-脂超分子复合物,插入细胞膜中,最终导致膜破坏和细菌细胞死亡 12。AMPs抗菌活性模型包括桶板模型、环孔模型、地毯状模型和聚合模型。2.2.1桶板模型(见图1)由图1可知,在桶板模型中,螺旋多肽在细胞壁内聚集,并以多聚体的形式垂直穿透脂质双层,在膜中形成束状孔,使细胞膜的通透性增加,形成一条通道,使细胞质流出。-螺旋肽和-片状肽的螺旋疏水区在穿透磷脂双层的过程中靠近膜磷脂的疏水区,而多个螺旋分子平行排列在肽螺旋的亲水区内,形成了中心腔体13。通常,桶板模型会产生单侧大小的跨膜孔。在该孔内,肽的亲水区域与管腔相对,在疏水肽区域和脂质
12、核之间形成范德华引力。该模型的典型例子包括丙甲菌素(A l a m e t h i c i n)、角毒素(Ceratotoxins)和宿主防御肽(Host defensin peptides)14图1桶板模型2.2.2环孔模型(见图2)由图2 可知,环孔模型的机理与桶板模型的机制相似。不同之处在于,在环孔模型中,肽螺旋亲水区域与双层脂质头基团之间的静电相互作用,形成环形孔复合物,垂直嵌入细胞膜中的AMPs局部积累,然后弯曲并垂直插入膜双层,从而使肽和脂质头基团嵌入脂质疏水中心内,形成由肽和脂质头束组成的环形孔。代表性的AMPs包括爪蟾抗菌肽(Magainins)、蜂毒肽(Melittin)、内
13、源性抗微生物多肽(Protegrins)15、放线菌素(Actinoporins)禾和乳酸菌素Q(La c t i c i n Q)I1l。图2环孔模型2.2.3地毯模型(见图3)由图3可知,在地毯模型中,AMPs与细胞膜平行排列,通过静电相互作用,亲水端被极性溶剂吸引,疏水端与膜表面的阴离子磷脂双层缔合。AMPs会以类似地毯的形式覆盖在膜表面,并通过表面活性剂的方式破坏细胞膜,从而导致细胞死亡。Mcmillan等 7 报道的爪蟾抗菌肽便是显示这一机制活性的代表性AMPs,具有-折叠结构的AMPs也在这一模型中发挥作用。这种模型既未形成通道,也未将肽插入膜的疏水中心。然而AMPs需要一定的浓度
14、阈值,并且所需的AMPs浓度很高才能形成胶束并破坏磷脂双层。据推测,由脂多糖组成的革兰氏阴性菌上存在额外的外脂质膜,允许阳离子肽出现自我促进的摄取途径 18。由于AMPs中的大多数肽对脂多糖具有高亲和力,因此与脂多糖结合,竞争性地从其相对结合位点取代镁和钙离子等二价阳离子。镁离子和钙离子均通过羧化和磷酸化脂质头基的交联来实现细胞表面稳定性所必需的离子。这些二价阳离子的去除导致外膜扭曲,形成更多的肽和其他小分子可以通过的孔。图3地毯模型2.2.4聚合模型(见图4)图4聚合模型在聚合模型中,AMPs与阴离子细胞质膜结合,迫使肽和脂质形成肽-脂质复合物。AMPs、脂质和水形成的NO.192023饲料
15、研究FEEDRESEARCH166养综述通道可以让离子和细胞内的内容物溢出,进而导致细胞死亡,这与地毯模型不同。这些通道还可能帮助AMPs向细胞质转移并发挥相应的作用。这一机制解释了AMPs不仅靶向细胞质膜,而且还会穿过膜进入细胞质作用于胞内物质的原因 9 2.3细胞内靶向机制除了膜损伤外,AMPs不仅可以作用于细胞壁和细胞膜,还可以通过直接渗透或内吞作用进入细胞 2 0,从而干扰参与转录、翻译和组装的关键酶;AMPs通过抑制核酸、蛋白质和一些合成细胞壁和细菌生长的必需酶的生物合成来杀死细菌 2 1。AMPs通过阻止核糖体的正常工作来抑制蛋白质的合成。从哺乳动物和昆虫细胞中分离出的富含脯氨酸和
16、精氨酸的AMP-PrAMP,可迅速穿透大肠杆菌的外膜,进入细胞质后,立即抑制蛋白质合成并且降解DNA合成所需的蛋白质,从而破坏DNA合成 2。AMPs可以影响关键酶或与核酸结合诱导核酸分子降解,从而抑制核酸生物合成。组蛋白衍生的AMPs对DNA和RNA均具有高亲和力,因为其与组蛋白核心亚基的一部分共享其整个序列。对多种细菌具有抗菌活性的布福林I(Bu f o r i n )在低于MIC的浓度下,可以穿透脂质囊泡而不影响膜通透性,并与DNA和RNA结合来抑制细胞功能,从而导致细胞快速死亡 2 3。AMPs可抑制细菌细胞内酶的活性。Otvos等 2 4合成了具有吡咯霉素(Pyrrhocoricin
17、)的有效DnaK结合结构域和果蝇菌素(Drosocin)的高膜渗透能力的嵌合二聚体,发现DnaK对金黄色葡萄球菌具有活性。DnaK的抑制作用导致蛋白质错误折叠和聚集,最终导致细菌死亡。AMPs通过抑制DNA复制和DNA损伤反应(SOS反应)来抑制细胞分裂。TemporinL通过与FtsZ(1种具有GTP酶活性的管状蛋白)和分裂复合体相互作用,损害大肠杆菌的细胞分裂 2 5。Temporin L通过与FtsZ结合抑制蛋白质的酶活性和聚合活性 2 6 2.4抗生物膜机制生物膜由附着在生物或非生物表面并嵌入蛋白质和多糖产生的基质中的复杂微生物群落组成。细胞外聚合物(EPS)含有细胞外多糖、蛋白质、核
18、酸和其他小细胞分子,可以保护生物膜中的微生物免受不利环境条件的影响,并增加微生物对抗生素的抵抗力 2 7。生物膜的形成和发展包括4个阶段:微生物的聚集或附着、微生物黏附、生物膜的发育和成熟、生物膜老化。根据生物膜形成的4个过程,抑制生物膜形成的方法包括:抑制细菌群体感应系统(QS)2 8、抑制细胞的黏附或诱导细胞聚集体的分散 2 9、细胞外聚合物产生的衰减 30、结合蛋白转运基因表达的下调 312.5免疫调节作用机制AMPs还可以募集和激活免疫细胞,从而增强微生物杀伤力和控制炎症。AMPs是先天性和适应性免疫的效应分子,AMPs可以产生多种免疫反应,如:白细胞的激活、吸引和分化;促进伤口愈合;
19、刺激细胞增殖和血管生成;具有调节促炎和抗炎反应、趋化活性以及对适应性免疫的直接影响 32;通过降低促炎趋化因子的表达来减轻炎症;控制趋化因子和活性氧/氮的表达(33;修饰基因表达并杀死癌细胞,以参与人体皮肤,呼吸道感染和炎症性疾病的免疫调节 34等。3抗菌肽在水产养殖中的应用3.1抗菌肽在改善水质方面的应用水产养殖对水质的要求很高,其中防治传染病是集约化生产中最重要的一环。水中的革兰阴性细菌病原体(如嗜水曲霉、杀鲑弧菌、弧菌属、冰塔鲁氏爱德华氏菌、迟发埃克氏菌)和革兰氏阳性菌(如链球菌属)以及水霉腐霉菌属均会影响水产养殖动物 35。近年来,生物防治剂逐渐得到认可,不仅可以避免养殖环境的微生态失
20、衡,改善水质,还可以改善鱼类的肠道菌群结构。鱼类来源的AMPs是改善水质的生物防治剂的重要来源之一。抗菌肽数据库(APD,h t t p:/a p s.u n m c.e d u/A P/main.php)包含12 7 种被鉴定为鱼类AMP的肽,并且该列表在dbAMP中增加到39 8 种肽。抗菌肽抑制常见病原菌的种类见表1。由表1可知,AMPs可以是阳离子或非阳离子,主要家族是杂交条纹鲈的piscidins、哺乳动物的cathelicidins、防御素(defensins)、铁调素(hepcidins)和高密度脂蛋白(high-density lipoproteins)36。来自条纹鲶鱼的NK
21、-lysin对哈维弧菌、嗜水气单胞菌和大肠杆菌具有较强的抗菌活性,其最低抑菌浓度分别为15.6 2 5、250.000和31.2 50 mol/L,可以提高水产养殖中条纹鲶鱼的存活率 37。来自草鱼的-防御素(BD,-defensins)能够有效抑制嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性菌病原体的生长 38。从锦鲤肠道中分离的乳杆菌FGC-12应用于南美白对虾,可以破坏副溶血性弧菌的细胞壁并抑制其繁殖 39。来自三疣螃蟹的结壳素PtCrustin5在各种盐度和pH值下对金黄色葡萄球菌球菌、谷氨酸棒状杆菌和溶壁微球菌均具有较强的抑制作用 40
22、3.2抗菌肽在饲料中的应用AMPs作为饲料添加剂不仅可以抑制饲料中产生的有害微生物,还可以延长货架期,抑制水生动物体内的致病菌,提高其免疫力。非特异性免疫机制是水产动物机体中的基本防御机制。非特异性免疫系统在对抗病原体感染上比特异性免疫系统更加重要。通过检测水产动物的免疫细胞数量、产氧化物歧化酶和碱性磷酸酶等可以判断水产动物的免疫能力。如对虾抗菌肽主要在免疫反应的主要部位(循环血细胞中)表达,然后迁移到感染部位对抗病原体的入侵(4。在海洋鱼类的饲料中添加AMPs作为饲料添加剂,可以抑制饲料中细菌的繁殖 42 NO.192023饲料研究FEEDRESEARCH167综述养从大黄鱼分离的SKL17
23、-2肽作为饲料添加剂对多舌假单胞菌具有较强的抗菌活性,可降低养殖海鱼内脏白结节病的发病率,而且不会杀死肠道菌群中的益生菌 43。从甲壳类动物中分离的甲壳素可以调节虾的肠道菌群平衡来抵抗病原菌感染 4。具有抗菌和免疫增强能力的来自泥蟹的富含脯氨酸的抗菌肽(SpPR-AMP1)是治疗对虾养殖中可引起急性肝胰腺坏死病感染的坎贝利弧菌VH-639的抗菌剂 45。补充AMP可以显著改善水生动物的生长性能、酶活性和抗病性。Wang等 46 研究表明,AMP可有效改善水产动物身体健康状况,降低水产饲料成本。在饲料中添加膳食AMPs(40 0 8 0 0 m g/k g)可以改善草鱼肠道形态,促进消化,提高抗
24、氧化能力和免疫力,维持肠道菌群平衡 47。饲料中补充克氏原鳌虾阿肽西啶(a s t a c i d i n)、甲壳肽(crustin)、来源于大乳头水的上皮防御组织的新型抗菌肽hydramacin和pom-1等重组磷脂AMP,可改善鱼类的生长性能,提高抗氧化性能和免疫力,提高消化酶活性,改善肠道形态 48。在虾的日粮中补充0.4%的AMP可以提高太平洋白腿虾的生长性能、抗氧化活性,促进先天免疫反应能力 49。此外,在饲料中添加短肽 CM1150、T C38 51、NK-l y s i n 52、NK L-2453、Ca t h e l i c i d i n s 54、Pi s c i d i
25、 n s 5均会提高水产养殖中动物的免疫能力,提高养殖的产量。表1抗菌肽抑制常见病原菌的种类AMPs种类病原菌种类斜带石斑鱼epinecidin-1创伤弧菌罗非鱼hepcidinl-5创伤弧菌、无乳链球菌黑鲷AS-hepc2、A S-h e p c 6金葡菌、溶壁微球菌、粪肠球菌、金葡菌、无乳链球菌重组epinecidin-1大肠杆菌、产酸克雷伯杆菌、绿脓杆菌、创伤弧菌大西洋鳕鱼Defb柠檬色游动球菌、藤黄微球菌hepcidin大肠杆菌、杀鲑气单胞菌金葡菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、罗非鱼Oreoch-1、O r e o c h-2、O r e o c h-3迟钝爱德华菌
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