喀什帕米尔高原牦牛乳传统发酵生奶酪中微生物多样性及分子鉴定.pdf

喀什帕米尔高原牦牛乳传统发酵生奶酪中微生物多样性及分子鉴定伊力米热 窑 热夏提袁努尔古丽 窑 热合曼*袁古丽皮艳 窑 托乎提袁地力呼马尔 窑 阿布都许库渊新疆师范大学生命科学学院新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室乌鲁木齐 830054冤摘要目的院研究喀什帕米尔高原塔县地区传统牦牛乳发酵生奶酪中微生物的多样性和菌群结构遥 方法院从帕米尔高原区不同牧民家庭中采集 6 份生奶酪样品袁采用高通量测序技术分析其微生物多样性遥通过纯培养方法分离传统牦牛乳发酵生奶酪样品中的菌种袁 采用传统分类与 16S rDNA 序列测定和 26S rDNA D1/D2 间隔区序列测定方法对分离的细菌和酵母菌进行种属鉴定遥 结果院通过细菌的 16S rDNA 基因 V3-V4 区测序袁共获优化序列 945 432遥 通过真菌的 ITS 区域测序袁共获优化序列 1 302 962遥 在属水平上袁优势细菌属为乳杆菌属和链球菌属袁优势真菌属为克鲁维酵母属尧有孢圆酵母属尧伊萨酵母属和未分类的真菌类群遥 根据主坐标轴分析袁6 份样品的群落结构间既有相似性又有差异性遥 在 MRS 和 MC 培养基中共分离 52 株细菌袁在 YGC 培养基上共分离 46 株酵母菌袁通过细菌 16S rDNA 序列和真菌 26S rDNA D1/D2 隔间区序列分析袁将 52 株细菌归为 7 个属 11 个种袁分别是耐久肠球菌尧粪肠球菌尧热带芽孢杆菌尧蜡样芽孢杆菌尧类副粘杆菌尧希腊假单胞菌尧副干酪乳杆菌尧鸡乳杆菌尧霍氏肠杆菌尧细黄链霉菌尧表皮葡萄球菌遥将 46 株酵母菌归为 8 个属 9 个种袁分别是解脂耶氏酵母尧诞沫假丝酵母尧发酵毕赤酵母尧库德毕赤酵母尧普兰久浩酵母尧异常威克汉逊酵母尧马克思克鲁维酵母尧东方伊萨酵母尧酿酒酵母遥 本研究首次对帕米尔高原地区传统发酵乳制品中微生物资源进行分析袁其结果可为该地区发酵乳制品的研究提供参考遥 需要进一步更系统的的深入研究挖掘遥关键词帕米尔高原曰 高通量测序曰 牦乳生奶酪曰 微生物多样性曰 分子鉴定文章编号1009-7848渊2023冤08-0342-12DOI院 10.16429/j.1009-7848.2023.08.034新疆喀什塔什库尔干塔吉克自治县简称塔县1袁它处于新疆东南部的帕米尔高原袁距喀什市290 km袁平均海拔 4 000 m 以上袁有特殊的地理环境袁高原海拔袁气候条件差遥 塔吉克族人民有独特的饮食文化袁许多日常食品与维吾尔族相似遥 如使用牦牛奶尧羊奶尧牛奶尧酥油等奶制品制作的酸奶尧奶疙瘩尧奶皮子尧奶酪等是塔吉克族日常生活中必不可少的食品遥 奶酪是一种营养丰富袁用途广泛的乳制品袁 是生鲜乳在发酵剂与凝乳酶作用下发生凝固并经一定时间成熟而制成的2遥在日常生活中用牦牛奶手工制作奶酪袁 不同家庭手工制作方式不同袁因此不同家庭做出来的奶酪质地尧酸度都有所不同遥 牦牛乳奶酪因独特风味尧较高的营养价值袁而深受塔吉克族人民的喜爱遥 帕米尔高原因较偏远袁人们生活方式独特袁那里的发酵乳制品等很多饮食结构仍处于原生态袁 没有城市化和工业化的痕迹遥 传统发酵乳制品更是如此袁仅用传统的发酵引子和手工容器遥 传统乳制品中蕴含着优质且独特的益生菌资源袁有待研究遥随着人们对牦牛乳制品的关注袁 对微生物多样性以及乳酸菌和酵母菌分离方面的研究报道较多袁 而对帕米尔高原区域发酵乳制品中微生物多样性及微生物分离方面尚未有文献报道袁 是一个野研究盲区冶遥 全面了解该地区传统发酵牦牛乳制品中微生物的多样性袁挖掘优势微生物资源袁具有重要意义遥1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1样品从喀什帕米尔高原塔县地区不同牧民家庭中采集 6 份发酵牦牛乳生奶酪遥1.1.2试剂与培养基改良 MRS 培养基尧MC 培养基尧改良 YGC 培养基袁青岛高科园海博生物技术有限公司曰 全式基因组提取试剂盒 渊EE101-01冤袁北京全式金生物技术有限公司曰PCR 试剂盒袁生工生物工程渊上海冤股份有限公司遥1.1.3仪器与设备生物显微镜渊Ci-L 型冤袁上海千欣仪器有限公司曰PCR 仪渊LNB48+型冤袁上海皓收稿日期院 2022-08-15基金项目院 国家自然科学基金项目渊32060528冤第一作者院 伊力米热 窑 热夏提袁女袁硕士生通信作者院 努尔古丽 窑 热合曼E-mail院 灾燥造援 23 晕燥援 8Aug援 圆 园 2 3允燥怎则灶葬造 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠中 国 食 品 学 报第 23 卷第 8 期圆 园 2 3 年 8 月第 23 卷 第 8 期庄仪器有限公司曰离心机渊BLF6 型冤袁上海一恒科技有限公司遥1.2方法1.2.1样本的准备将 6 份样本在无菌环境下分别装入灭菌处理的 5 mL 离心管中密封袁置于-80 益冰箱冻存遥 样本信息见表 1遥1.2.2样本高通量测序及数据分析高通量测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成袁数据由上海美吉生物医药科技有限公司平台处理遥 所选引物见表 2遥采集样本编号样本编号1 号样品A尧A_1尧A_2每个样本准备 3个平行2 号样品B尧B_1尧B_23 号样品C尧C_1尧C_24 号样品D尧D_1尧D_25 号样品E尧E_1尧E_26 号样品F尧F_1尧F_2表 1样本信息Table 1Sample information引物名称细菌 16S rDNA渊V3+V4冤区域338F渊5-ACTCCTACGGGAGGCGCAGCA-3冤806R渊5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3冤真菌 ITS 区域ITS1F渊5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3冤ITS2R渊5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3冤表 2引物表Table 2Primer table1.2.3菌株的分离纯化取 500 滋L 混匀的样品加入 4 500 滋L 无菌生理盐水中袁以稀释法进行梯度稀释遥 将样品梯度稀释后涂布于 MRS尧MC 和YGC 平板培养皿中袁将 MRS 和 MC 平板培养皿置37 益培养 48 h袁YGC 平板培养皿置 28 益培养 48h遥 挑取特征单菌落反复划线分离袁 直至可在显微镜下清晰看到纯菌种为止遥 将分离纯化的细菌进行革兰氏染色3袁将酵母菌进行美兰染色4袁并用甘油管保存于-80 益遥1.2.4基因组 DNA 提取及其电泳检测基因组DNA 的提取院DNA 的提取步骤按基因组提取试剂盒说明书袁并将提取的 DNA 保存于-20 益遥基因组DNA 电泳院 采用 1.0豫的琼脂糖凝胶对提取的DNA 进行电泳袁电压 80 灾袁时长 40 min5袁观察电泳结果遥1.2.5PCR 扩增细菌 16S rDNA 序列和酵母菌26S rDNA D1/D2 隔间区序列1冤 细菌 16S rDNA 序列 PCR 扩增体系6见表 3遥试剂25 滋L 反应体系中加样体积辕滋L扩增程序基因组模板 DNA2渊预变性冤94 益 4 min30 个循环2伊Easy TaqTM PCR SuperMix13.5渊变性冤90 益 30 s引物 27F渊5忆-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3忆冤0.5渊退火冤58 益 30 s引物 1495R渊5忆-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3忆冤0.5渊延伸冤72 益 1 min双蒸水补足至 25渊延伸冤72 益 1 min表 3细菌 16S rDNA 序列 PCR 扩增体系及扩增程序Table 3PCR amplification system and procedure of 16S rDNA sequence of bacteriaPCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测袁最终将 PCR 产物寄到上海生工生物工程股份有限公司测序袁 并将得到的序列在 NCBI 上使用 BLAST进行相似序列搜索程序比对遥2冤 酵母菌 26S rDNA D1/D2 隔间区 PCR 扩增体系7见表 4遥喀什帕米尔高原牦牛乳传统发酵生奶酪中微生物多样性及分子鉴定343中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期采样的读取数Number of reads sampled渊a冤细菌渊b冤真菌采样的读取数Number of reads sampled图 1不同样本稀释曲线Fig.1Dilution curves of different samples试剂25 滋L 反应体系中加样体积辕滋L扩增程序基因组模板 DNA2渊预变性冤94 益 4 min30 个循环2伊Easy TaqTM PCR SuperMix10渊变性冤90 益 45 s正向引物 NL1渊5忆-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3忆冤0.5 渊退火冤55 益 45 s反向引物 NL4渊5忆-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3忆冤0.5渊延伸冤72 益 1 min双蒸水补足至 25渊延伸冤72 益 10 min表 426S rDNA D1/D2 隔间区 PCR 扩增体系及扩增程序Table 4PCR amplification system and procedure of 26S rDNA D1/D2 regionPCR 产物经 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测袁将PCR 产物寄到上海生工生物工程股份有限公司测序袁 并将得到的序列在 NCBI 上使用 BLAST 进行相似序列搜索程序比对遥2结果与分析2.1测序质量分析细菌 16S rDNA 基因 V3-V4 区共获优化序列 945 432袁 平均序列长度 428 bp袁 所有序列按97%的相似度进行 OTU 聚类袁 从 18 个样本中共检测到 1 界尧5 门尧7 纲尧12 目尧18 科尧22 属尧30 种尧32 OTU曰 真菌 ITS 区域共获优化序列 1 302 962袁平均序列长度 281 bp袁 所有序列按 97%的相似度进行 OTU 聚类袁 从 18 个样本中共检测到 1 界尧5门尧15 纲尧35 目尧59 科尧81 属尧100 种尧121 OTU遥稀释曲线可用来比较测序数量不同的样本物种丰富度8遥由图 1a尧1b 可知袁 不同奶酪样品的稀释曲线均趋于平缓袁说明本次测序数据量充足袁测序量合理袁可用来研究细菌和真菌的群落结构遥2.2不同奶酪样品中微生物 Alpha 多样性分析常见的 Alpha 多样性指数包括香农指数尧辛普森指数尧Chao1 指数尧Ace 指数和 Coverage 指数等9遥 群落丰富度指数包括 Ace 指数和 Chao1 指数袁通常用这两个指标来衡量物种的丰富度遥它们越大表示该样本中的物种越丰富遥 群落多样性指数包括香农指数和辛普森指数袁 通常用这两个指标来衡量样本的多样性遥香农指数值越大袁辛普森指数值越小表示群落多样性越高遥 Coverage 指数主要用来检测测序对物种的覆盖度袁Coverage 指数值越高袁 样本中序列没被测出的概率越低遥Coverage 指数反映样品测序结果是否具有真实性遥由表 5 和表 6 可知袁D 号样品的 Ace 指数最大袁说明 D 号奶酪样品中细菌和真菌最丰富遥A 号样品的 Chao1 指数最大袁 说明 A 号奶酪样品中细菌和真菌的群落丰富度最大遥 A 号样品的香农指344第 23 卷 第 8 期数最大袁辛普森指数最小袁说明 A 号奶酪样品的细菌和真菌群落多样性相比其它奶酪样品要高遥Coverage 指数对所有样本的覆盖率均在 99%以上袁说明样本测序结果具有真实性遥样品编号Chao1 指数ACE 指数Shannon 指数Simpson 指数Sobs 指数CoverageA20.58 依 0.46a21.06 依 0.62a1.15 依 0.09a0.43 依 0.05b20.33 依 0.33a0.99B10.50 依 1.80bc15.99 依 4.74a0.55 依 0.08c0.66 依 0.07a8.00 依 0.58c0.99C8.17 依 1.17bc9.39 依 2.09a0.64 依 0.04bc0.58 依 0.04ab7.67 依 0.67c0.99D13.33 依 4.26b27.34 依 15.16a0.51 依 0.06c0.69 依 0.05a8.33 依 1.76c0.99E6.50 依 0.76c9.16 依 1.62a0.52 依 0.07c0.68 依 0.06a6.00 依 0.58c0.99F13.83 依 1.42b15.08 依 0.65a0.79 依 0.01b0.55 依 0.01ab12.67 依 1.33b0.99表 5不同样品细菌 琢-多样性分析Table 5Analysis of bacterial alpha diversity in different samples注院同列不同字母表示差异显著渊P约0.05冤遥样品编号Chao1 指数ACE 指数Shannon 指数Simpson 指数Sobs 指数CoverageA32.79 依 1.95a33.56 依 2.63ab1.44 依 0.08a0.30 依 0.05c30.67 依 3.38a0.99B10.00 依 2.08b21.76 依 4.13b0.06 依 0.03d0.97 依 0.01a6.67 依 0.67b0.99C9.67 依 1.69b11.72 依 1.74b0.05 依 0.01d0.98 依 0.01a8.00 依 1.00b0.99D31.33 依 5.90a36.62 依 6.16a0.30 依 0.06c0.91 依 0.02a29.33 依 6.89a0.99E16.00 依 0.58b16.15 依 0.60b0.15 依 0.04cd0.96 依 0.01a16.00 依 0.58b0.99F26.87 依 2.77a37.66 依 5.63a0.81 依 0.05b0.63 依 0.03b21.67 依 4.81ab0.99表 6不同样品真菌 琢-多样性分析Table 6Analysis of fungal alpha diversity in different samples注院同列不同字母表示差异显著渊P约0.05冤遥2.3不同奶酪样品中微生物群落在门和属水平上的组成分析为了得知优势物种在个样本中的丰度和变化情况袁对微生物的群落组成进行分析遥在门水平上袁 从 6 份奶酪样本中共检测到 5个细菌门揖分别是厚壁菌门渊Firmicutes冤尧变形菌门渊Proteobacteria冤尧拟杆菌门渊Bacteroidota冤尧蓝藻菌门渊Cyanobacteria冤尧放线菌门渊Actinobacteriota冤铱和5 个真菌门揖分别是子囊菌门渊Ascomycota冤尧担子菌门渊Basidiomycota冤尧未分类的真菌类群渊unclas鄄sified_k_Fungi冤尧被孢霉门渊Mortierellomycota冤尧新丽鞭菌门渊Neocallimastigomycota冤铱袁其中厚壁菌门为优势细菌门袁子囊菌门为优势真菌门遥在属水平上袁6 份奶酪样品中乳杆菌属渊Lac鄄tobacillus冤尧链球菌属渊Streptococcus冤都占绝对优势遥 其中每组样品中乳杆菌属尧链球菌属尧醋酸杆菌属渊Acetobacter冤所占比例不同渊图 2 所示冤遥在属水平上袁 每组奶酪样品中微生物所占比例都有所不同袁其中 A 号和 F 号样品中微生物最丰富遥 A 号样品中伊萨酵母属渊Issatchenkia冤占绝对优势袁F 号样品中有孢圆酵母属渊Torulaspora冤占绝 对 优 势 袁 其 它 4 组 样 品 中 克 鲁 维 酵 母 属渊Kluyveromyces冤占绝对优势渊图 3 所示冤遥2.4不同奶酪样品中微生物 Beta 多样性分析主坐标轴分析 渊Principalco-ordinates analy鄄sis冤袁 是一种对数据进行降维的非约束性分析方法袁可反映不同样本的群落组成相似性和差异性8遥细菌 PC1 贡献率为 53.35%袁PC2 贡献率为37.82%遥 6 份传统牦牛乳发酵生奶酪样品中 A 号样品与其它 5 组样品距离较远袁说明具有差异性袁然而 B尧C尧D尧E尧F 相对较近袁也有重叠现象袁说明这 5 组奶酪样品细菌群落结构具有相似性 渊图 4所示冤遥真菌 PC1 贡献率为 79.47%袁PC2 贡献率为18.84%遥 6 份传统牦牛乳发酵生奶酪样品中 A 和F 号样品与其它 4 组样品距离较远袁 这说明 A 号和 F 号生奶酪样品中真菌的群落结构比较独立袁且与其它 4 份生奶酪样品的真菌群落结构之间是喀什帕米尔高原牦牛乳传统发酵生奶酪中微生物多样性及分子鉴定345中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期样品Sample图 3不同样品真菌属水平柱状图Fig.3Bar diagram of fungal genus levelin different samples样品Sample图 2不同样品细菌属水平柱状图Fig.2Bar diagram of bacterial genus levelin different samplesPC1渊53.35%冤图 4基于加权 Unifirac 距离的不同样品细菌 PCoA 图Fig.4Bacterial PCoA diagram of different samplesbased on weighted unifirac distancePC1渊79.47%冤图 5基于加权 Unifirac 距离的不同样品真菌 PCoA 图Fig.5PCoA diagram of fungi in different samplesbased on weighted unifirac distance有一定的差异的袁而 B尧C尧D尧E 有重叠现象袁说明这 4 组奶酪样品真菌群落结构具有相似性 渊图 5所示冤遥2.5菌株的分离与纯化6 份传统牦牛乳发酵生奶酪中细菌和酵母菌有丰富的微生物多样性袁 研究发现其中细菌和酵母菌的总数在 108耀1012CFU/g 之间遥 6 份奶酪样品袁 在改良的 MRS 平板上共分离纯化得到 46 株细菌袁在 MC 平板上共分离纯化得到 6 株细菌袁在改良 YGC 平板上共分离纯化得到 46 株酵母菌袁观察菌株的形态学特征遥 菌株的菌落形态或大而凸起尧或小而扁平袁菌落颜色有白色或乳白色袁菌落边缘整齐不透明遥2.616S rDNA 序列分析结果以 52 株细菌的基因组 DNA 为模板袁 采用引物 27F尧1495R 扩增出 16S rDNA 序列袁 并对扩增产物进行电泳袁电泳条带在 1 500 bp 左右遥鉴定结果见表 7遥由表 7 可知袁52 株细菌经分子鉴定归属为 7个属 11 个种袁其中 TM-1尧TM-7尧TM-10尧TM-25尧TM-28 属于耐久肠球菌袁TM-3尧TM-16尧TM-20尧TM-24 属 于粪肠球 菌袁TM-9尧TM-22尧2TM-9尧3TM-2尧3TM-3尧3TM-4尧3TM-5尧3TM-6尧4TC-2尧346第 23 卷 第 8 期4TM-5尧4TM-6尧4TM-7尧4TM-9尧4TM-10尧5TM-1尧5TM-10尧5TC-1尧5TC-2尧6TM-1尧6TM-3尧6TM-5尧6TM-10尧6TM-12 属于热带芽孢杆菌袁2TC-1尧2TM-6尧2TM-12尧3TC-3 属于蜡样芽孢杆菌袁5TC-3 属于类副粘杆菌袁TM-26尧TM-27尧TM-31 属于副干酪乳杆菌袁TM-30 属于鸡乳杆菌袁TM-21 属于希腊假单胞菌袁3TM-9 属于霍氏肠杆菌袁3TM-1尧3TM-10尧3TM-11尧4TM-1尧4TM-11尧5TM-3尧6TM-6尧6TM-8 属于细黄链霉菌袁5TM-4 属于表皮葡萄球菌遥属名菌株编号种名同源性/%肠球菌属TM-1尧TM-7尧TM-10尧TM-25尧TM-28耐久肠球菌渊Enterococcus durans冤跃99TM-3尧TM-16尧TM-20尧TM-24粪肠球菌渊Enterococcus faecium冤跃99芽孢杆菌属TM-9尧TM-22尧2TM-9尧3TM-2尧3TM-3尧3TM-4尧3TM-5尧3TM-6尧4TC-2尧4TM-5尧4TM-6尧4TM-7尧4TM-9尧4TM-10尧5TM-1尧5TM-10尧5TC-1尧5TC-2尧6TM-1尧6TM-3尧6TM-5尧6TM-10尧6TM-12热带芽孢杆菌渊Bacillus tropicus冤跃992TC-1尧2TM-6尧2TM-12尧3TC-3蜡样芽孢杆菌渊Bacillus cereus冤跃995TC-3类副粘杆菌渊Bacillus paramycoides冤跃99乳杆菌属TM-26尧TM-27尧TM-31副干酪乳杆菌渊Lactobacillus paracasei冤跃99TM-30鸡乳杆菌渊Lactobacillus gallinarum冤跃99假单胞菌属TM-21希腊假单胞菌渊Pseudomonas helleri冤100肠杆菌属3TM-9霍氏肠杆菌渊Enterobacter hormaechei冤跃99链球菌属3TM-1尧3TM-10尧3TM-11尧4TM-1尧4TM-11尧5TM-3尧6TM-6尧6TM-8细黄链霉菌渊Streptomyces microflavus冤跃99葡萄球菌属5TM-4表皮葡萄球菌渊Staphylococcus epidermidis冤跃99表 7细菌鉴定结果Table 7Bacterial identification results2.7细菌系统发育树的构建采 用 MEGA 7.0 软 件 构 建 系 统 发 育 树渊Neighbor-Joining 法冤袁结果如图 6 所示遥2.826S rDNA D1/D2 隔间区序列分析结果以 46 株酵母菌的基因组 DNA 为模板袁 采用通用引物 NL1尧NL4 扩增出 26S rDNA D1/D2 隔间区序列袁 并对扩增产物进行电泳袁 电泳条带在600 bp 左右遥 鉴定结果见表 8遥由表 8 可知袁46 株酵母菌经分子鉴定归属为8 个属 9 个种袁其中 TY-6尧TY-7 属于解脂耶氏酵母袁TY-17 属于诞沫假丝酵母袁TY-20 属于发酵毕赤酵母袁2TY-1尧2TY-2尧2TY-3尧2TY-4尧2TY-5尧2TY-6尧2TY-7尧2TY-8尧2TY-10尧3TY-1尧3TY-2尧3TY-3尧3TY-4尧3TY-5尧3TY-6尧3TY-8尧3TY-11尧4TY-1尧4TY-2/4TY-3尧4TY-4尧4TY-8尧5TY-3尧5TY-4尧5TY-5尧5TY-6尧5TY-8尧5TY-9尧5TY-10尧6TY-1尧6TY-4 属于库德毕赤酵母袁TY-25 为普兰久浩酵母袁2TY-9尧4TY-9尧6TY-6 属于异常威克汉逊酵母袁4TY-5尧4TY-6尧4TY-11尧5TY-1 属于马克思克鲁维酵母袁5TY-2尧5TY-6 属于东方伊萨酵母袁6TY-2 属于酿酒酵母遥2.9酵母菌系统发育树构建将采用 MEGA 7.0 软件构建系统发育树渊Neighbor-Joining 法冤遥 如图 7 所示遥2.10高通量测序与传统培养法在属水平上的比较高通量测序结果与实验室通过传统培养方法分离鉴定出来的菌之间也有差异性袁见表 9遥由表 9 可知袁 通过高通量测序技术检出的细菌和酵母菌除了链球菌属尧醋酸杆菌属尧有孢圆酵喀什帕米尔高原牦牛乳传统发酵生奶酪中微生物多样性及分子鉴定347中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期图 6细菌系统进化树Fig.6Bacterial phylogenetic tree属名菌株编号种名同源性/%耶氏酵母属TY-6尧TY-7解脂耶氏酵母渊Yarrowia lipolytica冤跃99假丝酵母TY-17诞沫假丝酵母渊Candida zeylanoides冤跃98毕赤酵母属TY-20发酵毕赤酵母渊Pichia fermentans冤跃992TY-1尧2TY-2尧2TY-3尧2TY-4尧2TY-5尧2TY-6尧2TY-7尧2TY-8尧2TY-10尧3TY-1尧3TY-2尧3TY-3尧3TY-4尧3TY-5尧3TY-6尧3TY-8尧3TY-11尧4TY-1尧4TY-2尧4TY-3尧4TY-4尧4TY-8尧5TY-3尧5TY-4尧5TY-5尧5TY-6尧5TY-8尧5TY-9尧5TY-10尧6TY-1尧6TY-4库德毕赤酵母渊Pichia kudriavzevii冤跃99表 8酵母菌鉴定结果Table 8Yeast identification results348第 23 卷 第 8 期属名菌株编号种名同源性/%久浩酵母TY-25普兰久浩酵母渊Guehomyces pullulans冤跃99威克汉逊酵母属2TY-9尧4TY-9尧6TY-6异常威克汉逊酵母渊Wickerhamomyces anomalus冤跃99克鲁维酵母属4TY-5尧4TY-6尧4TY-11尧5TY-1马克思克鲁维酵母渊Kluyveromyces marxianus冤跃99伊萨酵母属5TY-2尧5TY-6东方伊萨酵母渊Issatchenkia orientalis冤跃99酵母属6TY-2酿酒酵母渊Saccharomyces cerevisiae冤跃99渊续表 8冤图 7酵母菌系统进化树Fig.7Yeasts phylogenetic tree母属尧地霉菌属尧双足囊菌属尧Banhegyia 酵母属以外袁都可通过可培养的方法分离出来遥未分离出的细菌和酵母菌说明传统培养方法的局限性袁 也有可能是选择的培养基不全面遥 今后可继续改良培养基以分离更多与高通量测序结果一致的优势菌遥喀什帕米尔高原牦牛乳传统发酵生奶酪中微生物多样性及分子鉴定349中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期微生物属水平高通量测序传统培养法细菌乳杆菌属渊Lactobacillus冤+链球菌属+醋酸杆菌属+肠球菌属渊Enterococcus冤+芽孢杆菌属渊Bacillus冤+假单胞菌属渊Pseudomonas冤+酵母菌克鲁维酵母属渊Kluyveromyces冤+有孢圆酵母属渊Torulaspora冤+伊萨酵母属+地霉菌属渊Geotrichum冤+双足囊菌属渊Dipodascus冤+Banhegyia酵母属渊Banhegyia冤+毕赤酵母属渊Pichia冤+维克汉姆酵母属渊Wickerhamomyces冤+酵母属渊Saccharomyces冤+表 9两种方法在属水平上的分析Table 9Analysis of two methods at genus level3结论与讨论本文的高通量测序结果显示袁细菌 16S rDNA基因 V3-V4 区共获得优化序列 945 432遥 真菌 ITS区域共获得优化序列 1 302 962遥在属水平上袁优势细菌属为乳杆菌属和链球菌属袁 优势真菌属为克鲁维酵母属尧有孢圆酵母属尧伊萨酵母属和未分类的真菌类群遥 张冬蕾10通过高通量测序技术对新疆昭苏县和特克斯县采集酸牛奶样品中的微生物资源进行分析袁在属水平上袁乳杆菌属是优势细菌属袁酿酒酵母属是优势真菌属曰玛依拉 窑 艾海提9对南疆传统酸奶中微生物多样性的分析表明袁 乳杆菌属和链球菌属为优势细菌属袁 酵母菌属和克鲁维酵母属为优势真菌属遥 本研究结果表明袁喀什帕米尔高原牦牛乳传统发酵生奶酪微生物结构与其它地区发酵乳制品微生物结构有明显的差距袁具有自己的微生物多样性遥 主坐标轴渊PCoA冤分析表明袁6 份样品的群落结构之间既有相似性也有差异性袁 这是由不同家庭的手工制作方式和制作环境的不同所致遥通过在实验室纯培养方法分离鉴定了 52 株细菌袁将其归为 7 个属 11 个种曰分离鉴定了 46 株酵母菌袁将其归为 8 个属 9 个种遥 这个结果说明塔县传统牦牛乳发酵奶酪中细菌和酵母菌资源种类丰富遥 刘珊春等11尧Ao 等12在我国传统牦牛乳中发现了耐久肠球菌和副干酪乳杆菌遥 Dolci 等13在传统奶酪渊Castelmagno PDO冤中发现副干酪乳杆菌遥不同地区乳制品中都发现耐久肠球菌尧 粪肠球菌和副干酪乳杆菌袁 说明本研究分离出来的耐久肠球菌尧粪肠球菌尧副干酪乳杆菌是生奶酪中常见的乳酸菌遥 肠球菌作为非发酵剂乳酸菌渊NSLAB冤存在于各种奶酪中14遥 副干酪乳杆菌广泛存在与奶酪中袁不仅能增进发酵食品的营养价值袁改善口感和风味袁还能产生抗菌物质袁延长发酵食品的保存时间15遥Lopandic 等16尧Jakobsen 等17在奶酪乳制品中发现了解脂耶氏酵母尧诞沫假丝酵母尧酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母遥 李宇辉等18尧芦文娟等19尧王冠群等20尧李王强等21尧王远微等22在新疆传统奶酪乳制品中发现了发酵毕赤酵母尧酿酒酵母尧马克思克鲁维酵母尧库德毕赤酵母尧东方伊萨酵母遥 这说明本研究分离的解脂耶氏酵母尧诞沫假丝酵母尧发酵毕赤酵母尧 库德毕赤酵母尧 马克思克鲁维酵母尧东方伊萨酵母尧酿酒酵母是生奶酪乳制品中常见的酵母菌遥 解脂耶氏酵母中含有的大量脂肪酶和酯酶袁 是在奶酪成熟过程中发挥重要作用的分解脂肪的菌株之一23袁这一特性需进一步研究遥本研究中还发现了热带芽孢杆菌尧 蜡样芽孢350第 23 卷 第 8 期杆菌尧类副粘杆菌尧希腊假单胞菌尧鸡乳杆菌尧霍氏肠杆菌尧细黄链霉菌尧表皮葡萄球菌等遥Von 等24从生牛奶中分离出希腊假单胞菌遥 文献报道假单胞菌属是原料奶样品和半成品奶制品中最普遍和最丰富的属遥这些菌在低温下生长良好袁能分解乳中蛋白质导致牛乳胨化袁 分解脂肪导致牛乳产生哈喇味袁引起乳制品腐败变质遥帕米尔高原地区温度较低袁为假单胞菌生长提供了良好的条件遥霍氏肠杆菌是正常的肠道微生物遥 任冬艳等25在传统奶酪样品中发现了霍氏肠杆菌为优势菌群遥 王晓雯等26在塔城奶酪中发现了表皮葡萄球菌袁它是滋生于生物体表面的一种正常细菌袁 大多数为非致病菌遥这些细菌虽不是致病菌袁但影响奶的质量和口感袁它反映生奶酪制作过程中不良的卫生条件遥综上所述袁 喀什帕米尔高原塔县地区传统牦牛乳发酵生奶酪中微生物资源丰富遥 本研究结果为今后该地区传统发酵生奶酪微生物资源开发提供了参考遥参考文献1宋樾.塔什库尔干地区铁矿成因类型及成矿环境研究D.长春院 吉林大学袁 2019.SONG Y.Study on genetic types and metallogenicenvironment of iron deposits in the Taxkorgan areaD.Changchun院 Jilin University袁 2019.2顾春华袁 刘煜袁 王建军袁 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