抗破伤风毒素中和单克隆抗体筛选及重组表达.pdf
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1、新疆医学第 53 卷第 53 卷第 7 期2023 年 7 月新疆医学XINJIANG MEDICAL JOURNALVol.53No.7July.2023Screening and recombinant expression of neutralizing monoclonal antibodies against tetanus toxinLIXin,ZHUChongri,WUQiong(Shanghai Serum Bio-Technology Limited company,Shanghai,201707,China)Abstract:ObjectiveTo prepare muri
2、ne neutralizing monoclonal antibodies(MAbs)binding with different tetanus toxoid regionsand obtain their humanized MAbs.MethodsFirstly,after BALB/c mice were immunized with tetanus toxoid and their B cells werefused and screened,the expression supernatant of positive hybridoma cells was detected by
3、ELISA and protective test,and four MAbs withprotective function were obtained.Secondly,the competitive relationships of their binding sites were determined by ELISA,and therecombinant Trx-HCC was also used as antigen to locate their binding region of tetanus toxoid.Lastly,Two of Mabs were humanized,
4、expressed in CHO cells,purified and determined for neutralization activity.ResultsFour non-competitive MAbs named S3A4,9-7A4,9-8C7 and S1D2 were obtained,whose neutralizing activity were 52IU/ml,53IU/ml,58IU/ml and 60IU/ml,respectively.9-7A4 and9-8C7 can bind specifically to HCC region of tetanus to
5、xoid while S3A4 and S1D2 can bind specifically to non-HCC region.Theneutralization activity of the humanized and expressed products of 9-7A4 and S3A4 were 38IU/mg and 35IU/mg,respectively,and theneutralization activity could reach 70 IU/mg when they were mixed.ConclusionTwo humanized MAbs against te
6、tanus toxin withneutralizing activity were obtained,which can lay the foundation for the treatment of tetanus drug or the titer detection of the vaccine.Key words:Immunity;Tetanus;Neutralizing monoclonal antibody;Humanization论著抗破伤风毒素中和单克隆抗体筛选及重组表达李鑫,朱崇日,吴琼(上海赛伦生物技术股份有限公司,上海 201707)摘要:目的制备结合不同破伤风类毒素区
7、域的中和性鼠源单抗,并对其进行人源化。方法首先,破伤风类毒素免疫 BALB/c 小鼠、细胞融合及筛选后,ELISA 法和小鼠中和保护实验检测阳性杂交瘤细胞株表达上清,获得 4 个具有中和活性的单抗。其次,采用 ELISA 法确定它们结合位点的竞争关系,并用重组表达的 Trx-HCC 为抗原对其结合区域定位。最后,将其中 2 个单抗进行人源化、在 CHO 细胞中重组表达、纯化和测定中和活性。结果筛选出 4 株无相互竞争关系的中和活性单克隆抗体,分别命名为 S3A4、9-7A4、9-8C7 和 S1D2;它们的中和效价分别为 52IU/ml、53IU/ml、58IU/ml 和 60IU/ml,9-
8、7A4 和 9-8C7 特异性结合 HCC 段,而 S3A4 和 S1D2 特异性结合非 HCC 段,9-7A4 和 S3A4 其人源化后的表达产物效价分别为 38IU/mg 和 35IU/mg,两者混合使用时,其效价可达 70IU/mg。结论获得 2 株人源化具有中和活性的抗破伤风毒素单克隆抗体,为破伤风药物治疗或疫苗效价检测等奠定了基础。关键词:免疫;破伤风;中和性单抗;人源化中图分类号:R436.1文献标识码:A文章编号:10015183(2023)0781408破伤风是由破伤风杆菌分泌的主要是破伤风毒素引起的一种神经性疾病,破伤风毒素是由1315 个氨基酸组成的分子量大约为 150 k
9、D 的蛋白,它由 50 kD 轻链(LC)通过二硫键与 100 kD 重链(LN)链接而成。根据其功能分为 LC、HCN、HCC三个片段,LC 是锌依赖蛋白酶,具有神经毒性,HCN 负责毒素转运,HCC 片段包含神经细胞受体结合结构域1。破伤风毒素含有多个中和表位,通过多种机制产生具有协同型效应的多抗混合物2。本研究拟通过小鼠杂交瘤技术及人源化技术制备抗体,为破伤风药物治疗或疫苗效价检测等奠定了基础。1 资料与方法1.1 一般资料破伤风类毒素由宁波荣升公司生产(批号:501701),BALB/c 小鼠购自上海生物制品所,所有免疫用 BALB/c 小鼠均为 3 周龄、雌性、标准化无作者简介:李鑫
10、,男,硕士,生物医学中级职称,研究方向:抗体制备及纯化。第 7 期病、健康的纯种小鼠,符合美国 FDA 标准。SP2/0骨髓瘤细胞购自美国 ATCC 公司;RPM1640 培养液、胎牛血清为 Gibco 产品;protein A 和 SP 凝胶购自美国 GE Healthcare;超滤管为 Millipore 产品;破伤风毒素和破伤风抗毒素标准品购自中国食品药品检定研究院。pMD18T 克隆载体试剂盒购自Takara 公司,无内毒素大提试剂盒购自北京康为世纪(货号:CW2107)。RNA 抽提试剂盒、胶回收试剂盒、HRP 标记的羊抗鼠二抗和其他常规性化学品购自生工生物工程(上海)股份有限公司(
11、以下简称:上海生工)产品;HCC 融合 Trx 蛋白由本公司制备3。1.2 研究方法1.2.1 小鼠免疫和细胞融合按常规方法4,破伤风类毒素免疫 BALB/c 小鼠,并将将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0 融合,使用含有 HAT(25 X)的常规 RPM 1640 培养液筛选14d 后,取上清进行检测。1.2.2 杂交瘤表达上清 ELISA、中和保护实验和结合区域定位用 1g/mL 破伤风类毒素包被 96 孔酶标板,4孵育过夜,洗板及封闭后,分别按照倍数 110、1100、11000 和 12000 稀释杂交瘤细胞上清后作为一抗加入 0.1mL,37孵育 1h 和洗板后,加入 0.1mL 稀
12、释倍数为 12000 的 HRP 标记羊抗鼠作为二抗。当稀释倍数100 倍且其 OD4501 者被认为是阳性克隆,被用于小鼠中和保护实验。小鼠中和保护实验按照中国药典 2015 版通则3508 执行,杂交瘤表达上清的效价应为与对照小鼠同时死亡或出现破伤风神经毒症状最重者的最高稀释度。ELISA 被用于进一步鉴定所获得的具有中和保护作用的鼠单克隆抗体结合区域,与上述从杂交瘤细胞上清筛选阳性克隆的不同之处在于:(1)1 g/mL 破伤风类毒素和 HCC 融合 Trx 蛋白被分别包板;(2)一抗按照未稀释、110 和 1100 三个梯度稀释;1.2.3ELISA 叠加法鉴定杂交瘤表达上清的竞争关系与
13、 1.2.2ELISA 法的差异在于:(1)破伤风类毒素抗原包被量是 0.125g,以保证加入抗体过量;(2)加入一抗:以 9-7A4 和 9-8C7 为一组的两孔中,都分别同时加入新鲜 110 稀释的 9-7A4 和 9-8C7 抗体 0.1mL,S3A4 和 S1D2 的一组中也做类似的处理。结果判断:若 9-7A4 和 9-8C7 不存在竞争关系,则 OD450 应为 9-7A4 单独加入时的 1.5 倍以上;若 9-7A4 和 9-8C7 存在竞争关系,则 OD450应与 9-7A4 单独加入时相当,同理也可以判断S3A4 和 S1D2 的竞争性关系。1.2.4 单抗可变区编码序列获得
14、、测序及分析参考上海生工的总 RNA 抽提试剂盒使用说明书,从杂交瘤细胞株中提取总 RNA,然后以 Oli-go(dT)18 为引物和总 RNA 为模板 RT-PCR 法制备 cDNA。反应条件:30 10 min;42 15 min;70 15min;4保存;使用表 1 中的引物,PCR 扩增抗破伤风毒素鼠源单抗可变区基因。PCR 参数设置:94,预变性,5min;30cycles:94变性,0.5min,65复性,0.5min,72延伸,1.0min;72延伸,10min。用 1%琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 扩增结果,并使用胶回收试剂盒回收 PCR 扩增片段,并连接于pMD18T 克隆载体
15、(购自 Takara 公司)上,转入DH5 大肠杆菌感受态细胞中,进行蓝白斑筛选,将阳性克隆送上海生工测序。根据 NCBI IgBLAST(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)免疫球蛋白基因比对分析测序结果,筛选出功能性抗体可变区基因。表 1 PCR 扩增重链 H,轻链 L 的引物Primer 名称LR序列(5 to 3)GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAAHF1AGGTCCAGCTGCTCGAGTCTGGLF7CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCALF6CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCC
16、ALF4CCGGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCALF5CCGGATGTGAGCTCGTGATGACCCGAGCTCCALF2CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCCLF3CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCAHF8AGGTCCAACTTCTCGAGTCAGGHRlAGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAATHR2GTTCTGACTAGTGGGCTCTCTGGGCTCHR3GGGGGTACTAGTCTTGGGTATTCTAGGCTCLF1CCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCTHF2
17、AGGTCCAGCTGCTCGAGTCAGGHF3AGGTCCAGCTTCTCGAGTCTGGHF4AGGTCCAGCTTCTCGAGTCAGGHF5AGGTCCAACTGCTCGAGTCTGGHF6AGGTCCAACTGCTCGAGTCAGGHF7AGGTCCAACTTCTCGAGTCTGG李鑫,等;抗破伤风毒素中和单克隆抗体筛选及重组表达815新疆医学第 53 卷1.2.5 CDR 移植技术人源化鼠单抗使用 CDR 移植技术进行人源化5,以 9-7A4 和S3A4 的轻链和重链在 NCBI(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)库中进行 blastn 比对获得相应人的核苷
18、酸序列。依据 WHO 2011 年推荐的命名原则:将来自其他物种 CDR 植入人的抗体链中,所获得抗体加上后缀-zumb6,因此,暂时将 S3A4 和 9-7A4 人源化后的单抗命名为 S3A4-zumb 和 9-7A4-zumb。1.2.6 人源化抗体的质粒构建分泌信号肽选用小鼠 kappa 链的信号肽:METDTLLLWVLLLWVPGSTG,人 IgG1(IMGT 命名为 IGHG1)的轻链 型的恒定区氨基酸序列:RT-VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC
19、EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。人 IgG1(IMGT 命名为 IGHG1)的重链恒定区氨基酸(EU 编码体系)为:ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS
20、RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。将 9-7A4 和 S3A4 人源化后的序列与上述信号肽、轻链 型的和重链恒定区氨基酸连接起来,送上海生工进行基因合成并亚克隆到 pCDNA3.1(+)中。1.2.7 蛋白表达稳转株建立和纯化利用无内毒素大提试剂盒(CW2107 北京康为世纪)进行质粒大提。将 CHO-S 细胞培养在 CDCHO培养基(Gibco,货号:10743-029)中,置于 37,5CO2细胞培养箱中进行培养,准备好细胞后,使用Lip
21、ofectamineR2000(Invitrogen,货号:L3000-015)将质粒转染到 CHO-S 细胞中。参考说明书(FreedomCHO-S kit user guide P32)3 日,采用共转染和有限稀释法筛选稳定株,筛选 8 周后,获得了稳定表达株。将筛选得到的高表达克隆株用无血清培养基扩大培养,1000g 离心收获并用 0.22uM 滤膜过滤表达上清后。首先,用 protein A 凝胶层析,其条件是:用平衡缓冲液(20 mM PB,PH7.0)平衡层析柱后,表达上清过亲和层析柱,用洗脱缓冲液(20nmGly-CL,PH3.2)洗脱。其次,继续用 SP 阳离子交换层析,其条件
22、是:平衡缓冲液 A(20mM,PH6.0)平衡层析柱后,样品用双纯水稀释电导至 3.0ms-3.5ms之问,过 SP 柱子结合后,用洗脱缓冲液 B(20Mm,1.5M NaCL PH 6.0)线性洗脱;最后,浓缩置换缓冲液 PBS。9-7A4 和 S3A4 人源化后的表达产物的中和保护作用及其协同性作用,采用小鼠中和保护实验按照中国药典 2015 版通则 3508 的方法测定。1.2.8 检测方法参考 nano(Thermo 公司)操作手则,测定 Trx-TTC、抗体等蛋白浓度。2 结果2.1 中和活性杂交瘤抗体序列经破伤风类毒素免疫、细胞融合、培养基 HAT加压筛选和 ELISA 筛选,当稀
23、释倍数小于 100 倍且其 OD450 大于 1 者被认为是阳性克隆,被用于小鼠中和保护实验。共获得 4 株抗体,分别命名为S3A4、9-7A4、9-8C7 和 S1D2,它们的中和效价分别为 52IU/ml、53IU/ml、58IU/ml 和 60IU/ml,其杂交瘤细胞的表达。见图 1。在用破伤风类毒素和 Trx-HCC 作为包被抗原来鉴定四个单抗的结合区域实验中,S3A4、9-7A4、9-8C7 和 S1D2 的上清在以 110 稀释液中,均可图 1 抗体表达验证1:9-7A4;2:S3A4;3:S1D2;4:9-8C7;M:marker(伯乐公司,货号:161-0377)1234M81
24、6第 7 期以和破伤风类毒素结合,OD450 均大于 1,而未稀释的 S3A4 和 S1D2 不能结合 HCC 段,OD450 为0.2 左右。因此,9-7A4 和 9-8C7 特异性结合 HCC段,而 S3A4 和 S1D2 特异性结合非 HCC 段。将 S3A4、9-7A4、9-8C7 和 S1D2 采取叠加ELISA 鉴定它们之间的竞争关系,结果显示 9-7A4和 9-8C7、S3A4 和 S1D2 均不存在竞争性关系,其具体 OD450 读数如下:2.2 四个单抗的序列从四株杂交瘤细胞株中提取了总 RNA 并反转录成 cDNA,然后按照表 1 中的配对引物进行 PCR扩增,轻链混合引物
25、扩增出轻链可变区基因,重链混合引物扩增出重链可变区基因,其大小约为 650bp左右,条带单一,与预测的轻/重链基因片段的理论大小基本一致。见图 2。将 PCR 产物采用割胶回收了 650bp 处的片段,并亚克隆到 pMD18T 克隆载体中,经蓝白斑筛选,将阳性克隆经过上海生工测序,得到如下的序列。S3A4 轻链测序所得的核苷酸序列:ccagttccgagctcgtgatgacacagtctccagcctccctttctgcatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtcgagcaagtgattatatttacacttatttagcatggtatcagcagacacagggaaa
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