抗磷脂抗体与自然流产患者既往流产次数的相关性分析.pdf

1348生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期DOI:10.3969/j.issn.1004-3845.2023.09.008抗磷脂抗体与自然流产患者既往流产次数的相关性分析陈聪，游晓玲，莫李芳，陈现，李龙飞，蔡松辰，曾勇，李玉叶*（深圳中山泌尿外科医院生殖免疫实验室，广东省围着床期生殖免疫工程技术研究中心，深圳518 0 43）【摘要】目的探讨典型和非典型抗磷脂抗体与自然流产患者既往流产次数的相关性。方法选择2 0 19 年5月至2022年8 月于深圳中山泌尿外科医院就诊的自然流产患者8 7 8 例，根据患者既往流产次数分为1次流产组（S1组，n=478）、2次流产组（S2组，n=292）、3次流产组（S3组，n=73）及4次流产组（S4组，n=35）。采用化学发光法和酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测患者未孕状态下血清中典型抗磷脂抗体 抗2糖蛋白1抗体（a2GPI)、抗心磷脂抗体(aCL)】和非典型抗磷脂抗体 抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物抗体(aPS/PT)和抗膜联蛋白A5（a A NX A 5)的IgM型和IgG型水平，并比较分析各组间不同类型抗磷脂抗体阳性率的差异。结果非典型抗磷脂抗体aPS/PT(IgM+IgG)和aPS/PT-IgM阳性率在4组间具有显著性差异（P0.05），且S4组阳性率显著高于其余3组（P0.05）。典型抗磷脂抗体a2GPI(IgM+IgG)、a CL(Ig M+Ig G）、a 2GPI-IgM、a 2GPI-IgG、a CL-Ig M、a CL-Ig G 阳性检出率和非典型抗磷脂抗体aANXA5（I g M+I g G）、a A NX A 5-I g M、a A NX A 5-I g G 及aPS/PT-IgG阳性检出率，在4组患者中的差异均无统计学意义(P0.05）。结论a2GPI、a CL、a A NX A 5及其分型抗体与既往自然流产次数无显著相关性，但aPS/PT抗体作为非典型的抗磷脂抗体，在4次的自然流产次数患者中具有更高的临床检测价值，可作为评估自然流产患者风险的实验室辅助诊断指标。【关键词】自然流产；抗磷脂抗体；抗心磷脂抗体；抗2糖蛋白1抗体；抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物抗体；抗膜联蛋白A5抗体【中图分类号】R711.6Correlation between antiphospholipid antibodies and number of previous abortions in patients with spontaneousabortionCHEN Cong,YOU Xiao-ling，,M O Li-f a n g,C H EN X ia n，LI Lo n g-f e i,C A I So n g-c h e n,ZENGYong,LI Yu-ye*Laboratory of Reproductive Immunity,Shenzhen Zhongshan Urological Hospital,GuangdongImplantation Reproductive Immunity Engineering Technology Research Center,Shenzhen 518043Objective:To investigate the correlation between the typical and atypical antiphospholipid antibodiesand the number of previous spontaneous abortion.Methods:A total of 878 patients who experienced spontaneous abortion and visited in ShenzhenZhongshan Urological Hospital from May 2019 to August 2022 were included in this study.According tothe number of previous miscarriages,the patients were divided into four groups:one miscarriage group(Slgroup,n=478),two miscarriages group(S2 group,n=292),three miscarriages group(S3 group,n=73)andfour or more miscarriages group(S4 group,n=35).The serum IgG/IgM levels of typical antiphospholipidantibodies a n t i-2 glycoprotein 1 antibody（a 2GPI),anti-cardiolipin antibody（a CL）a n d a t y p i c a l【收稿日期】2 0 2 3-0 2-0 1；【修回日期】2 0 2 3-0 4-11【作者简介】陈聪，男，广东茂名人，本科，检验技师（中级），医学检验专业.（*通讯作者【文献标识码】A【A b s t r a c t 生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期antiphospholipid antibodies(anti-phosphatidylserine/prothrombin complex antibody(aPS/PT),anti-annexinV antibodies(aANXA5)in the patients with non-pregnant state were detected by chemiluminescence andenzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The positive rates of different subtypes of antiphospholipidantibodies among the groups were compared.Results:The positive rates of atypical antiphospholipid antibodies aPS/PT(IgM+IgG)and aPS/PT-IgM were significantly different among the four groups(P0.05),and the positive rate in the S4 groupwas significantly higher than that in the other three groups(P0.05).There were no significant differences in the positiverates of typical antiphospholipid antibodies a2GPI(IgM+IgG),aCL(IgM+IgG),a2GPI-IgM,a2GPI-IgM,aCL-IgM,aCL-IgG and atypical antiphospholipid antibodies aANXA5(IgM+IgG),aANXA5-IgM,aANXA5-IgG and the aPS/PT-IgG among the four groups(P0.05).Conclusions:There was no significant correlation between the ap2GPI,aCL,aANXA5 and thenumbers of previous spontaneous abortion.However,As an atypical antiphospholipid antibody,aPS/PTantibody has higher clinical detection value in patients with 4 miscarriages,and can be used as alaboratory auxiliary diagnostic indicator to evaluate the risk of spontaneous abortion patients.Key words:Spontaneous abortion;Antiphospholipid antibody;aCL;a2GPI;aPS/PT;aANXA5(J Reprod Med 2023,32(09):1348-1354)自然流产（spontaneous abortion，SA)是妊娠期和有一次或多次中期妊娠流产的患者，都应在怀孕前最常见的一种并发症，育龄期女性发生1次自然流进行aPLs筛查 6；但2 0 18 年低分子肝素防治自然流产的概率为10%左右。我国将妊娠不足2 8 周、胎产中国专家共识、2 0 2 0 年自然流产诊治中国专家共儿体重不足10 0 0 g的妊娠中止定义为自然流识以及2 0 2 2 年欧洲人类生殖与胚胎学学会（ESHRE)产 1-2。引起自然流产的因素复杂，主要包括自身免发布的反复自然流产（recurrent spontaneous abortion,疫、凝血功能、遗传、解剖、内分泌、感染、心理和环境RSA)诊治指南认为，患者经历2 次妊娠丢失后就可异常等。随着现代生殖免疫学的不断发展，越来越以筛查相关典型的aPLs2.8-9;另外，各指南对于非多的研究表明，抗磷脂抗体（antiphospholipid典型aPLs抗体的筛查价值和筛查时间点不明确。antibodies,aPLs)与自然流产密切相关 3-4。抗磷脂因此，开展评估典型和非典型aPLs抗体与既往流综合症（antiphosphoplipid syndrome，A PS）是一类产次数的关系，将有利于进一步明确自然流产患者系统性自身免疫性疾病，,其特征是aPLs持续阳性筛查aPLs的类型及时间点，为临床治疗策略提供合并血栓形成和/或病理妊娠 5。根据札幌标准悉可靠的实验室依据。尼修订的分类标准 6,典型aPLs包括狼疮抗凝物材料与方法（lu p u s a n t i c o a g u la n t,LA）、I g M/I g G 型抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibodies,aCL)、I g M/I g G 型抗2糖蛋白1抗体（anti-2glycoprotein I antibodies，a2GPI)是APS的实验室诊断指标。近年来的研究发现,非典型aPLs抗体 如抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物抗体（anti-phosphatidylserine and prothrombin,aPS/PT）及抗膜联蛋白A5抗体（anti-annexinA5antibodies，a A NX A 5）等可能与不明原因的自然流产存在一定的相关性门。然而，国内外指南或专家共识对于自然流产患者筛查aPLs的类型、起始时间点并没有完全统一。2 0 11年英国皇家妇产科医师协会(RCOG)认为，所有复发性早期流产的患者:1349一、研究对象选择2 0 19 年5月至2 0 2 2 年8 月初次到深圳中山泌尿外科医院生殖免疫中心接受诊疗的自然流产患者作为研究对象。所有患者详细问询既往病史、男女双方染色体、宫腔镜及内分泌检查等。纳人标准：（1)年龄2 0 45岁；（2)男女双方染色体无异常；（3)女方无生殖系统感染、解剖结构无异常；（4）男方精液常规检查正常；（5)无自身免疫疾病史及先天性血栓性疾病；（6）既往流产物绒毛染色体检测无异常。共纳人8 7 8 例患者，根据既往自然流产次数分.1350为：1次自然流产组（S1组，n=478），2 次自然流产组（S2组，n=292），3次自然流产组（S3组，n=73）以及4次自然流产组（S4组，n=35）。本研究获得本院学术与伦理学委员会批准许可，伦理批号：审批件（2 0 2 3）医伦快审第（0 10）号。所有患者均签署知情同意书。二、研究方法1抗体检测的血清收集：患者在初诊当月抽取外周血，离心、吸取血清后，置于一8 0 冰箱保存待用。2.典型aPLs水平测定：采用化学发光仪（iFlash3000)检测血清中 aCL-IgM(货号:C89018M)、a CL-Ig G（货号：C89005G）和a2GPI-IgM（货号：C89052M)、a2GPI-IgG(货号：C89006G)抗体水平，所用配套试剂均采购于深圳亚辉龙公司。阳性判断标准：aCL-IgM 10 AU/ml、a C L-I g G 6 A U/m l、a2GPI-IgM20 AU/ml、a 2GPI-IgG6 AU/ml定义为阳性。3.非典型aPLs水平测定：采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中IgM/IgG型aPS/PT与aANXA5水平。分别采用aPS/PT的IgM型、IgG型抗体检测试剂盒（Inova，美国）及aANXA5的IgM型、IgG型抗体检测试剂盒（Demeditec，德国）检测血清中对应的抗体。检测过程如下：先将血清用样本稀释液以1：10 1比例稀释，在对应检测微孔中分别加10 0 l5个不同浓度的标准品，1个阴性质控、1个阳性质控、1个空白孔、稀释后的样本，室温（2 0 2 5）孵育30 min后洗板3次；向各微孔内分别加人10 0 l酶标二抗，室温孵育30 min后洗板3次；向各微孔内加入10 0 l底物液，室温避光孵育组别例数S1 组478S2组292S3组73S4 组35组别例数S1 组478S2组292S3组73S4 组35注：资料呈正态分布，以（士s)表示。生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期30min后立即加入10 0 l终止液，在波长450 nm处读取吸光度（OD值），用回归分析曲线图分析各样品浓度值。阳性判断标准：aPS/PT-IgM30 U/mL、aPS/PT-IgG30 U/mL、a A NX A 5-Ig M 5 U/m L、aANXA5-IgG5 U/mL定义为阳性。4.生殖激素水平测定：于月经周期第2 3天采集患者外周血，利用电化学发光仪（Cobase601，Roche,瑞士)检测血清卵泡刺激素（FSH)、雌二醇(E,）、孕激素（P）、黄体生成素（LH)水平。所用配套试剂盒均购于瑞士Roche公司。三、统计学分析应用SPSS21.0统计学软件进行数据分析。采用Kolmogorov-Smirnova 检验（N50）和 Shapiro-Wilk检验（N50)检验计量资料数据分布，正态分布数据以均数士标准差(士s)表示，组间比较采用单因素方差分析；非正态分布数据以中位数（四分位间距）M（P2 5，Pr s）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验；计数资料以率/百分比（%）表示，组间比较采用检验（期望值T5,采用Fisher的精确检验）。P0.05）（表1）。表1四组患者一般资料比较（士s)，M(P2 5Pr s)年龄BMI/(kg/m)33.8(31.0,37.0)21.86(19.91,22.95)33.6(30.0,37.0)21.65(20.08，2 3.58)34.33.7421.76(19.68,23.88)34.6 4.0422.392.084E2/(pmol/L)P4/(nmol/L)143.60(113.78，19 4.3 5)1.28(0.66,2.25)154.37(115.60,211.59)1.41(0.61,1.97)138.90(123.99,179.48)1.43(0.69,1.61)167.38(116.30,238.49)1.33(0.79,1.82)结果FSH/(U/L)6.242.0646.23(5.16,7.26)6.111.6346.21(3.60,7.30)LH/(U/L)5.91(4.15,7.08)5.16(4.41,6.68)4.83(3.53,7.12)4.05(3.29,8.19)生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期二、各组患者血清中典型aPLs及其分型阳性率比较典型抗磷脂抗体 a2GPI（I g M I g G）、a CL组别例数ap2GPI(IgM+IgG)S1组478S2组292S3组73S4组35三、各组患者血清中非典型抗磷脂抗体aPS/PT、aANXA5及其分型阳性率比较将非典型抗磷脂抗体aPS/PT（I g M 十IgG）、aANXA5（I g M 十IgG）及其分型（aPS/PT-IgM、aPS/PT-IgG、a A NX A 5-I g M、a A NX A 5-I g G)在 4 组患者血清中的阳性率进行比较,结果发现aPS/PT表3四组患者血清中非典型抗磷脂抗体aPS/PT、a A NX A 5及其分型阳性率比较 n(%)组别例数aPS/PT(IgM+IgG)aPS/PT-IgMaPS/PT-IgG aANXA5(IgM+IgG)aANXA5-IgM aANXA5-IgGS1478S2292S373S435注：与其他3组比较，*P0.05）（表2）。表2 四组患者血清中典型aPLs及其分型阳性率比较 n(%)ap2GPI-IgMaCL(IgM+IgG)95(19.87)82(17.15)48(16.44)42(14.38)7(9.59)7(9.59)6(17.14)5(14.29)55(11.51)53(11.09)22(8.15)21(7.19)5(7.35)4(5.48)9(25.71)*9(25.71)*a2GPI-IgG15(3.14)6(2.05)2(2.74)1(2.86)(IgM+IgG)和aPS/PT-IgM阳性率在4组患者中具有显著性差异（P0.05)；进一步两两比较后发现,S4组患者血清中的aPS/PT（I g M 十IgG）和aPS/PT-IgM阳性率显著高于其他3组（P0.05)（表3）。2(0.42)59(12.34)1(0.34)39(13.36)1(1.37)6(8.22)0(0.00)2(5.71)IgG型为主。报道显示，约2 6.4%的自然流产患者与aPLs 阳性有关 10 1。目前关于aPLs导致的流产原因尚未完全明确，可能的机制是：aPLs干扰滋养层细胞的融合、侵袭和增殖，直接损伤胎盘，影响子宫内膜螺旋动脉的重塑，导致胎盘功能障碍，血流减少或中断,胎儿的血氧与营养物质供应减少，从而引起流产和胎儿生长受限等不良妊娠 11-12 。目前纳人APS实验室诊断标准的典型aPLs主要有：LA、aCL和a2GPI。随着研究的进展，越来越多非典型aPLs，如aPS/PT及aANXA5，受到生殖免疫基础和临床研究学者的关注，但不同类型aPLs与既往自然流产次数间的关系研究并不多，而且国内外指南或专家共识对于流产患者筛查aPLs的类型及起始时间并没有完全统一，特别对于非典型aPLs是否进行筛查更没有达成共识 13。因此，本研究检测aCL-IgM56(11.72)42(8.79)27(9.25)24(8.22)5(6.85)4(5.48)3(8.57)2(5.71)29(6.07)16(5.48)3(4.11)1(2.86)aCL-IgG15(3.14)4(1.37)2(2.74)1(2.86)34(7.11)26(8.90)3(4.11)1(2.86)1352和分析了既往不同自然流产次数的患者血清中IgM/IgG 型 aCL、a 2GPI、a PS/PT 和 aANXA5 阳性率，以及与自然流产次数之间的相关关系，探讨不同类型aPLs在自然流产患者的筛查价值及时间。a2GPI和aCL作为典型aPLs，被国内外指南或专家共识中推荐用于筛查不明原因流产患者的重要指标 14，与复发性流产具有很强的相关关系，OR(95%CI)值分别为2.12（0.6 9,6.53)和5.6 1（1.2 6，25.03)15。a 2GPI抗体被认为是自然流产和血栓症特异的标志物 16-17 。a2GPI抗体通过结合滋养层细胞表达的2GPI,减少人绒毛膜促性腺激素分泌和滋养层细胞侵袭，导致滋养层细胞侵袭功能受损，引发妊娠并发症 18 。而aCL作为抗磷脂抗体的标志性抗体，同样参与了妊娠并发症，因此可导致蜕膜血管病变、子宫胎盘功能不全、胎盘血栓和梗死 19。既往研究表明，a2GPI抗体和aCL抗体在反复自然流产组阳性率及抗体滴度均显著高于正常对照组 2 0-2 1)。本研究分析a2GPIIgM+IgG）和aCL(IgM+IgG)及其分型 a2GPI-IgM、a 2GPI-IgG、aCL-IgM、a C L-I g G 抗体水平与自然流产患者既往流产次数之间的关系，发现并无明显相关性，与中心前期研究的结果相似 2 2 。另外，Gonen等 2 3 的研究显示，aCL与复发性流产的次数无关，说明aCL和a2GPI及其分型抗体阳性率可能并不与自然流产次数直接相关。但马开慧和罗兆芹等 2 4-2 5 的研究发现，aCL阳性率随着自然流产次数的增加而增加。这种不同研究结论的差异可能由检测试剂与方法学间的差异所致。辅助生殖临床诊疗过程中常发现大量具有APS临床表现、但血清学阴性的APS患者，呕需寻找和开发一些新的、具有临床意义的非典型aPLs抗体，包括aPS/PT抗体和aANXA5抗体。aPS/PT抗体是以磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS）和凝血酶原（Prothrombin，PT)复合物为靶点的抗体。研究显示，aPS/PT抗体与动静脉血栓和产科并发症具有高度相关性，IgG和IgM型aPS/PT抗体在血栓形成组（静脉和/或动脉血栓形成)患者中比无血栓形成组的患者中更常见 2 6-2 7 。两项回顾性研究发现，在血清学阴性的 APS患者中,aPS/PT抗体阳性检出率高达50%2 8 2 0 。Zigon等 30 1研究证实，aPS/PT抗体与复发性早期自然流产、晚期流产、先兆子痫、胎盘功能不全早产等生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期妊娠并发症具有相关性。Pleguezuelo等 31 报道，aPS/PT抗体在流产2 次组患者中阳性检出率为16.6%，在流产3次组患者中检出率为15.4%，均显著高于正常对照组2.9%，提示aPS/PT抗体在流产患者的诊断中可能具有重要的参考意义。本研究分析了自然流产患者既往不同流产次数间aPS/PT(IgM+IgG)及其分型 aPS/PT-IgM、a PS/PT-I g G抗体的阳性检出率。结果显示，自然流产次数 3时，各组间的阳性检出率并无统计学差异；但当自然流产次数4时,aPS/PT(IgM+IgG)和 aPS/PT-IgM抗体阳性率显著高于前3组患者，提示aPS/PT抗体在反复性自然流产（次数4)患者的诊断中具有潜在参考意义。临床上可尝试检测aPS/PT抗体，并采取相应的干预措施，改善多次自然流产患者的临床妊娠结局。膜联蛋白 A5（A n n e x in V）是一种钙依赖的磷脂结合蛋白，由血小板和胎盘滋养层细胞合成，广泛存在于胎盘绒毛表面的顶端，具有很强的抗凝血特性,在母胎血液循环中起重要作用。Annexin V的血栓调节作用来自于它能够在磷脂双层膜上形成一个二维晶体抗血栓屏障，从而阻止凝血因子与磷脂表面结合 32 。aANXA5抗体首次在系统性红斑狼疮患者中检测到，被认为是aPLs抗体的一个亚群 33。研究显示，aANXA5抗体与早期妊娠丢失、子痫前期等妊娠并发症的发生有关341。aANXA5抗体与AnnexinV竞争磷脂结合，导致抗血栓屏障层的缺失，从而加速血小板促凝活性，引发血栓和妊娠丢失 3-36 。Wang等 37 通过在妊娠的BALB/c小鼠体内输注aANXA5抗体，可明显观察到该小鼠胎盘血栓形成和组织坏死，提示aANXA5抗体可能会导致胎盘AnnexinV丢失，使母胎组织血栓形成，影响血液营养交换功能，进而导致妊娠丢失的原因。Sater等 38 研究发现，在复发性流产患者中，aANXA5抗体明显高于多胎妊娠史的妇女，提示aANXA5抗体为复发性流产的独立危险因素。Zhang等 39 在研究aANXA5抗体与APS临床相关性的评价中发现，与健康人群相比，APS患者中的aANXA5抗体水平显著升高，与动静脉血栓事件显著相关，但在有妊娠并发症的患者和没有妊娠并发症的患者之间，aANXA5抗体水平无显著差异。然而，本研究发现，aANXA5及其分型抗体阳性率与自然流产次数无相关性，其与不良妊娠结局的相关生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期性有待进一步讨论和分析。由于本研究中所纳入的受试者均为自然流产患者，缺乏健康对照组，加上自然流产4次的样本量相对较少，后续仍需要加大样本量来进一步阐明各种aPLs抗体，特别是非典型aPS/PT抗体与自然流产患者既往流产次数的相关关系和机制。综上所述，总a2GPI、a C L、a A NX A 5及其分型抗体阳性检出率并不随自然流产次数的增加而发生显著变化，但aPS/PT及其分型aPS/PT-IgM抗体在自然流产次数4的患者中，阳性检出率显著升高，提示总aPS/PT或aPS/PT-IgM抗体在反复自然流产患者中具有潜在的风险提示作用，未来可作为评估自然流产风险的实验室诊断补充指标。【参考文献】1Rai R,Regan L.Recurrent miscarriageJ.Lancet,2006,368:601-611.2自然流产诊治中国专家共识编写组.自然流产诊治中国专家共识（2 0 2 0 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