植物生理学实验.doc

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本科学生综合性实验报告
光合色素的提取、理化性质
分离、吸收光谱及含量的测定
学号： 134120171 姓名： 王晓莲
学院： 生命科学学院 专业、班级 13生物科学C班
实验课程名称： 植物生理学实验
教师及职称： 李忠光
开课学期： 2015 至 2016 学年 下 学期
填报时间： 2016 年 4 月 2 日
云南师范大学教务处编印
实验序号
实验二
实验名称
光合色素的提取、理化性质分离、吸收光谱及含量的测定
实验时间
2016.3.15-29
实验室
睿智三428
1．实验目的
（1）掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。
（2）掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。
（3）掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法

2． 实验原理
Ⅰ光合色素的提取与理化性质
光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。
Ⅱ 光合色素的分离与吸收光谱
光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。
Ⅲ 光合色素含量的测定
混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各组分含量。Lambert定律：A = k L；Beer定律A = k C。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程
Ca = 12.7 A663 – 2.69 A645；
Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663
Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A645
A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1
A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2
由于K是一个常数，而A可以通过分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式。
k——比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1g/L(0.1%)，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为比吸收系数。故其单位为：
ε——摩尔吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1mol/L，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为摩尔吸收系数。故其单位为：

3． 实验设备及材料
（1） 材料
新鲜植物叶片、丙酮、碳酸钙、石英砂、20%KOH甲醇溶液、苯、
自来水、50%醋酸、醋酸铜、启动剂、80%丙酮
（2） 实验设备
试管、滤纸、研钵、玻璃棒、锥形瓶、剪刀、移液管、洗耳球、烧杯、
漏斗、离心机、便携式叶绿素测定仪、分光光度计、天平、离心管、
滴管

4．实验步骤
Ⅰ光合色素的提取与理化性质
（1）光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。
（2）观察荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。
（3）光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min后观察颜色变化。
（4）皂化反应：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入20%KOH甲醇溶液1ml，摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。
（5）取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。
II 光合色素的分离与吸收光谱
（1） 光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/3片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。
（2） 光合色素分离：剪取适当长度和宽度的滤纸条→ 用上行纸层析法分离色素→ 启动剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1
（3） 吸收光谱的测定
光合色素的吸收光谱：取色素溶液1 mL，加入丙酮3 mL，摇匀后在分光光度计上400到700 nm处每隔10 nm进行扫描。
各色素的吸收光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法扫描。
III 光合色素含量的测定
方法一：快速测定法
由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm2
方法二: 分光光度计法
色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知Φ的叶圆片0.05g左右，加入少许CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，转入离心管中（离心机使用），再用5ml 80%丙酮洗研钵，转入离心管中，平衡，5000rpm离心10min, 记录上清液体积，取1ml稀释到4ml。
测定：以1cm比色皿分别测定A663、A645。使A控制在0.1 ~ 0.8之间。

5． 实验结果及分析
Ⅰ光合色素的提取与理化性质
一层：浅黄绿色
(1)皂化反应：溶液分为三层 二层：浅绿色
三层：深绿色
轻轻摇晃过程中：第一层由浅绿色逐渐变为黄绿色
第二三层逐渐变为一层，深绿色
在第一层下面出现一层油滴层
原因:叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开
(2) 荧光现象的观察

用肉眼可以观察到叶绿素提取液在直射光照射下，反射光为蓝绿色，透射光为深红色
原因：叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光；反射光呈蓝绿色是因为叶绿素对蓝绿色光的吸收很少，而对于其他颜色光的吸收很多，所以会呈现出蓝绿色的反射光
II 光合色素的分离与吸收光谱
光合色素的分离如图所示

将涂有叶绿体色素的滤纸放入层析液后，叶绿体色素随层析液沿滤纸向上推进，在滤纸上分为四个条带，其颜色由下至上分别为黄绿色、蓝绿色、黄色、橙黄色，由资料可知由下至上依次为叶绿素b、叶绿素a、叶黄素、胡萝卜素；其中蓝绿色条带最宽，黄绿色条带次之，黄色、橙黄色条带较细，说明叶绿体中含量较多的是叶绿素a和叶绿素b。 
吸收光谱（附图）
III 光合色素含量的测定
方法一：快速测定法
序号
1
2
3
4
平均值
含量（mg/dm2）
31.6
30.5
31.6
27.6
30.3
方法二: 分光光度计法
波长(nm)
663
645
含量（A）
0.207
0.077
Ca = 12.7 A663 – 2.69 A645 Ca=2.42mg/L
Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663 Cb=0.79mg/L
Ca+b=8.02A663+20.20A645 Ca+b=3.12mg/L
各叶绿素含量： V=10ml W=0.05g 
由公式：Chl content=(mg.g-1FW)
Chla=484mg.g-1FW
Chlb=158mg.g-1FW

6、 思考题
1、 为什么在皂化反应中只能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液？
因为色素不能溶于水，甲醇其实在这里只是当做溶剂使用，化学中有“相似相容”，色素是有机物所以只能溶于有机溶剂 
2、 光合色素的吸收光谱对我们理解光合作用有何意义？
叶绿体色素的吸收光谱的来年改革峰值分别在430nm左右和660nm左右。基本不吸收绿光，因而绿光被反射而是叶子（大部分）显绿色。也就是说主要吸收这些波长的光的能量在叶绿体内合成植物所需要的物质。
3、试论述高等植物光合色素的种类和生理功能
植物含有几种类型的叶绿素，它们之间的差别在于烃侧链的不同。大多数能进行光合作用的细胞还有第二种类型的叶绿素，即叶绿素b 或叶绿素c。在高等植物的细胞中含有叶绿素b,而在其它一些类型的细胞中含有叶绿素c。不同类型的叶绿素对光的吸收也是不同的，如叶绿素a最大的吸收光的波长在420～663nm,叶绿素b 的最大吸收波长范围在460～645nm。当叶绿素分子位于叶绿体膜上时，由于叶绿素与膜蛋白的相互作用，会使光吸收的特性稍有改变。
4、 一般正常的植物叶片，Chla / Chlb = 3 / 1，你所测定的结果符合此比例吗？
Chla=484mg.g-1FW Chlb=158mg.g-1FW
符合
5、两种测定方法含量有何不同？为什么？
快速测定法用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，局部含量测定。比较准确，但不便于整体测定，取样多次平均值也不能代表整体叶绿素含量；分光光度计法采用低杂散光,高分辨率的单光束单色器,保证了波长准确度.波长重复性和更高的分辨率 ,自动调0%T和100%T,自动调波长用多种方法的数据处理功能 ,高分辨,宽大的样品糟,可容纳100mm,光径吸收池和相应的反射附件 ,仪器配有标准的RS-232双向通讯接口,可外接打印机,打印相应的实验数据. 个性代的外形设计,轻触式按键使操作更为方便. 可见分光光度计广泛应用于医药,卫生,化工,学校,生物化学,石油化工,质量控制,环境保护及科研实验室等化学分析.
6、怎样把方法一中的叶绿素含量mg/dm2转换为方法二中的mg / g FW ？怎样测定不同形态的植物叶片的叶面积？
叶面积的计算
选取单位面积重量是一个常数的打印纸如A4或16K。一般A4打印纸为70~105GSM（g/m2）。
用铅笔轻轻地沿着叶缘在A4纸上划线。
用剪刀沿着叶缘剪下A4纸。
称所剪下的A4纸的重量W (g)。
计算：叶面积=

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