抗体偶联药物及其质量控制与表征.pdf

18 中国医药生物技术 2023 年 9 月第 18 卷增刊 Chin Med Biotechnol,September 2023,Vol.18,suppl DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2023.suppl.004 质量控制 抗体偶联药物及其质量控制与表征 赵丹华，曹守春 抗体偶联药物（antibody-drug conjugates，ADC）是一类由单克隆抗体、细胞毒性药物与连接子组成的具有靶向性的免疫偶联物，用于肿瘤的靶向治疗。该治疗手段因为单克隆抗体提供的靶向性，能精确递送 ADC 药物，从而提高化疗的疗效并减少药物对正常细胞的毒性1，已逐渐在肿瘤治疗上发挥重要作用。目前，全球上市的 ADC 药物包括恩美曲妥珠单抗、维迪西妥单抗、戈沙妥珠单抗等 10 余种。同时，数百种 ADC 药物正处在临床研究阶段。然而，由于 ADC 药物相对于单独的单克隆抗体具有复杂性，因此对 ADC 药物进行质量控制和表征的检验显得尤为重要。1 ADC 药物的结构特征与作用机制 1.1 ADC 药物的结构特征 ADC 药物包括 3 种主要的成分：靶向特异性抗原的单克隆抗体；高效的细胞毒性药物；用于偶联抗体及细胞毒性药物的连接子2。1.1.1 单克隆抗体 单克隆抗体是由 2 条重链和 2 条轻链通过二硫键连接形成的对称结构，它包括 2 个抗原结合片段（fragment antigen binding，Fab）和 1 个可结晶片段（fragment crystallizable，Fc）（图 1），分别用于介导抗原抗体的识别和介导抗体与细胞表面 Fc 受体的相互作用3。单独的单克隆抗体在实体瘤的治疗过程中存在分布不均匀的现象4，因此，单独使用单克隆抗体进行实体瘤的治疗面临疗效有限的障碍。虽然可以通过高剂量的给药来弥补疗效低的问题，但是安全性及耐受性的矛盾又更为严峻。因此，目前广泛的治疗手段是将单克隆抗体与细胞毒性药物形成 ADC 药物，用于联合治疗。用于 ADC 药物构建的单克隆抗体需要具备的特征：特异性识别在靶细胞上高表达的抗原并与之结合；低 免疫原性，减少在人体内产生的免疫应答；在血液中的 稳定性和低交叉反应性，避免抗原抗体的低特异性识别导 致 ADC 药物的脱靶，从而增加全身毒性，降低治疗效果；与细胞毒性药物的偶联不影响单克隆抗体自身的稳定性和整体的药代动力学特征；较长半衰期，促进其在靶细胞中的积累5-7。1.1.2 细胞毒性药物 细胞毒性药物是 ADC 药物中重要的、高效的效应成分，在皮摩尔范围内即可发挥细胞杀伤作用8。目前，临床上开发的 ADC 药物中，细胞毒性药物主要是通过 2 种机制来抑制肿瘤细胞的生长，一种是靶向 DNA，导致双链 DNA 的断裂，从而导致细胞凋亡，该类药物主要包括多卡霉素、卡利奇霉素等；另一种是靶向微管蛋白，破坏微管蛋白的组装来抑制细胞的有丝分裂，该类药 图 1 单克隆抗体结构 物主要包括美坦素、奥瑞他汀类衍生物等8。部分细胞毒性药物如美坦素等对健康细胞仍然具有较大的细胞毒性，当单独使用时，不同的剂量会造成不同程度的神经病变、疲劳或腹泻等副作用，无法作为单一疗法用于肿瘤的治疗9。因此需要与具有靶向性的单克隆抗体联合治疗。用于 ADC 药物制备的细胞毒性药物需要具备的特征：易偶联性，能与连接子顺利结合；合适的溶解度和长期的稳定性，利于在水溶液中制备并静脉给药；更大的 IC50，因为细胞毒性药物经静脉给药后，仅 1%2%的药物能到达肿瘤8,10。1.1.3 连接子 连接子在 ADC 药物中被用于偶联单克隆抗体和细胞毒性药物。目前在 ADC 药物的开发过程中，连接子通常可以分为可切割类型和不可切割类型，可切割连接子是当 ADC 药物进入细胞后，对单克隆抗体和细胞毒性药物之间的预定的切割位点进行切割；而不可切割连接子是当 ADC 药物进入靶细胞并被溶酶体内化后通过蛋白水解从而释放细胞毒性药物11。连接子在 ADC 药物的药代动力学、治疗效果等方面起着重要的作用，因此，用于 ADC 药物中的连接子需要具备的特征：稳定性，有利于 ADC 分子在经过血液循环中维持稳定的状态，避免过早被切割，造成非特异性毒性；在 ADC 分子被靶细胞内化后能快速切割，释放细胞毒性药物以发挥作用8。1.2 ADC 药物的作用机制 ADC 药物在静脉注射后，需要通过血液循环与靶细胞识别并结合，随后进入靶细胞内释放细胞毒性药物来发挥作用。ADC 药物的主要作用机制包括：ADC 药物中的单克隆抗体通过与仅存在于肿瘤细胞上的抗原特异性识别形成抗原-ADC 复合物；抗原-ADC 复合物通过受体介导的内吞作用被肿瘤细胞摄取形成早期内体；早期内体在细胞内发展为晚期内体，并逐渐释放由可切割类型的连接子偶联 作者单位：102629 北京，中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室 通信作者：曹守春，Email： 收稿日期：2023-08-16 中国医药生物技术 2023 年 9 月第 18 卷增刊 Chin Med Biotechnol,September 2023,Vol.18,suppl 19 图 2 抗体偶联药物结构及作用机制 的细胞毒性药物；晚期内体与溶酶体融合，由可切割类型或不可切割类型的连接子偶联的细胞毒性药物均能通过 ADC 的降解从 ADC 中释放，从而引起肿瘤细胞的死亡12（图 2）。2 ADC 药物的质量控制与表征 与未偶联的单克隆抗体及细胞毒性药物相比，ADC 药物在结构组成、生物学活性和质量控制等方面具有复杂 性，在 ADC 药物的研发与生产过程中，对 ADC 药物的生产原料的质量控制是基本的要求。同时，药物-抗体比（drug-to-antibody ratio，DAR）、药物荷载分布、未偶联的裸抗、电荷变异体及杂质也影响着 ADC 药物的质量。2.1 DAR DAR 是指在单个单克隆抗体上负载的有效的细胞毒性药物的平均数量，是 ADC 药物中重要的质量属性，在影响药物的稳定性、细胞毒性等方面发挥着重要作用。较低的 DAR 会减弱 ADC 药物的疗效，但是过高的 DAR 虽然能在一定程度上增加 ADC 药物的疗效，但同时也会影响 ADC 药物的细胞毒性和药代动力学特征。DAR 的准确测定有利于更高疗效的 ADC 药物的研究和开发，因此，对 DAR 进行表征的方法值得探讨。2.1.1 疏水相互作用色谱 利用链间半胱氨酸进行单克隆抗体和细胞毒性药物之间的连接可以让 ADC 药物具有可控制的 DAR，目前正在开发的 ADC 药物中，约三分之二是通过链间半胱氨酸进行连接的13-14。链间半胱氨酸连接的 ADC 药物是通过部分还原不影响结构稳定性的四对链间二硫键，并维持了 12 个链内二硫键的完整性来实现的。通过还原反应生成了 0.4 对游离的巯基，可用于与细胞毒性药物通过马来酰亚胺反应形成共价键用于实现连接子与细胞毒性药物的连接15。疏 水 相 互 作 用 色 谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）是一种以疏水性的填料为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，通过溶质与固定相之间的疏水相互作用实现各个组分分离的色谱方法。HIC 能提供 ADC 药物分布的整体视图，被认为是分析链间半胱氨酸连接的 ADC 药物的 DAR 的金标准16。2.1.2 反相高效液相色谱 反相高效液相色谱（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）是利用物质的疏水性差异从而对各组分进行分离的一种色谱方法，溶质将按照分子疏水性递增的顺序洗脱。经过还原预处理裂解 ADC 药物之间的 4 个链间二硫键，将产生来自抗体中轻链和重链的抗体片段，通常，这些片段之间的疏水性差异较大，从而可以利用 RP-HPLC 方法进行分离与 DAR 的计算17。20 中国医药生物技术 2023 年 9 月第 18 卷增刊 Chin Med Biotechnol,September 2023,Vol.18,suppl 2.1.3 液质联用 质谱技术具有高度选择性和特异性，通常与色谱技术联合形成一种更精准的分析技术，液质联用技术可以为推断 ADC 药物中的 DAR 值提供更准确的判断。目前用于 DAR 分析的质谱技术主要根据样品的分辨性能和蛋白质折叠程度来决定。其中，原生质谱分析方法在与变性条件下进行的其他类型的分析相比，在检测依靠共价键及非共价键结合的 ADC 药物的 DAR 值时具备一定的优势18-21。傅里叶变化质谱、飞行时间质谱、三重四极杆质谱技术有助于高效分析从低等复杂程度到中等复杂程度的 ADC 药物中的 DAR 值22-24。2.1.4 紫 外可 见 吸 收 光 谱 紫 外 可 见 吸 收 光 谱法（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）对 ADC 药物中的 DAR 值进行定量检测是一种操作最简单的方法，能提供准确的 DAR 值。运用该方法对 ADC 药物进行 DAR 检测需要细胞毒性药物和单克隆抗体在 UV-Vis 中具有不同的最大吸收波长，根据各自的消光系数和最大吸收波长可以计算出 ADC 药物的平均 DAR17。UV-Vis 对 DAR 进行计算是一种简单的，不需要基于高效液相或质谱仪等复杂仪器的方法，当不需要知道 DAR 的分布或每个 DAR 物种的分子量时，UV-Vis 是值得考虑的简便方法。2.2 药物荷载分布 整体的药物荷载分布可以通过完整的质量分析来进行表征。为了确定每个偶联位点的药物荷载分布情况，需要根据不同的药物类型进行特定的分析。针对通过特异性位点进行偶联的 ADC 药物，可以利用质谱检测得到的多肽图谱进行结合位点的确定。针对能实现良好的色谱分离的 ADC 药物，可以通过液相色谱方法获得共轭位点的准确信息。若 ADC 药物无法实现良好的色谱分离，质谱分析可以用来对共轭肽及非共轭肽进行相对定量分析，这种方法的准确性很大程度上依赖每一种特定情况。针对随机偶联的 ADC 药物，若成功偶联的药物出现未偶联的抗体没有的吸收峰，则可以通过 LC-MS 方法分析 ADC 药物与非偶联的抗体在该特定波长下的肽谱图来定位与药物偶联的多肽25。2.3 未偶联的裸抗 未偶联的裸抗将与 ADC 药物共同竞争靶细胞上的抗原，从而减少成功递送至靶细胞的 ADC 药物的量，直接影响 ADC 药物的疗效。因此，ADC 药物中未偶联抗体的含量控制是 ADC 药物生产过程中的一个关键因素。质谱技术作为一种多功能的工具，已经成功地用于定量未偶联的裸抗，液质联用方法是对 ADC 药物进行完整表征的最佳方法。当细胞毒性药物与抗体成功偶联后，能极大程度上改变 ADC 药物表面及整体的静电分布情况，因此，基于电荷的分离技术可以用来检测未偶联抗体。成像毛细管等电聚焦（imaged capillary isoelectric focusing，iCIEF）是一种基于蛋白质等电点（isoelectric point，PI）将其分离的技术。若抗体和 ADC 药物具有不同的 PI 值则可以通过 iCIEF 方法将抗体与 ADC 药物分离，并进行定量26。当细胞毒性药物与抗体结合后会影响 ADC 药物的疏水性，这种表面疏水性的变化可以通过基于物质的疏水性进行分离的色谱技术如疏水色谱技术对 ADC 药物中未偶联抗体进行分析。在整个过程中，疏水性最弱的未偶联抗体将首先被洗脱，其次按照表面疏水性增加的顺序进行洗脱，从而对 ADC 药物中未偶联抗体进行定量分析26。2.4 电荷变异体 单克隆抗体通常会因为天冬氨酸残基的脱酰胺作用或重链中 C 端赖氨酸残基的未加工而发生电荷变异，同时，蛋白质表达、药物偶联及药物纯化等过程也能引起电荷的 变异，而电荷变异将影响药物的稳定性及活性，因此，对 电荷变异体的检测及评估是需要的。通常，电荷变异体 中细微的电荷差异可以通过离子交换层析（ion exchange chromatography，IEX）或 iCIEF 方法来检测，但各种方法的使用需要根据 ADC 各组分之间的性质进行综合评估。2.5 杂质控制 ADC 药物在结构组成上具有复杂性，在生产过程中会产生一定的杂质，影响药物的疗效。杂质主要分为产品相关杂质和工艺相关杂质。产品相关杂质主要来源于未结合上的细胞毒性药物、单独的单克隆抗体及其降解产物、连接子及其衍生物等。未结合的细胞毒性药物可以通过纯化的方法去除。单独的单克隆抗体可以通过离子交换层析等方法，根据 ADC 药物和单独的单克隆抗体之间的表面电荷分布的差异进行去除。针对其他的产品相关杂质，在制订合适的 DAR 值，遵循工艺合理性、ADC 药物稳定性的前提下，加强生产工艺中的纯化和超滤的程序，有助于产品相关杂质的控制。工艺相关杂质主要来源于在单克隆抗体和细胞毒性药物偶联过程中残留的有机溶剂。因此，用于偶联的连接子需要具备一定的亲水性，减少有机试剂的使用，减少蛋白的聚集，提高 ADC 药物的疗效27。在生产过程中，药物接触的设备和材料需要具备有机溶剂耐受性，避免多余的反应物的生成。同时，在包括投料比例、反应体积、温度及时间等重要工艺参数的控制需保持一致，以确保产品相关杂质和工艺相关杂质处在可控区间内。3 总结与展望 ADC 药物因为其结构的复杂性使之生产工艺也具有复杂性。ADC 药物的生产需要对包括生产原料、DAR 值、未偶联的裸抗、药物荷载比、电荷变异体、杂质等多方面进行质量控制。对 ADC 药物的生产原料，即单克隆抗体、细胞毒性药物和连接子的质量控制需要严格按照各种制剂的质量标准进行。DAR 值是 ADC 药物中非常关键的质量属性，它对 ADC 药物的安全性、稳定性和有效性有着重要作用，对 DAR 值的质量控制可以通过疏水相互作用色谱、反相高效液相色谱、液质联用、紫外可见吸收光谱等方法进行表征。药物的荷载分布、未偶联的裸抗、电荷变异体 中国医药生物技术 2023 年 9 月第 18 卷增刊 Chin Med Biotechnol,September 2023,Vol.18,suppl 21 等因素也在一定程度上对 ADC 药物的有效性产生影响，对其的质量控制可以通过质谱、色谱、成像毛细管等电聚焦等方法进行综合表征。ADC 药物除了单独进行给药，也可以与多种治疗手段包括新型免疫疗法等方法结合，进行联合治疗，以最大限度提高治疗效果，减轻患者痛苦。高度特异性的单克隆抗体、稳定创新的连接子与更强细胞毒性药物的优化将使更安全、更高效、更稳定的 ADC 药物的出现成为可能。目前，ADC 药物大多在肿瘤治疗中运用，主要依靠单克隆抗体与肿瘤细胞表面特异性的抗原识别而实现 ADC 药物的精准递送。随着 ADC 技术的发展与相关质量控制手段的进步，拓展 ADC 药物的治疗范围，将其用于自身免疫疾病等疾病的治疗具有研究前景，同时免疫调节型 ADC 药物的研发在未来也面临更大的挑战。参考文献 1 Chau CH,Steeg PS,Figg WD.Antibody-drug conjugates for cancer.Lancet,2019,394(10200):793-804.2 Huang RY,Chen G.Characterization of antibody-drug conjugates by mass spectrometry:advances and future trends.Drug Discov Today,2016,21(5):850-855.3 Hoffmann RM,Coumbe BGT,Josephs DH,et al.Antibody structure and engineering considerations for the design and function of antibody drug conjugates(ADCs).Oncoimmunology,2018,7(3):e1395127.4 Juweid M,Neumann R,Paik C,et al.Micropharmacology of monoclonal antibodies in solid tumors:direct experimental evidence for a binding site barrier.Cancer Res,1992,52(19):5144-5153.5 Hughes B.Antibody-drug conjugates for cancer:poised to 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