巨噬细胞参与非酒精性脂肪性肝病的研究进展.pdf
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1、从胚胎到成年,巨噬细胞存在于身体的各个器官1。巨噬细胞是高度可塑性的细胞,通过改变其形态和功能来感知周围或全身环境,进而发生应答2。巨噬细胞属于免疫细胞,具有较强的吞噬能力。在免疫系统激活过程中,巨噬细胞参与了快速、非特异性的防御反应和长期、特异性的适应性反应(包括招募其他免疫细胞)2。巨噬细胞还能产生大量的细胞因子、趋化因子和生长因子等,这些因子参与了感染反应和组织修复。此外,除了在组织稳态和防御病原体中发挥免疫调节作用外,巨噬细胞还限制了一些疾病的发展,包括败血症、慢性炎症性疾病、神经退行性疾病和癌症3-6。在代谢性疾病(包括非酒精性脂肪性肝病)中,巨噬细胞也发挥着至关重要的作用。肝脏是一
2、个重要的代谢器官,而肝脏中的巨噬细胞作为防御胃肠道有害物质通过门静脉循环进入肝脏的第一道防线,其存在维持着肝脏的稳态7。在非酒精性脂肪性肝病中,肝脏中存在不同的巨噬细胞以及动态的演变和功能的变化8-9。本文将从肝脏巨噬细胞的分类、异质性以及在非酒精基金项目国家自然科学基金国际合作与交流项目(82120108012);国家自然科学基金重点项目(81930086)通信作者(Corresponding author),Email:巨噬细胞参与非酒精性脂肪性肝病的研究进展夏安亮,孙倍成*南京大学医学院附属鼓楼医院普外科,江苏南京210008摘要 肝脏是人体的重要器官,负责许多关键的生理过程,包括代谢、
3、解毒和免疫。正常情况下,肝脏中巨噬细胞的稳态维持着肝脏的功能。而巨噬细胞稳态的破坏、不同细胞亚群之间的演变以及功能改变,促进非酒精性脂肪性肝病的进展。单细胞测序技术可在治疗非酒精性脂肪性肝病的过程中用于识别特定的巨噬细胞亚群。本文从肝脏巨噬细胞的分类、异质性以及在非酒精性脂肪性肝病中的作用等方面进行了综述。关键词 巨噬细胞;异质性;单细胞测序;非酒精性脂肪性肝病中图分类号 R575.5文献标志码 A文章编号 10074368(2023)10145608doi:10.7655/NYDXBNS20231020Research progress of macrophages in nonalcoho
4、lic fatty liver diseasesXIA Anliang,SUN Beicheng*Department of General Surgery,Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School,Nanjing210008,ChinaAbstractThe liver is an important organ in the human body which is in charge of many key physiological processes,includingmetabolism,d
5、etoxification,and immunity.Normally,homeostasis of macrophages in the liver maintains liver function.Disruption ofmacrophage homeostasis,evolution among different cell subsets,and altered function contribute to the progression of nonalcoholicfatty liver diseases(NAFLD).Single cell RNAseq technology
6、is used to identify specific macrophage subsets for the treatment of nonalcoholic fatty liver diseases.This article will review the classification,heterogeneity,and role of hepatic macrophages in nonalcoholicfatty liver diseases.Key words macrophages;heterogeneity;single cell RNAseq;nonalcoholic fat
7、ty liver diseasesJ Nanjing Med Univ,2023,43(10):14561463综述南京医科大学学报(自然科学版)Journal of Nanjing Medical University(Natural Sciences)第43卷第10期2023年10月1456性脂肪性肝病中的作用等方面进行综述。1肝脏巨噬细胞的分类1.1枯否细胞枯否细胞于1876年由Wilhem von Kupffer首次描述,20年后Tadeusz Browicz将枯否细胞鉴定为巨噬细胞10-11。巨噬细胞均表达通用的标志物,包括CD64、F4/80和MerTK。近年来,对小鼠枯否细胞的区
8、分有了长足进展。CLEC4F被确定为小鼠枯否细胞的特异性标志物,因而可以建立 Clec4fDtr 和Clec4fcre小鼠模型,以分别特异性地去除或靶向枯否细胞12-15。虽然CLEC4F是一种有用的枯否细胞标志物,但是它也有其局限性。首先,它在枯否细胞中表达相对较晚,因此很难识别正在发展成枯否细胞的那些早期和中间态细胞13-14,16-17。对于正常肝脏来说,枯否细胞主要来源于胚胎,并在整个生命过程中自我维持、自我更新,因而CLEC4F的较晚表达无关紧要18-19。但是,对于疾病状态下的肝脏(如非酒精性脂肪性肝病)来说,驻留巨噬细胞会逐渐减少或者丢失。其中一个重要的发现是胚胎来源的枯否细胞自
9、我维持、自我更新能力受损,进而发生死亡,被单核细胞衍生的枯否细胞所替代17,20-22。单核细胞衍生的枯否细胞可能需要近1周的时间才表达CLEC4F,然后才能将它们与其他肝脏巨噬细胞区分开来。其次,尽管CLEC4F在许多物种中保守,但在人类中并没有保守性23,这导致真正的人类枯否细胞无法被识别。近年来,单细胞RNA测序技术的出现,便于人们解析正常肝脏的细胞图谱,揭示人类枯否细胞的真实身份。然而,每项研究所得出的关于人类枯否细胞身份的结论不尽相同。尽管如此,利用单细胞RNA测序技术(基于RNA水平)比较人和小鼠基因表达图谱,发现了枯否细胞较为特异的一些标志物,包括 CD5L、VSIG4、CD16
10、3、FOLR2、MARCO 和SLC40A1,可用于在7个不同物种的肝脏中识别单一均质的枯否细胞群23。此外,通过流式细胞术(基于蛋白水平)也能识别不同物种中的枯否细胞,包括VSIG4、CD163和FOLR2。另外,小鼠肝脏枯否细胞表面的其他受体包括CLEC2和CD206也可进一步区分不同来源的肝脏巨噬细胞。CLEC2(由Clec1b编码)是枯否细胞非常早期的标志物,并在其整个寿命期间均保持表达17,21。因此,这是一个非常有用的标志物,能够区分单核细胞衍生的枯否细胞。在小鼠中,单核细胞衍生的枯否细胞主要限于疾病状态的肝脏,然而在正常人体肝脏中,已有研究通过单细胞测序鉴定了此类细胞的存在。潜在
11、原因可能是人类暴露于病原体、高脂饮食、酒精和其他毒素等,导致单核细胞衍生的枯否细胞的招募23。然而,这些细胞是否是严格意义上的单核细胞衍生的枯否细胞仍需进一步探究。此外,基于CD206和ESAM 的表达,枯否细胞可以分为两个亚群,即CD206-ESAM-KC1 和 CD206+ESAM+KC224-25,其中CD206-ESAM-KC1是主要的枯否细胞亚群。转录组分析表明所有特异性表达于KC2的基因也都被肝窦内皮细胞表达,提示这些细胞可能是双重细胞或者消化产物23,26。因此,通过整合枯否细胞特异的表面标志物(包括 CD5L、VSIG4、CD163、FOLR2、MARCO、SLC40A1、CL
12、EC2和CLEC4F),进而区分枯否细胞和其他巨噬细胞。1.2枯否细胞以外的其他巨噬细胞除了枯否细胞,正常肝脏中还存在其他巨噬细胞群体。首先,肝包膜巨噬细胞已经被证实存在于人和小鼠的肝脏中23,27。肝包膜由一层间皮细胞和一层位于肝表面下方的包膜成纤维细胞组成28,而肝包膜巨噬细胞存在于此。在小鼠肝脏中,肝包膜巨噬细胞来源于单核细胞,在断奶时积累在包膜中27。它们表达通用的巨噬细胞标志物,如F4/80和CD64,但不表达枯否细胞的标志物,如VSIG4、CLEC4F、FOLR2 或 CLEC223。此外,它们也表达CX3CR1和CD20723,27。肝包膜巨噬细胞尽管在小鼠中具有明确的特征,但在
13、人类中特征仍不明确。一方面,可能是因为相关标志物在人和小鼠中缺乏保守性23;另一方面,可能是人类肝活检组织中缺乏包膜组织。此外,肝包膜巨噬细胞的转录特征在小鼠肝脏中并不是独特的。中央静脉区存在一群巨噬细胞,其转录特征与肝包膜巨噬细胞相似23。此外,在正常人和小鼠的肝脏中还发现了另外一群巨噬细胞。它们靠近胆管23,其转录谱在不同物种间是一样的,与脂肪组织和脂肪肝中的脂质相关巨噬细胞相似17,29。因此,我们将这些细胞称为胆管脂质相关巨噬细胞23。在小鼠肝脏中,胆管脂质相关巨噬细胞没有特异的表面标志物,而在人体肝脏 中,通 过 CITE seq 分 析 CD14、CD11a、CD26、CD141和
14、CD9进而识别胆管脂质相关巨噬细胞23。2肝脏巨噬细胞的分区和相互作用单核细胞和巨噬细胞具有较强的可塑性,以便快速适应微环境的改变。2004年的一项研究使用第43卷第10期2023年10月夏安亮,孙倍成.巨噬细胞参与非酒精性脂肪性肝病的研究进展 J.南京医科大学学报(自然科学版),2023,43(10):1456-14631457南京医科大学学报第43卷第10期2023年10月免疫组织化学和地高辛胶原酶灌注分离方法,发现枯否细胞在门区和静脉周围存在功能差异30。2021年的一项研究使用定量多重共聚焦成像和数学建模评估了肝脏免疫细胞的定位,发现枯否细胞聚集在门区周围31。免疫分区是一个依赖于肠道
15、菌群的动态过程,而肝窦内皮细胞被确定为免疫分区过程中的关键细胞,主要通过影响趋化因子成分而发生作用31。在人体正常肝脏中,MARCO阳性枯否细胞在门区相对富集32。近年来,空间转录组学技术的出现,证实了人体CD68+MARCO+驻留枯否细胞定位于门区,而招募的CD68+MARCO-巨噬细胞靠近中央静脉33。然而,小鼠研究未能揭示巨噬细胞的任何特定分区,仅能发现一些单核细胞衍生的巨噬细胞位于大血管周围15-17,24。肝脏中巨噬细胞与其他细胞相互作用。巨噬细胞的特异性是由肝窦内皮细胞、肝星状细胞和肝细胞共同塑造的。这些细胞表达CSF1、DDL4、TGF和BMP9等配体,进而激活巨噬细胞中的一些转
16、录因子,如LXR、SPIC、RBPJ、SMADs和ID3,从而维持巨噬细胞特异性转录14-16。3巨噬细胞在非酒精性脂肪性肝病中的异质性巨噬细胞在肝脏疾病环境中由于受到不同的代谢和免疫等信号刺激,会表现不同的功能。单细胞RNA测序研究揭示了正常和代谢疾病中肝脏内多种巨噬细胞群体。代谢性疾病中肝脏巨噬细胞多样性的研究大多集中在非酒精性脂肪性肝病的后期阶段,包括非酒精性脂肪性肝炎。在非酒精性脂肪性肝炎中,单核细胞衍生的巨噬细胞数目和比例显著增加,可由正常情况下的10%增加到50%,打破了原有驻留巨噬细胞和招募的巨噬细胞之间的平衡17,20-22,34。这些招募的巨噬细胞包括过渡型巨噬细胞、单核细胞
17、衍生的枯否细胞和脂质相关巨噬细胞17,20,22。与非脂质相关巨噬细胞相比,脂质相关巨噬细胞在非酒精性脂肪性肝炎进程中表现出促炎表型17,20。由于胚胎来源的枯否细胞的丧失,单核细胞衍生的枯否细胞增加,以弥补枯否细胞池。在非酒精性脂肪性肝炎中,枯否细胞也可被划分为Trem2high、Trem2low、胚胎来源和单核细胞衍生的枯否细胞,Trem2high枯否细胞表型类似于脂质相关巨噬细胞 17,20-21,35。2021年的一项研究揭示了一种胚胎来源的枯否细胞,通过表达CD36,对肥胖相关的氧化应激具有至关重要的作用24。单细胞测序分析人和小鼠肝脏巨噬细胞的转录图谱,发现人体TREM2+CD9+
18、瘢痕相关巨噬细胞和小鼠脂质相关巨噬细胞重叠,表明人和鼠中这两个巨噬细胞群可能是相同的细胞群17。在纤维化的微环境中,瘢痕相关巨噬细胞逐渐增加,并上调促纤维化基因,包括Spp1、Lgals3、Ccl2、Cxcl8、Pdgfb和Vegfa36。因此,单细胞测序技术在非酒精性脂肪性肝炎进程中,有助于揭示肝脏巨噬细胞促纤维化表型。虽然这些研究揭示了单核细胞衍生的巨噬细胞在人和鼠中的有害作用,但2021年的一项研究表明,胚胎来源的肝脏巨噬细胞对肝脏脂肪变性相关的氧化应激有促进作用24。因此,无论是胚胎来源的巨噬细胞还是单核细胞衍生的巨噬细胞,它们在非酒精性脂肪性肝炎中的作用可能是一个动态的演变过程。4巨
19、噬细胞在非酒精性脂肪性肝病中的作用4.1炎症作用肝脏巨噬细胞在代谢性疾病中的重要性不言而喻。肝脏巨噬细胞的清除可减轻炎症。小鼠在高脂饮食喂养1520周后,通过RNA测序分析肝脏驻留的巨噬细胞和招募的巨噬细胞,提示在肥胖和肝脏脂肪变性时,炎性标志物只在单核细胞衍生的巨噬细胞而不是驻留的枯否细胞中表达37。然而,这两种细胞群体只是根据表面标志物 F4/80 和CD11b表达水平来定义的,即F4/80lowCD11b+代表招募的巨噬细胞,F4/80highCD11b+代表驻留的巨噬细胞,无法区分驻留和招募的巨噬细胞不同亚群。在另外一种非酒精性脂肪性肝炎的模型中,即蛋氨酸胆碱缺乏饮食6周的小鼠中,通过
20、转录组分析证实,与胚胎来源的巨噬细胞相比,单核细胞衍生的巨噬细胞处于更高的促炎状态21。在两种巨噬细胞中,脂代谢相关基因在非酒精性脂肪性肝炎中是最易受调节的。该研究也表明了在非酒精性脂肪性肝炎中,驻留的巨噬细胞减少,而单核细胞浸润增加。然而在单纯脂肪变时并没有发生这种情况,表明单核细胞的浸润和炎症的增加仅发生在非酒精性脂肪性肝病的后期阶段,即非酒精性脂肪性肝炎。一致的是,肥胖合并单纯脂肪变患者肝脏巨噬细胞的转录组学分析揭示,这些巨噬细胞没有任何炎症激活38。单细胞测序技术允许深入研究巨噬细胞亚群表型以及根据它们的来源、功能和相关的炎性表型区分细胞39。肝脏巨噬细胞介导的炎症依赖于单核细胞的招募
21、和肝脏疾病的严重程度。单细胞测1458序分析了饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝脏巨噬细胞亚群的转录组学特征。单核细胞衍生的巨噬细胞具有更明显的促炎特征,而胚胎来源的巨噬细胞要么没有促炎特征,要么比其健康对照组略具促炎特征17,20,22,35,40。因此,这些研究证实了非酒精性脂肪性肝炎中炎症和单核细胞招募之间的关系。此外,非酒精性脂肪性肝病的巨噬细胞高表达p38和FoxO1。使用巨噬细胞特异性敲除P38a和Foxo1的小鼠,证实了P38a和Foxo1的敲除可减少促炎细胞因子的分泌,增加M2巨噬细胞的极化,降低炎症,抑制非酒精性脂肪性肝炎的发展41-42。而巨噬细胞XBP1通过激活巨噬
22、细胞NLRP3信号促进促炎细胞因子表达和M1巨噬细胞的极化,加重炎症,促进非酒精性脂肪性肝炎的进展43。4.2胰岛素抵抗巨噬细胞介导的胰岛素抵抗,是独立于炎症而存在的,并且在炎症发生前出现38。在高脂饮食早期且没有炎症的情况下,清除肝脏巨噬细胞可以改善胰岛素的敏感性44-45。通过在肝脏巨噬细胞中特异性敲除炎症主要调节因子NFB,可以减少IL1表达并改善肥胖小鼠的肝脏胰岛素敏感性,表明肝脏巨噬细胞源性IL1在肥胖引起的肝功能障碍中发挥了直接作用46。然而,在肝脏巨噬细胞中特异性敲除Il1b未能改善肥胖小鼠的肝脏胰岛素敏感性38。这一发现表明,肝脏巨噬细胞中的NFB可能独立于IL1调节肥胖小鼠的
23、肝脏胰岛素敏感性。因此,研究肝脏巨噬细胞中NFB下游的转录调控以及验证其靶基因在胰岛素敏感性中的功能将是未来的研究方向。此外,脂肪组织巨噬细胞上表皮生长因子受体的激活可加重胰岛素抵抗。研究表明高脂饮食增加了脂肪组织巨噬细胞中表皮生长因子受体及其配体双调蛋白的表达。而选择性去除脂肪组织巨噬细胞上表皮生长因子受体,可抑制肥胖和胰岛素抵抗的发展47。据报道,脂肪组织巨噬细胞来源的miR29a,可通过外泌体转运到肝脏,进而诱导胰岛素抵抗。其作用机制与下游 PPAR密切相关。GW501516,作为PPAR的激动剂,可改善miR29a诱导的胰岛素抵抗48。然而,也有研究表明,M2极化的骨髓源性巨噬细胞分泌
24、含有miR690的外泌体,可以改善肥胖小鼠葡萄糖耐受和胰岛素敏感性,提示miR690可能成为治疗代谢性疾病的新胰岛素增敏剂49。4.3脂代谢和氧化应激肝脏中肝细胞脂肪酸过度积累时,会发生脂毒性,进而导致内质网应激、氧化应激、肝细胞衰老和凋亡。脂肪变的肝细胞分泌细胞因子和趋化因子,包括CCL2、CXCL10和细胞外囊泡,进而激活非实质细胞(包括肝星状细胞、肝窦内皮细胞和巨噬细胞)50-51。另外,游离胆固醇也可以介导脂肪肝中巨噬细胞的活化52。正常情况下,巨噬细胞具有模式识别受体(介导促炎信号)和清道夫受体(参与脂质摄取和吞噬)。而在非酒精性脂肪性肝病中,清道夫受体A和脂肪酸转运蛋白CD36受到
25、广泛关注,因为它们介导低密度脂蛋白的摄取53-54。已有研究表明小鼠体内枯否细胞的清除,可减少高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性和炎症55。活化的枯否细胞会分泌促炎细胞因子,包括IL1和TNF,而这些细胞因子通过PPAR途径抑制参与肝细胞脂质代谢的基因,从而促进肝细胞脂肪变性44,56。有趣的是,富含脂肪的巨噬细胞在摄取凋亡的脂肪变性肝细胞后,也可转变成抗炎表型57。此外,Blriot等24使用单细胞转录组分析和命运图谱方法证实在健康和肥胖者中,除了主要的CD206lowESAM-枯否细胞群外,还有 CD206highESAM+亚群,均通过CD36的表达参与脂质代谢的调节。Weiss等58的最新研究表
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