抗番茄早疫病放线菌的筛选与防效研究.pdf
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1、第 46 卷第 4 期浙江师范大学学报(自然科学版)Vol.46,No.42023 年 11 月 Journal of Zhejiang Normal University(Nat.Sci.)Nov.2023 DOI:10.16218/j.issn.1001-5051.2023.032抗番茄早疫病放线菌的筛选与防效研究邵嘉朱,郭 鑫,袁歆瑜,宋 振,廖鑫琳,蒋冬花(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)摘 要:为了寻找番茄早疫病的微生物生防制剂,减少该病害对番茄产量与品质的影响.利用共培养法和菌丝生长抑制法从土壤中筛选番茄早疫病害的拮抗菌,并考察其抗菌谱、发酵液稳定性与防
2、效效果.结果表明:成功筛选得到 1 株拮抗番茄早疫病较强的菌株 Sa-6,菌丝生长抑制法显示该菌株发酵液对番茄早疫菌丝抑制率达 60.27%;根据形态学、生理生化特征和 16S rDNA 序列分析结果,鉴定菌株 Sa-6 为微黄白链霉菌(Streptomy-ces albiflaviniger);其发酵滤液对杨树枯萎病菌、西瓜炭疽病菌等5 种病原真菌及大豆细菌性斑点、水稻细菌性条斑等 8 种病原细菌均具有较好的抑制作用;同时菌株 Sa-6 发酵滤液对番茄早疫病的防效可达 90%以上.因此,菌株微黄白链霉菌 Sa-6 有望为微生物生防制剂开发提供优良的菌种资源.关键词:番茄早疫病;茄链格孢菌;放
3、线菌;微黄白链霉菌;抗菌谱;防治效果中图分类号:S432 文献标识码:A 文章编号:1001-5051(2023)04-0416-09A study on screening and biocontrol effect of antagonisticactinomycetes against tomato early blightSHAO Jiazhu,GUO Xin,YUAN Xinyu,SONG Zhen,LIAO Xinlin,JIANG Donghua(College of Chemistry and Life Sciences,Zhejiang Normal University,J
4、inhua 321004,China)Abstract:In order to find microbial biocontrol agents against tomato early blight and reduce the impact of dis-ease on tomato yield and quality,antagonists against tomato early blight were screened from soil by co-culture and mycelial growth inhibition method,the antibacterial spe
5、ctrum,fermentation broth stability and control effect were then investigated.The results showed that Sa-6,a strong antagonistic strain against tomato early blight was successfully screened from soil.The results of mycelial growth inhibition method indicated that the inhibition rate of the fermentati
6、on broth of strain Sa-6 to the mycelia of tomato Alternaria solani was up to 60.27%.The strain Sa-6 was identified as Streptomyces albiflaviniger according to morphological characteris-tics,physiological and biochemical experiments and 16S rDNA sequencing analysis.The fermentation filtrate of strain
7、 Sa-6 had a good inhibitory effect on the 5 representative pathogenic fungi such as Fusarium solani and Colletotrichum lagenerium,as well as 8 pathogenic bacteria such as Pseudomonas syringae pv.glycinea and Xanthomonas oryzae pv.oryzicola.In addition,the control effect of the fermentation filtrate
8、of strain Sa-6 on tomato early blight was more than 90%,which suggested that the strain Sa-6 could be considered as a potential 收文日期:2022-06-29;修订日期:2022-12-15基金项目:浙江省基础公益研究计划资助项目(LGN22C140004)作者简介:邵嘉朱(1998),女,浙江嘉兴人,硕士研究生.研究方向:微生物资源.通信作者:蒋冬花.E-mail:jdh resource for the development of microbial bioco
9、ntrol agents.Key words:tomato early blight;Alternaria solani;actinomycetes;Streptomyces albiflaviniger;antimicrobial spectrum;control effect番茄早疫病是由茄链格孢菌(Alternaria solani,As)引起的一种真菌性病害,在番茄整个生长周期中均可发病,主要侵染叶片、茎和果实.该病在流行年份可致使番茄减产高达 50%1,此病菌对马铃薯、辣椒、茄子等多种作物均具有侵染性2.目前,番茄早疫病的防治主要依靠选育抗病品种、加强栽培管理和化学防治等手段,其中化
10、学农药的广泛使用极易诱发植株产生抗药性、危害环境.生物防治以其选择性高、绿色、安全无毒等优点,日益受到国内外环境保护研究者的重视3.利用有益生防菌防治植物病害已有相关报道.例如,高振峰4从不同来源植物内生细菌中筛选得到1 株对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)有良好田间防效的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SY-1,其对番茄灰霉防效可达 80.33%;刘冬等5分离得到解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JDF3,可有效抑制大豆疫霉(Phytophthora soiae)的生长和孢子囊的产生,盆栽结果表明,其对大豆疫霉的防治
11、率为 70.7%;Amaresan 等6从番茄叶组织中分离得到抗植物病原真菌的 BETS11 菌株,对西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、西瓜炭疽病菌(Colle-totrichum lagenerium)均具有良好的防治效果.放线菌是产生农用抗生素的重要微生物资源,实际生产所用的抗生素约 70%是由各种链霉菌产生,因此其在植物病害生物防治中具有广阔的应用前景.Li 等7发现,链霉菌 LA-5 的代谢产物可有效抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)分生
12、孢子的产生及菌丝的生长;Djebaili 等8发现,一株白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)有较强的体外抗菌活性,还可有效抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)菌丝的生长;周天惠等9发明公开了一种可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)生防菌剂产品,该链霉菌对苹果炭疽叶枯病(Glomerella cingulata)、苹果斑点落叶病(Alternaria alternata f.sp.mali)、番茄早疫病(A.solani)均具有较好的防治效果.番茄早疫病造成番茄产量与品质的下降
13、,因生物防治法具有成本低廉、绿色环保可持续等显著特点,现被广泛应用于农业防治等相关领域中.本研究从不同生境土壤中筛选出形态各异的放线菌,采用共培养法初筛与菌丝生长抑制法复筛,得到具有拮抗番茄早疫病菌的放线菌,并对其进行种属鉴定、发酵液稳定性、抗菌谱分析及防效实验,以期为番茄早疫病害的生物防治提供理论依据,进而推动微生物农药制剂的开发.1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 菌株来源放线菌菌株:采自植被覆盖率好、腐殖质丰富的番茄、香樟、龙爪槐等根际土壤,经多次分离、纯化后获得.植物病原细菌:大豆细菌性斑点菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea,NEAU1)、水稻细菌
14、性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,RS105)、大豆细菌性斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv.gly-cines,NJAU4)、番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato,DC3000)、野油菜黄单胞病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,ZJNb5)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum,Ms43)、烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci,Ms57)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas
15、oryzae pv.oryzae,ZJNb6)8种植物病原细菌,由浙江师范大学微生物资源开发利用实验室提供,保存于-80 冰箱.植物病原真菌:苦瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.momordicae,Ms12)、杨树枯萎病菌(Fusarium solani,Ms26)、西瓜炭疽病菌(Colletotrichum lagenerium,Ms39)、番茄早疫病菌(As,Ms65)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomy-ces graminis,Ms61)、假禾谷镰刀病菌(Fusarium pseudograminearum,Ms66)6 种植物病原真菌,由浙江师714 第
16、 4 期 邵嘉朱,等:抗番茄早疫病放线菌的筛选与防效研究范大学微生物资源开发利用实验室提供,供真菌抗菌谱测定.其中:As 用于放线菌筛选、稳定性及防效实验.1.1.2 供试番茄品种选用对番茄早疫病易感的 3 个番茄品种(粉红嘉丽、金珠、亚非 1 号),用于 As 防效研究.1.1.3 培养基高氏 1 号培养基:用于放线菌菌株分离纯化,购置于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司.牛肉膏蛋白胨培养基:用于植物病原细菌的培养,购置于北京索莱宝科技有限公司.马铃薯葡萄糖琼脂培养基:用于植物病原真菌的培养,购置于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司.1.2 方 法1.2.1 放线菌的分离纯化和保藏从土壤
17、中分离具有典型放线菌菌落特征的单菌落,经 3 次划线纯化后得纯菌株,保藏备用,具体分离纯化方法参考文献10.1.2.2 拮抗 As 放线菌的筛选共培养法初筛:取放线菌菌饼接种于 PDA 培养基中央,四周等距接种 As 菌饼,28 培养,直至对照培养基(中央放置高氏 1 号培养基菌饼)菌丝长满培养皿,测量抑菌圈大小,初步筛选有拮抗作用的放线菌菌株.发酵滤液制备:接种目标放线菌菌饼于高氏 1 号液体培养基中,摇床(28,160 r/min)发酵培养7 d,取适量发酵液于离心管中,10 000 r/min 离心 5 min,随后将上清液滤过 0.22 m 滤膜,即得无菌发酵滤液.用菌丝生长抑制法11
18、测量菌落大小,比较菌落生长差异并计算菌丝抑制率12,挑选具有较强拮抗作用的目标放线菌用于后续实验.1.2.3 拮抗 As 放线菌的筛选形态特征观察13:通过插片法与扫描电镜观察放线菌基内菌丝、气生菌丝、孢子丝等形态特征.生理生化实验14:具体方法参照放线菌快速鉴定与系统分类15进行.16S rDNA 序列测序分析:将目标菌株平板送至上海生物工程股份有限公司测序,得到的 16S rDNA 序列用 BLAST 比对进行分析,采用MEGA-X 软件中 Neighbor-Joining 法构建系统发育树16,结合生理生化和形态学特征确定目标菌株种属.1.2.4 目标菌株抗菌谱测定对植物病原细菌的抑菌作
19、用:采用牛津杯法测定菌株 Sa-6 发酵液对 8 种植物病原细菌的抑制作用,每组实验各设置 3 次重复.具体实验方法可参考文献17.对植物病原真菌的抑菌作用:采用菌丝生长抑制法11测定菌株 Sa-6 发酵液对 6 种植物病原真菌的抑制作用,每组实验各设置 3 次重复.1.2.5 目标菌株发酵液抑菌活性物质稳定性研究将目标菌株发酵液分别置于紫外灯和普通日光灯下照射相应时长后;在所设温度下处理 2 h 后放至室温;在所设酸碱度下处理 2 h 后调回原始 pH(pH7.4).按照菌丝生长抑制法测定不同条件处理下的发酵液抑菌活性,每组实验重复 3 次.1.2.6 目标菌株粗浸膏的最低抑制浓度测定将菌株
20、 Sa-6 滤液与等体积的乙酸乙酯混合萃取,直至上层乙酸乙酯层无色.将得到的乙酸乙酯层合并,在旋转蒸发仪上 50 蒸发浓缩,即得菌株 Sa-6 发酵液的乙酸乙酯粗浸膏.取 As 菌饼接种于含不同粗浸膏质量浓度的 PDA 培养基中央,以不加粗浸膏的 PDA 培养基作为空白对照,28 培养5 d,测量菌落直径,实验重复 3 次,记录 As 不生长的粗浸膏质量浓度,即为粗浸膏最低抑制浓度.1.2.7 目标菌株发酵液拮抗 As 的防效研究番茄幼苗培育18:取经过酒精表面消毒处理后的粉红嘉丽、金珠、亚非 1 号 3 个品种的番茄种子各814浙江师范大学学报(自然科学版)第 46 卷15 粒放于培养皿中,
21、加 5 mL 无菌水,26 黑暗培养至种子露白后播种到盆钵土壤中,置于光照培养箱培养 40 d.As 病菌接种和处理:取番茄植株的 2 片真叶,用注射器在叶片下表面制造伤口,用封口膜将菌饼固定于伤口处,每片叶片接种 1 个菌饼,保湿24 h.将盆栽放置于26 光照培养箱,7 d 后将薄膜和菌饼取下统计发病情况.实验设置对照组(CK)和处理组(T),每处理 10 个生物学重复:空白对照(CK1);只接种琼脂块;接菌对照(CK2):只接 As 菌饼;处理 1(T1):在叶片上先喷洒发酵滤液 10 倍稀释液至液体从叶片滴落,喷洒 6 次,每次间隔 0.5 h,6 h 后接种 As 菌饼叶片伤口上;处
22、理 2(T2):处理方法同 T1,但先接种 As 菌饼后喷洒发酵滤液 10 倍稀释液;处理 3(T3):将发酵滤液 10 倍稀释液浇到土壤至湿润,并在叶片上先喷洒发酵滤液 10 倍稀释液至液体从叶片滴落,喷洒 3 次,每次间隔 1 h,6 h 后接种 As 菌饼至叶片伤口上.待病情发展趋于稳定后,统计发病情况.以叶片为单位调查病情,番茄早疫病病情分 04 级,标准如下19:0 级:全株叶片无病斑;1 级:病斑面积占叶片总面积的 1/4 以下;2 级:病斑面积占叶片总面积的 1/41/2;3 级:病斑面积占叶片总面积的1/23/4,近一半小叶枯死;4 级:病斑面积占叶片总面积的 3/4 以上,一
23、半以上小叶枯死.根据以上病情分级标准,计算病情指数和相对防效20.2 结果与分析2.1 拮抗 As 放线菌菌株的筛选经分离纯化共获 138 株放线菌纯菌株,代表性放线菌纯菌株在高氏 1 号培养基培养 7 d 的菌落(见图 1).图 1 高氏 1 号培养基上培养 7 d 的放线菌菌落 A:空白对照;B:菌株 Sa-6 菌饼 图 2 菌株 Sa-6 对 As 的抑菌圈采用共培养法和菌丝生长抑制法对分离所得的放线菌进行初筛和复筛,最终筛选获得1 株拮抗 As 作用较强的放线菌,编号为 Sa-6,其抑菌圈直径为(46.01.5)mm(见图 2).2.2 菌株 Sa-6 鉴定2.2.1 菌株 Sa-6
24、形态特征菌株 Sa-6 在高氏 1 号培养基上生长迅速;菌落表面突起,颜色多为白色,菌丝与培养基连接不紧密,易于挑起;显微镜观察其基内菌丝和气生菌丝纤细,气生菌丝呈现白色且多分枝,基内菌丝呈现黄绿色相互交缠紧密,孢子914 第 4 期 邵嘉朱,等:抗番茄早疫病放线菌的筛选与防效研究丝呈螺旋状(见图 3).图 3 菌株 Sa-6 的菌落形态和显微结构2.2.2 菌株 Sa-6 生理生化特性菌株 Sa-6 呈革兰氏阳性,能水解淀粉、纤维素、脂肪、明胶、尿素,产生过氧化氢酶,不产生 H2S、黑色素,V-P 实验与 M-R 实验结果呈阴性(见表 1 和图4).菌株 Sa-6 可以有效利用多种氮源、碳源
25、.其中:对蛋白胨、硝酸钾和多种氨基酸的利用效果较好;鼠李糖、麦芽糖、棉子糖则是菌株 Sa-6 高效利用的碳源(见表 2).表 1 菌株 Sa-6 生理生化实验结果实验项目实验结果实验项目实验结果实验项目实验结果实验项目实验结果淀粉水解+纤维素水解+硫化氢产生-黑色素产生-明胶液化+过氧化氢酶+M-R 实验-V-P 实验-脲酶+脂肪酶+注:+表示能力很强;+表示能力强;+表示能力中;+表示能力较弱;-表示无.a:淀粉水解圈;b:纤维素水解圈;c:过氧化氢酶分解过氧化氢;d:脂肪酶分解脂肪;e:脲酶分解尿素图 4 菌株 Sa-6 生理生化部分实验结果表 2 菌株 Sa-6 碳源、氮源利用实验结果碳
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