抗冷冻蛋白Ⅲ对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞线粒体的影响.pdf
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1、中国畜牧兽医 ,():C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y&V e t e r i n a r yM e d i c i n e抗冷冻蛋白对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞线粒体的影响刘可可,薛梦琦,唐非台,杜倩笙,王欣雨,董胤余,王晓丽(广西大学动物科学技术学院,南宁 )摘要:【目的】探索抗冷冻蛋白(a n t i f r e e z ep r o t e i n,A F P)对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞线粒体的保护作用.【方法】以周龄昆明雌性小鼠为试验材料,将收集的小鼠M期卵母细胞随机分为空白对照组、冷冻对照组(经过玻璃化冷冻解冻过程)和A F P添加组(在冷冻平衡
2、液及冷冻液中均添加 n g/m LA F P),利用线粒体绿色荧光探针(M i t o T r a c k e rg r e e n,MT G)检测线粒体分布及含量,J C 荧光染色检测线粒体膜电位,溶酶体红色荧光探针(L y s o T r a c k e r r e d,L T R)检测线粒体与溶酶体共定位,二氯荧光素二乙酸(D C F H D A)检测活性氧(R O S)水平,A T PA s s a yK i t检测线粒体A T P含量.【结果】与空白对照组相比,玻璃化冷冻后小鼠卵母细胞的线粒体含量显著降低,部分线粒体呈现异常的散点状分布,且线粒体溶酶体共定位情况明显增多,线粒体膜电位
3、显著降低(P );同冷冻对照组相比,A F P添加组的小鼠卵母细胞线粒体含量显著升高,异常分布的线粒体和线粒体溶酶体共定位情况减少,线粒体膜电位显著升高(P ).与空白对照相比,玻璃化冷冻后小鼠卵母细胞的R O S含量显著升高而A T P含量显著降低(P );与冷冻对照组相比,A F P 添加组R O S含量显著下降而A T P含量显著升高(P ).【结论】A F P有助于改善玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的氧化应激反应,对冻融卵母细胞线粒体具有保护作用.关键词:抗冷冻蛋白(A F P);线粒体;卵母细胞;玻璃化冷冻中图分类号:S 文献标识码:AD o i:/j c n k i 开放科学(资源服务)标
4、识码(O S I D):收稿日期:基金项目:国家自然科学基金资助项目();广西自然科学基金资助项目(G X N S F AA )联系方式:刘可可,E m a i l:q q c o m;薛梦琦,E m a i l:q q c o m.刘可可与薛梦琦对本文具有同等贡献,并列为第一作者.通信作者王晓丽,E m a i l:x i a o l i w a n g g x u e d u c nE f f e c t o fA F Po nM i t o c h o n d r i ao fV i t r i f i e dM o u s eO o c y t e sL I U K e k e,XU
5、E M e n g q i,T ANGF e i t a i,DU Q i a n s h e n g,WANGX i n y u,D ONGY i n y u,WANGX i a o l i(C o l l e g e o fA n i m a lS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,G u a n g x iU n i v e r s i t y,N a n n i n g ,C h i n a)A b s t r a c t:【O b j e c t i v e】I no r d e r t oe x p l o r e t h ep r o t e
6、 c t i v ee f f e c to fa n t i f r e e z ep r o t e i n(A F P)o nm i t o c h o n d r i ao f v i t r i f i e dm o u s eo o c y t e s【M e t h o d】K u n m i n g f e m a l em i c e a g e d w e e k sw e r eu s e da s t e s tm a t e r i a l s,t h e c o l l e c t e dm o u s eo o c y t e s a tMs t a g ew e
7、 r e r a n d o m l yd i v i d e d i n t ob l a n kc o n t r o l g r o u p,f r o z e nc o n t r o l g r o u pa n dA F Pa d d i n gg r o u p(n g/m LA F P w a sa d d e dt of r o z e nb a l a n c es o l u t i o na n df r o z e ns o l u t i o n),M i t o T r a c k e rg r e e n(MT G)w a su s e dt od e t e
8、c t t h ed i s t r i b u t i o n a n d c o n t e n t o f m i t o c h o n d r i a,J C f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g w a s u s e d t o d e t e c tm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l,L y s o T r a c k e r r e d(L T R)w a su s e d t od e t e c t t h e c o l o c a l i z a
9、t i o no fm i t o c h o n d r i aa n dl y s o s o m e s,d i c h l o r o f l u o r e s c e i nd i a c e t i ca c i d(D C F H D A)w a su s e dt od e t e c tt h e l e v e lo fR O S,a n dAT P A s s a yK i tw a su s e dt od e t e c tt h ec o n t e n to fm i t o c h o n d r i a lAT P【R e s u l t】C o m p a
10、 r e dw i t ht h eb l a n kc o n t r o lg r o u p,t h ec o n t e n to fm i t o c h o n d r i ai nm o u s eo o c y t e s期刘可可等:抗冷冻蛋白对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞线粒体的影响w e r ed e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e rv i t r i f i c a t i o n,s o m e m i t o c h o n d r i as h o w e da b n o r m a ls c a t t e
11、 r e dd i s t r i b u t i o n,t h e c o l o c a l i z a t i o n o f m i t o c h o n d r i a a n d l y s o s o m e s w e r e i n c r e a s e d,a n d t h em i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a lw a sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y(P )C o m p a r e dw i t ht h ef r o z e nc
12、 o n t r o lg r o u p,t h e m i t o c h o n d r i a lc o n t e n to f m o u s e o o c y t e si n A F P g r o u p w a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d,t h ea b n o r m a ld i s t r i b u t i o n o f m i t o c h o n d r i aa n dt h ec o l o c a l i z a t i o n o fm i t o c h o n d r i a l y
13、 s o s o m e sw e r e r e d u c e d,a n d t h em i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a lw a s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d(P )C o m p a r e dw i t ht h eb l a n kc o n t r o l g r o u p,t h eR O Sc o n t e n to fm o u s eo o c y t e sw a ss i g n i f i c a n t l y i n c
14、 r e a s e da n dAT Pc o n t e n tw a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e da f t e rv i t r i f i c a t i o n(P )C o m p a r e d w i t ht h ef r o z e nc o n t r o lg r o u p,t h e R O Sc o n t e n to f A F P g r o u p w a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e da n dAT Pc o n t e n tw a ss
15、 i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d(P )【C o n c l u s i o n】A F P c o u l di m p r o v et h eo x i d a t i v es t r e s sr e s p o n s eo fv i t r i f i e d m o u s eo o c y t e sa n dp r o t e c tm i t o c h o n d r i ao f f r o z e na n dt h a w e do o c y t e s K e yw o r d s:a n t i f r e
16、e z ep r o t e i n(A F P);m i t o c h o n d r i o n;o o c y t e;v i t r i f i c a t i o n玻璃化冷冻自首次报告以来,随着生物技术的发展,不断地得到改进和完善,广泛用于种质资源保护和濒危物种保存.但由于卵母细胞的生理结构特殊,玻璃化冷冻对卵母细胞的细胞膜和线粒体等会造成不可逆的损害,对线粒体结构和功能也存在一定的 破 坏,甚 至 会 影 响 卵 母 细 胞 受 精 和 发 育 能力 .因此,研究人员仍在不断努力改进冷冻液配方以期获得更佳的冻存效果.抗冷冻蛋白(a n t i f r e e z ep r o
17、t e i n s,A F P s)是可以提高生物抗冻能力的不同结构冰结合蛋白的总称,具有良好的低温保存能力,它们与冰晶结合从而避免冰晶的生长 .其中抗冷冻蛋白(A F P)是目前应用最广泛和尚未发现有毒性的抗冷冻保护剂之一.目前已有关于添加A F P来冷冻卵巢、精子以及卵母细胞等报道,但多倾向于发育的研究,关于A F P对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞线粒体影响的研究还未见报道.因此,本研究拟通过在冷冻平衡液及冷冻液中均添加A F P来探讨A F P对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻复苏后的线粒体含量及分布、线粒体膜电位、线粒体溶酶体共定位情况、活性氧(R O S)和AT P含量的影响,为进一步提高玻璃化冷冻
18、卵母细胞的质量和发育潜能提供参考依据.材料与方法 材料 试验动物S P F级雌性周龄昆明小鼠(许可证编号:S Y X K桂 ),购于中国广西医科大学实验动物中心,试验前适应性饲养于室温条件下()至少周.主 要 试 剂 孕 马 血 清 促 性 腺 激 素(p r e g n a n tm a r es e r u mg o n a d o t r o p i n,PM S G)购自北京索莱宝科技有限公司;人绒毛膜促性腺激素(h u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p i n,HC G)购自宁波第二激素厂;胎牛血清(f e t a lb o v i
19、n es e r u m,F B S)购自G i b c o公司;A F P 购于A f p r o t e i n公司;线粒体绿色荧光探针(M i t o T r a c k e rg r e e n,MT G)(C )、溶 酶 体 红 色 荧 光 探 针(L y s o T r a c k e rr e d,L T R)(C )、R O S检测试剂盒(二氯荧光素二乙 酸,D C F H D A)(S S)、J C 线粒体膜电位检测试剂盒(C )与AT P检测试剂盒(S )均购自碧云天生物技术有限公司;蔗糖(s u c r o s e,S u)等其他试剂均购自S i g m a公司.溶液配制
20、K S OM培养液:g/LK C l g/LN a C l g/LM g S O HO g/L KHP O g/L葡 萄 糖 g/L链霉素 g/L青霉素G g/LN a HC O g/LC a C l HO g/L乳酸钠 g/L丙酮酸钠 g/LE D T A g/LL谷氨酰胺 g/L酚红 g/LB S A.玻璃化冷冻及解冻液:冷冻 平 衡 液:K S OM DM S O E G F B S m o l/L H e p e s m o l/LS u;冷 冻 液:K S OM DM S O E G F B S m o l/LH e p e s m o l/LS u;解 冻 液:K S OM F B
21、 S m o l/LH e p e sm o l/LS u;解冻液:K S OM F B S m o l/L H e p e s m o l/LS u.方法 卵母细胞的获取小鼠腹腔注射 I U中国畜牧兽医 卷PM S G,h后注射 I U HC G,于注射HC G h后处死小鼠,取输卵管壶腹部并用注射器针头划破,获取卵丘卵母细胞复合体并移入 透明质酸酶液中,吹打除去卵丘颗粒细胞,收集形态正常的M 期卵母细胞备用.试验分组及处理试验分为组,空白对照组:不做任何处理直接用作试验的M 卵母细胞;冷冻对照组:经过玻璃化冷冻解冻过程后复苏h的M 卵母细胞;A F P 添加组:根据本课题组前期试验筛选,在
22、冷冻平衡液和冷冻液中均添加 n g/m LA F P.卵母细胞的玻璃化冷冻解冻冷冻:将卵母细胞先放入经预平衡至 的冷冻平衡液m i n,移入冷冻液 s,然后移至半麦管上,用剥卵枪吸去卵母细胞周围多余的冷冻液,将半麦管迅速投入液氮中保存.解冻:液氮中取出半麦管,将载有卵母细胞的前段浸入预平衡至 的解冻液和解冻液中分别处理 s和m i n.K S OM培养液洗涤,、C O培养箱中培养h,挑选形态正常的卵母细胞备用.检测指标 卵母细胞线粒体含量及分布的检测按照MT G说 明 书 配 制MT G染 色 工 作 液,以DM S O充 分 溶 解MT G粉 末 制 成 mm o l/L的MT G储存液并分
23、装备用.使用时用K S OM培养液稀释储存液,制成终浓度为 n m o l/L的MT G工作液.试验在避光条件下进行.将收集的卵母细胞移入MT G染色工作液中,放入培养箱孵育染色 m i n,P B SP VA液 中 洗 涤次,再 转 移 至 LP B S液滴中于荧光显微镜观察线粒体分布情况并拍照,I m a g eJ软件分析.卵母细胞线粒体膜电位的测定试验在避光条件下进行,各操作液使用前均于培养箱中平衡至 .按 照 每 LJ C ()需m L超纯水的比例充分溶解J C (),再加入m L染色缓冲液()配制成J C 检测工作液.取m LK S OM培养液与m LJ C 工作液充分混合,将收集的
24、卵母细胞移入混合液,于 、C O培养箱中孵育 m i n,用 的染色缓冲液()将卵母细胞洗涤多次,荧光显微镜观察、拍照,I m a g eJ软件分析,红、绿荧光的相对比值即为卵母细胞的线粒体膜电位值.卵母细胞线粒体与溶酶体共定位将收集的卵母细胞按照 的步骤进行MT G染色 m i n,期间取少量mm o l/L的L T R溶液加入K S OM培养液中,制成终浓度为 n m o l/L的L T R工作液.孵育结束后,用K S OM培养液洗涤次,移入L T R染 色 工 作 液 中,培 养 箱 中 孵 育 染 色 m i n,P B SP VA液洗涤次,荧光显微镜观察、拍照,I m a g eJ软
25、件分析.卵母细胞内R O S含量的检测按照R O S检测试剂盒说明书,试验在避光条件下进行,各操作液使用前均于培养箱中平衡至 .使用K S OM培养液稀释D C F H D A检测溶液,制成终浓度为 m o l/L的D C F H D A检测工作液.将收集的卵母细胞移入配制好的 m o l/LD C F H D A荧光探针检测工作 液中,放入培 养箱内孵育 m i n,P B SP VA液中洗涤次,荧光显微镜观察、拍照,I m a g eJ软件分析.卵母细胞内AT P含量的测定按照AT P检测试剂盒说明书,各取 L梯度浓度标准溶液加入 LAT P检测工作液中,快速混匀后用多功 能 酶 标 仪
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