菌糠对棉花黄萎病及棉花根际微生物群落组成的影响.pdf
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1、收稿日期:2022-09-05?第一作者简介:曲远航(1990),男,博士研究生,。*通信作者:郭庆港(1976),男,研究员,基金项目:国家现代农业产业技术体系棉花产业技术体系(CARS-15-19);河北省自然科学基金(C2021301030);河北省农林科学院科技创新专项(2022KJCXZX-ZBS-1)菌糠对棉花黄萎病及棉花根际微生物群落组成的影响曲远航1,?2,刘天聪1,?2,鹿秀云1,李社增1,郭庆港1*,马平1(1.?河北省农林科学院植物保护研究所/河北省农业有害生物综合防治创新中心/农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室,河北 保定071000;2.?河北农业大学植
2、物保护学院,河北 保定071000)摘要:【目的】评价菌糠对棉花黄萎病的防治效果(防效),明确菌糠对棉花根际微生物群落的影响。【方法】通过温室盆栽试验及田间小区试验评价香菇菌糠对棉花黄萎病的防效;利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测棉花根际大丽轮枝菌数量;利用宏基因组测序及生物信息学分析棉花根际微生物群落和功能基因组成。【结果】土壤中添加2%(质量分数)的菌糠对棉花黄萎病的温室防效达到76.8%。添加菌糠后棉花根际大丽轮枝菌数量较空白对照减少81.02%。添加菌糠后棉花根际微生物中微杆菌属(Microbacterium?spp.)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium?spp.)、梨形孢属
3、(Serendipita?spp.)、毛壳菌属(Chaetomiumspp.)等有益微生物丰度显著上升;同时,添加菌糠还改变了棉花根际细菌和真菌的共现模式,在提高细菌物种间关联性的同时降低真菌物种间关联性。利用京都基因和基因组数据库功能注释发现,菌糠处理后棉花根际微生物ABC转运蛋白(ko02010)、双组分调节系统(ko02020)、群体感应(ko02024)等涉及细菌信号识别和定植的基因相对丰度显著提高。在河北和新疆,菌糠对棉花黄萎病的田间防效最高分别为36.84%和43.98%。【结论】菌糠能够有效防治棉花黄萎病并降低棉花根际大丽轮枝菌数量,同时可改变棉花根际微生物群落和功能基因组成。关
4、键词:菌糠;大丽轮枝菌;棉花黄萎病;根际微生物;宏基因组Effects of spent mushroom substrate on cotton Verticillium wilt and the cottonrhizosphere microbiomeQu?Yuanhang1,?2,?Liu?Tiancong1,?2,?Lu?Xiuyun1,?Li?Shezeng1,?Guo?Qinggang1*,?Ma?Ping1(1.Institute of Plant Protection,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Inte
5、grated Pest Management InnovationCenter of Hebei Province/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China,Ministryof Agriculture and Rural Affairs,Baoding,Hebei071000,China;2.?College of Plant Protection,Agricultural University ofHebei,Baoding,Hebei071000,Chin
6、a)Abstract:Objective?The?objective?of?this?study?is?to?evaluate?the?control?effect?of?spent?Lentinus edodes?substrate?(SMS)?on?cotton?Verticillium?wilt?and?to?clarify?the?effect?of?SMS?on?microbial?community?of?cotton?rhizosphere.?Method?The?control?effect?of?SMS?on?cotton?Verticillium?wilt?was?eval
7、uated?by?pot?and?plot?experiments?under?greenhouse?and?field?condition.?The?population?of?Verticillium dahliae?WX-1?in?cotton?rhizosphere?was?quantified?by?real?time?fluorescent?quantitative?polymerase?chain?reaction.?The?microbiome?and?functional?genes?composition?in?cotton?rhizosphere?were?analyze
8、d?by?metagenomic?sequencing?and?bioinformatics?method.?Result?Soil?amended?with?2%?(mass?fraction)?SMS?could?successfully?suppress?cotton?Verticillium?wilt,?and?the?greenhouse?control?effect?of?SMS?on?cotton?Verticillium?wilt?was?76.8%.?The?population?of?V.dahliae?WX-1?in?cotton?rhizosphere?amended?
9、with?SMS?decreased?by?81.02%?compared?with?the?blank?control.?The?abundances?of?beneficial?microorganisms?such?as?Microbacterium?spp.,?Mesorhizobium?spp.,?Serendipita?spp.,?Chaetomium?spp.?were?significantly?increased.?Meanwhile,?the?co-occurrence?pattern?of?bacteria?and?fungi?was?also?changed?in?th
10、e?SMS?treatment,?and?the?interspecific?association?of?bacteria?was?increased?while?the?interspecific?association?of?fungi?was?decreased.?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?(KEGG)?functional?annotation?showed?that?the?relative?abundance?of?ABC?transporter?(ko02010),?two-component?regulatory?syst
11、em?(ko02020),?and?quorum?sensing?(ko02024)?genes?involved?in?bacterial?signal?棉 花 学 报Cotton?Science?2023,35(4):274287https:/doi.org/10.11963/cs202200394期recognition?and?colonization?of?cotton?rhizosphere?microorganisms?were?significantly?increased?after?SMS?treatment.?In?Hebei?and?Xinjiang,?the?high
12、est?field?control?effect?of?SMS?on?cotton?Verticillium?wilt?was?36.84%?and?43.98%,?respectively.?Conclusion?SMS?can?effectively?control?cotton?Verticillium?wilt?and?decrease?the?population?of?V.dahliae?in?the?cotton?rhizosphere,?and?change?the?microbiome?and?functional?gene?composition.Keywords:spen
13、t?mushroom?substrate;?Verticillium dahliae;?cotton?Verticillium?wilt;?rhizosphere?microbiome;?metagenomic由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病是棉花生产上危害最为严重的土传病害之一。目前生产上抗黄萎病棉花品种缺乏,且抗性不稳定,加之在没有寄主的情况下大丽轮枝菌能够以微菌核的形式在土壤中存活15年之久1;因此,通过使用抗病品种和轮作等措施仍然难以有效防治黄萎病,导致黄萎病在我国主产棉区发病严重,亟需研发有效的防治措施。研究发现,土壤中添加生物有机质能防治作物
14、黄萎病。生物炭是一种作为土壤改良剂的木炭,能促进植物的生长,并提高其抗逆能力。Ogundeji等2研究发现,生物炭对茄子(Solanum melongena)黄萎病防效超过70%,且根际细菌多样性和丰度均显著提高,有益微生物如芽孢杆菌(Bacillus?spp.)、毛壳菌(Chaetomium?spp.)等在茄子根际得到富集。西蓝花残体粉碎后还田能有效防治生菜、马铃薯和棉花黄萎病,异硫氰酸盐及其水解产物氢氰酸是西蓝花残体分解过程中产生的主要抑菌物质3;此外,西蓝花残体还田能增加作物根际有益菌链霉菌(Streptomyces?spp.)和芽孢杆菌的丰度4。利用作物秸秆或动物粪便堆肥后的生物有机肥
15、同样能增强土壤生物酶活性,改善土壤微生物区系,防治作物黄萎病5-6。菌糠是种植食用菌后剩余的废料,我国每年生产食用菌后约有菌糠2亿t。菌糠作为农业废弃物如果不加利用随意堆放将造成资源浪费和环境污染。因此,菌糠的回收和科学利用是目前食用菌生产中迫切需要解决的问题,科学有效利用菌糠具有重要的经济效益和生态效益。菌糠富含有机物及矿质元素、有毒元素少、结构疏松、保水能力强,是一种良好的土壤处理剂7。另外,菌糠富含食用菌菌丝体及其代谢产物,使其具有多种与微生物互作相关的生物学特性8。国内外研究证明,土壤中添加菌糠能有效防治尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的作物枯萎病。菌糠能增加作物
16、根际有益微生物数量,降低病原菌数量,从而达到控制病害、促进作物生长的效果9-10。然而,目前有关菌糠防治作物黄萎病的报道甚少。本研究通过温室盆栽试验和田间小区试验,评价土壤添加菌糠对棉花黄萎病的防治效果,并对棉花根际土壤进行宏基因组分析,从生态学角度解析菌糠防治棉花黄萎病的机理,为菌糠的科学利用以及棉花黄萎病的绿色防控提供依据。1材料与方法1.1试验材料试验所用棉花品种为感黄萎病品种“鄂荆1号”,大丽轮枝菌强致病力菌株WX-1由河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室提供。所用土壤收集自棉花连作地块。香菇(Lentinus edodes)菌 糠(spent?mushroom?sub
17、-strate,?SMS)收集自河北阜平食用菌厂,菌糠自然风干后粉碎至粒径约150?m备用。1.2病原菌接种液的制备WX-1在马铃薯葡萄糖液体培养基(potato?dextrose?broth,PDB;含马铃薯200?gL1,葡萄糖20?gL1)中,25?、180?rmin1下培养6?d。培养液经4层纱布过滤,滤液在4?、10?000?rmin1条件下离心20?min,去除上清液后用无菌水重悬孢子并调整孢子含量至1107?mL1。1.3菌糠对大丽轮枝菌WX-1的影响为了分析菌糠对WX-1的抑制作用,在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato?dextrose?agar,PDA;主要成分:马铃薯20
18、0?gL1,葡萄糖20?gL1,琼脂15?gL1)和PDB培养基中添加不同质量分数(0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)的菌糠粉(121?灭菌15?min)。取5?L?WX-1孢子悬浮液(孢子含量为1107?mL1,下同)接种于添加不同质量分数菌糠粉的PDA培养皿(直径9?cm)中间,25?黑暗培养20?d,测量菌落直径。按照1%(质量分数)的接种量将WX-1孢子悬浮液接种于添加不同质量分数菌糠粉的PDB培养液中,25?、180?r曲远航等:菌糠对棉花黄萎病及棉花根际微生物群落组成的影响27535卷棉花学报min1黑暗培养6?d,利用血球计数板测量孢子含量。评价菌糠粉对WX-1微菌核形成的
19、影响,在Buffered?Minimal?Methanol?(BMM)培养基(主要成分:5?gL1葡萄糖、0.2?gL1?NaNO3、0.52?gL1?KCl、1.52?gL1?KH2PO4、0.52?gL1?MgSO47H2O、3?molL1维生素B1、0.1?molL1维生素B7;pH8.5)中添加不同质量分数(0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)的菌糠粉(121?灭菌15?min),在含有菌糠粉的BMM培养皿上铺1层微孔滤膜(孔径0.2?m),然后将WX-1孢子悬浮液(100?L)均匀涂布在滤膜上,25?黑暗培养14?d,利用显微镜观察菌糠粉对WX-1微菌核形成的影响,记录每个视野下
20、微菌核数量。以上每个处理设3个重复,以不添加菌糠粉的培养基作为空白对照。1.4菌糠对棉花黄萎病的影响通过温室盆栽试验评估菌糠对棉花黄萎病的防治效果(防效,control?effect,?CE)。将2%(质量分数)菌糠粉与土壤充分混匀,装入书式育苗盒中。棉种表面消毒后于25?催芽,每孔播种2粒露白的棉花种子。育苗盒于温室(白天30?,夜间20?)中培养,待出苗后仅保留1株长势一致的幼苗。以土壤中未添加菌糠的处理为空白对照。棉苗长至2叶1心时,采用切根蘸孢子悬浮液的方法接种大丽轮枝菌11。接菌后棉苗继续在温室中培养,接菌后21?d调查植株发病情况,并计算病情指数(disease?index,?DI
21、)。计算公式:DI(nd)/(N4)100。式中,n代表各级病株数,d代表相应病级值,N代表总株数。分级标准12如下:0级为植株无症状表现;1级为12片真叶发病;2级为34片真叶发病;3级为4片以上真叶发病或脱落;4级为全株枯死。根据病情指数计算菌糠处理对棉花黄萎病的防效。计算公式:CE(%)(DI0DI1)/?DI0100。式中,DI0代表空白对照的病情指数,DI1代表菌糠处理的病情指数。1.5宏基因组分析接种病原菌后28?d,打开书式育苗盒并将棉花从中轻轻取出,抖掉根围土后,用毛刷仔细将紧密吸附在根表的根际土刷落并收集。收集到的根际土过孔径280?m(50目)筛,去除根及其他植物组织,立即
22、冻存于80?,以备提取土壤DNA。使用FastDNATM?SPIN?Kit?for?Soil(MP?Biome-dicals,?Solon,?OH,?USA)试剂盒提取根际土壤总DNA。使用NanoDrop?2000分光光度计(Thermo?Fisher?Scientific?Inc.,?Waltham,?MA,?USA)测 定DNA的质量浓度和质量。宏基因组测序和生物信息分析由上海美吉生物医药科技有限公司利用高通量测序仪HiSeqR?2000?System(Illumina,美国)完成。每个样品设6个生物学重复。空白对照和菌糠处理的棉花根际群落结构使用QIIME(quantitative?i
23、nsights?into?microbial?ecology,version?1.9.1)计算距离矩阵(基于Bray-Curtis算法),再使用R软件(version?3.2.1)中vegan包进行主坐标分析(principal?coordinate?analysis,?PCoA)。使用DIAMOND(https:/ 蛋 白 质 序 列 数 据 库(non-redundant?protein?sequence?database,?NR)在京都基因和基因组数据库(Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes,?KEGG)中进行比对并注释,获得物种或功能基因注释信
24、息,然后使用对应的基因丰度总和计算该物种或功能基因丰度,在门、属、直系同源物和代谢通路水平上统计非冗余基因集在各个样品中的丰度,构建相应分类水平上的丰度表,并利用R软件作图。通过Cytoscape平台的CoNet计算根际微生物的相关性和相似性,构建细菌和真菌群落的共现模式。相关分析采用皮尔逊和斯皮尔曼数值为衡量标准,微生物不同属之间利用Bray-Curtis和Kullback-Leibler数值衡量不相似性。当相关系数高于0.8且P0.01时,认为分类群之间存在统计学上具有强相关关系的共现模式。使用Brow-nian法将6次测量的P值合并,然后使用Ben-jamini-Hochberg程序进行
25、调整,以减少获得假阳性结果的概率。使用Gephi软件对共现模式进行可视化,以节点代表微生物组网络中的单个微生物分类群(属),网络边线表示节点之间的成对相关性,表明在生物学上有意义的相互作用。使用Cytoscape平台的MCODE对微生物网络的拓扑特征进行评估,包括节点数(number?of?nodes,?2764期NN)、总边数(total?number?of?edges,?TE)、正相关边的比例(proportion?of?positive?edges,?PE)、负相关边的比例(proportion?of?negative?edges,?NE)、平均度(average?degree,?AD)
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