菊花根状茎发育的转录组分析.pdf
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1、研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(10):231-245收稿日期:20230408基金项目:北京市植物园管理处科技课题(BZ202203)作者简介:徐俊,男,硕士研究生,研究方向:花卉种质资源与遗传育种;Email:通讯作者:黄河,男,博士,教授,研究方向:花卉分子生物学;Email:;张蒙蒙,女,博士,高级工程师,研究方向:菊属植物种质资源创新与育种;Email:菊花根状茎发育的转录组分析徐俊1 叶雨晴1 牛雅静2 黄河1 张蒙蒙2(1.北京林业大学园林学院 花卉种质资源创新与分子育种北京市重点实验室 国家花卉工程技术研究中心 城乡生态环境北京实
2、验室,北京 100083;2.北京市植物园管理处 北京市花卉园艺工程技术研究中心,北京 100093)摘 要:为了探究菊花根状茎形成的分子机制,本研究选取了具有稳定根状茎的菊花株系 2017XS 的根状茎尖、根状茎中部、根状茎下部、叶片、茎段、根系、茎尖、舌状花 8 个部位进行了转录组测序,并利用生物信息学方法对根状茎尖和整个根状茎中高表达的基因进行筛选。转录组测序共得到 159.51 GB 数据,组装后得到 100 235 个 Unigene。其中,64 956(64.80%)个 Unigene在 7 个公共蛋白质数据库中得到了注释。为了找到根状茎发育的关键基因,通过加权基因共表达网络分析(
3、weighted correlation network analysis,WGCNA)、Kmeans 和基于 Venn 筛选差异基因 3 种方式筛选在根状茎尖和根状茎中高表达基因。最终筛选到 20个在根状茎尖中高表达的基因和 36 个在根状茎中高表达的基因。这些基因包括了和植物非生物胁迫相关的基因、脱落酸(abscisic acid,ABA)代谢基因、红光受体和紫外光受体以及光周期核心转录因子,选取 6 个差异表达较显著的基因进行 RTqPCR 荧光定量分析,结果与转录组测序数据一致,验证了转录组的有效性。且这些差异表达基因在同样具根茎的菊花株系2005042中亦表现为在根状茎中特异高表达。
4、综上,菊花根状茎的形成和发育可能受到包括脱落酸在内的植物激素以及光周期等因素的影响,本研究对进一步探究菊花根状茎发育的分子机制提供了重要依据。关键词:根状茎;转录组;内源激素;光周期DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.20230315Transcriptome Analysis of Rhizome Development in Chrysanthemum morifoliumXU Jun1 YE Yuqing1 NIU Yajing2 HUANG He1 ZHANG Mengmeng2(1.School of Landscape Architecture,Be
5、ijing Forestry University,Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation&Molecular Breeding,National Engineering Research Center for Floriculture,Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment,Beijing 100083;2.Beijing Botanical Garden,Beijing Floriculture Engineering
6、Technology Research Centre,Beijing 100093)Abstract:In order to explore the molecular mechanism of chrysanthemum rhizome formation,we performed transcriptome analysis of eight tissues(RH:rhizome apical;RT:middle of rhizome;RB:bottle of rhizome;SA:shoot apical;L:leaf;S:shoot;R:root;F:ray floret)of chr
7、ysanthemum.Approximately 159.51 gigabase(GB)pairedend clean reads were obtained and assembled into 100 235 Unigenes.Among these Unigenes,64 956(64.80%)were annotated in seven public protein databases.In order to find the key genes of rhizome development,the highly expressed genes in the rhizome tip
8、and rhizome were screened by weighted correlation network analysis(WGCNA),Kmeans and screening differential genes based on Venn.Finally,a total of 20 highly expressed genes in the rhizome tip and 36 highly expressed genes in the rhizome were obtained.These genes include a large number of genes relat
9、ed to plant abiotic stress,the ABA metabolic gene.In addition,the phytochrome gene PHYB,the UVB photoreception gene UVR8,and the photoperiod core transcription factors were also uncovered,six differentially expressed genes were selected for RTqPCR analysis,and the results were consistent with RNAseq
10、 data,verifying the validity of 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10232菊花(Chrysanthemum morifolium)是中国传统十大名花之一,有着 3 000 多年的栽培历史,具有极高的观赏和经济价值。在规模化生产中,菊花主要通过由根状茎发育而来的脚芽进行扦插繁殖。根状茎(rhizome)是指植物在地下水平生长的变态 茎,是许多多年生植物的营养器官之一1-2。作为一种繁殖策略和营养器官,根状茎能够帮助植物抵御非生物胁迫,例如,根状茎型多年生禾本科植物草地早熟禾(Poa pratensis)和结缕
11、草(Zoysia japonica),比非根状茎型禾本科植物多年生黑麦草(Lolium perenne)表现出更好的耐旱性3。同时,根状茎能增加植物的宿根性和繁殖能力,在普通水稻(Oryza sativa)中引入长雄野生稻(O.longistaminata)的根状茎性状能培育出一次种植多年采收的多年生水稻4。此外,荷花(Nelumbo nucifera)、生姜(Zingiber officinale)等农作物的根状茎还是其主要的采收器官。有研究表明具有更多根状茎的菊花品种抗寒性更强,根状茎数量是抗寒菊花品种快速筛选的重要指标5。并且菊花根状茎还有助于抵御干旱胁迫,帮助菊花在干旱后更好的恢复6,
12、但相对于在花色、开花期等方面的表型分析和分子调控机制研究7-9,目前对于菊花根状茎形成关键基因的克隆及其功能还少有报道。目前控制高等植物根状茎形成的关键基因尚报道较少,随着转录组测序技术的日趋成熟,该技术被广泛应用到根状茎发育研究当中,在长雄野生稻、拟 高 粱(Sorghum propinquum)、芦 苇(Phragmites australis)、早竹(Phyllostachys praecox)等植物中,通过转录组测序发现了一些可能与根状茎发育相关的基因,包括激素合成和信号传导、光周期响应以及调控分生组织形成相关的基因。植物激素是植物体内产生的在极低浓度下能够产生生理效应的信号分子,参与
13、植物生长发育各个阶段的调控。多种植物的根状茎转录组报道中筛选出了与植物激素合成和信号传导相关的基因,如在荷花根状茎生长发育过程中,赤霉素信号转导基因 Gibberellic Acid Insensitive(GAI)、脱落酸受体基因 Pyrabactin ResistantLike(PYL)和 生 长 素 响 应 因 子 Auxin Response Factor(ARF)在伸长期和膨大期的表达差异显著10,赤霉素合成基因 Gibberellin 20oxidase(GA20ox)的表达量在根状茎发育过程中降低11。此外,对强根状茎草地早熟禾 QH 和弱根状茎草地早熟禾 SN 的根状茎芽、根状
14、茎节和根状茎节间 3个部位分别进行了转录组测序,发现脱落酸受体基因 PYL 和脱落酸信号传导基因 PP2C 在 QH 和 SN 的节中差异表达1。以上研究表明,根状茎的生长发育可能受到赤霉素、脱落酸等多种激素的调控。由于根状茎起源于茎基部的腋生分生组织2,因此分生组织形成相关基因也可能参与控制根状茎的形成。在拟高粱转录组中找到了在根状茎中特异表达的MYB36,该基因在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中控制腋生分生组织的形成12;同时,在早竹根状茎转录组中也筛选到了 REVOLUTA(REV)、CLAVATA1(CLV1)等和分生组织形成有关的基因13。另外,有报道显示,光周期
15、诱导途径关键基因也可能参与根状茎的形成和发育,FT 基因的表达在温代莲和热带莲的根状茎发育过程中下降10。综上,目前的研究对高等植物根状茎的发育过程有了一定了解,但根状茎形成和生长发育的分子基础尚不清楚,诱导根状茎形成的关键基因仍未找到。为了探究菊花根状茎形成的分子机制,筛选可能参与菊花根状茎发育的基因。本研究以能稳定形成根状茎的菊花品种2017XS 为转录组测序材料,选取根状茎尖、根状茎中部、根状茎下部、叶片、茎段、根系、茎尖、舌状花 8 个组织进行转录组测序。通过对测序结果的生物信息学分析,筛选有可能控制根状茎发育的关键基因,并利用 RTqPCR 对其进行表达验证,从而为解析菊花根状茎形成
16、机理,培育具有丰富根状茎、抗逆性强的菊花新品种奠定理论基础。RNAseq data.And these differentially expressed genes were also expressed differentially in the rhizomes of chrysanthemum strain2005042.Taken above together,the formation and development of chrysanthemum rhizomes may be affected by plant hormones including abscisic acid
17、and photoperiod.This study provides important clues to further explore the molecular mechanism of the development of chrysanthemum rhizomes.Keywords:rhizome;transcriptome;endogenous hormones;photoperiod2023,39(10)233徐俊等:菊花根状茎发育的转录组分析1 材料与方法1.1 材料前期通过对大量的菊花种质资源进行筛查,发现2017XS 和2005042两个株系能够稳定形成根状茎,并且数量
18、较多(图 1)。本研究以2017XS为转录组测序材料,为了获取全面的转录组数据并且获得根状茎中差异表达基因,除了根状茎的 3 个部位根状茎尖(RH)、根状茎中部(RT)、根状茎下部(RB)还选取了茎尖(SA)、叶片(L)、茎段(S)、根(R)、舌状花(F)5 个部位进行测序(图 1C)。所有的样品取自无性繁殖的植株,每个部位取 3 次重复。样品用液氮速冻,并储存在 80条件下。以2005042为验证品种,同样取其根状茎尖、根状茎中部、根状茎下部、茎尖、叶片、茎段、根和舌状花 8 个部位,验证转录组测序中获得差异表达基因的表达模式。1.2 方法1.2.1 RNA 提取与文库构建 使用植物RNA快
19、速提取试剂盒(北京华越洋生物科技有限公司)分别提取总 RNA。用带有 Oligo(dT)的磁珠富集 mRNA,加入破碎缓冲液将 mRNA 随机打断,并以 mRNA 为模板,用六碱基随机引物合成第 1 条 cDNA 链,然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合 成 第 2 条 cDNA 链,利 用 AMPure XP beads 纯化 cDNA。纯化的双链 cDNA 再进行末端修复,加 A尾并连接测序接头,然后进行片段大小的选择,最后进行 PCR 扩增。使用 Agilent 2100 生物分析仪和ABI StepOnePlus 实时 PCR 系统对文库
20、进行质检。1.2.2 转录组测序与组装 利用 Illumina HiseqTM 2000 测序平台进行测序。过滤 raw data 中的低质量数据以获得 clean data,随后使用 Trinity 软件14进行从头组装,得到 Unigene 序列。获得的 Unigene序列通过 BLAST15(Evalue 10-5)与 NR、SwissProt、GO、COG、KOG、eggNOG、KEGG 数据库进行比对,使用 KOBAS2.016得到 Unigene 在 KEGG 中的 KEGG Orthology 结果,预测完 Unigene 的氨基酸序列之后使用 HMMER17(Evalue 10
21、-10)软件与Pfam 数据库比对,获得 Unigene 的注释信息。利用clusterProfiler18软件对差异表达基因进行 GO 富集和 KEGG 通路富集分析,并选取 Padj 0.05 的显著富集的 GO 类别和 KEGG 代谢通路。采用 Bowtie19将测序得到的 Reads 与 Unigene库进行比对,根据比对结果,结合 RSEM20进行表达量水平估计。利用 FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)值 表 示 对 应Unigene 的表达丰度。采用 DESeq2 进行样品组间的差异
22、表达分析,以 FDR(False Discovery Rate)0.8 时 power 值最小的数为最佳 power 值。利用WGCNA包的blockwiseModules函数构建共表达矩阵,模块相似度阈值设置为 0.25,合并相似度为 0.8 的模块,模块内最小基因数设置为 30,其他参数按照默认设置23。1.2.4 根状茎高表达基因的筛选 使用 Excel 按照根状茎尖的 FPKM 表达量高于其他组织 3 倍的标准筛选根状茎尖高表达基因,按照根状茎 3 个部位(根状茎尖、根状茎中部、根状茎下部)的 FPKM 表达量均高于其他部位 3 倍的标准筛选根状茎高表达基因24。1.2.5 RTqPC
23、R 验证 根据转录组筛选结果,选取6 个在根状茎中特异表达的基因,在2017XS 和另一个稳定形成根状茎菊花株系2005042的 8 个部位(根状茎尖、根状茎中部、根状茎下部、茎尖、叶片、茎段、根和舌状花)进行基因表达的荧光定量 PCR(RTqPCR)分析,使用 primer premier 5.0设计引物(表 1)。用德国耶拿实时荧光定量 PCR 仪qTOWER 2.2(Analytik Jena,German)进 行 反 应,每个样品重复 3 次,反应体系 20 L。选用 SAND 作为内参基因,用 2-Ct算法计算相对表达量25。2 结果2.1 测序和从头组装为了筛选得到根状茎尖以及整个
24、根状茎中高表达的基因,对来自叶片、茎、根、舌状花、茎尖、根状茎尖、根状茎中部和根状茎下部的 24 个 cDNA 文库使用 Illumina HiSeq 2000 高通量测序平台进行测序。在过滤掉接头序列、不明确和低质量的 reads之后,所有样品总的 clean reads 大约 159.51 GB。使用 Trinity 程序,将所有 clean reads 从头组装成196 467 个转录本,平均长度为 905 bp,N50 长度为1 295 bp。这些转录本进一步组装成 100 235 个 Unigene。Unigene 平均长度为 832 bp,N50 长度为 1 280 bp。在这些
25、Unigene 中,28 114 个(28.05%)大于 1 000 bp,46 596 个(46.48%)小于 500 bp(图 2A)。2.2 根状茎差异基因的功能注释和分类为了对组装的 Unigene 进行注释,对 7 个公共蛋白质/核苷酸数据库进行了 E 值为 10-5的 BLAST搜索,最终获得 64 956(64.80%)个有注释信息的Unigene。其中 3 1951 条(49.19%)在 KOG 中得到注 释,40 653 条(62.47%)在 Pfam 中 得 到 注 释,34 388 条(52.86%)在 Swissprot 中 得 到 注 释,42 639 条(65.64
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