溃疡病的发生对半滑舌鳎体表黏膜菌群结构的影响.pdf

收稿日期：2023-04-22基金项目院天津市海水养殖现代农业产业技术体系创新团队（ITTMRS2022006）作者简介院王祯辉（1980），男，河北唐山人，兽牧师，主要从事海水珍品鱼类养殖研究。溃疡病的发生对半滑舌鳎体表黏膜菌群结构的影响王祯辉1，付建东1，薛淑霞2（1.天津海发珍品实业发展有限公司，天津 300450；2.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387）摘要：溃疡病是危害养殖半滑舌鳎的一种流行性疾病，黏膜菌群在维持鱼体健康中发挥了重要的作用。为了分析溃疡病的发生对半滑舌鳎体表黏膜菌群结构的影响，利用高通量测序技术对体表黏膜菌群 16S rRNA 基因的 V4 高变异区进行测序，分析了健康（MH）、患溃疡病早期（体表散布小的溃疡点）（PMD）和晚期（体表有明显溃疡灶）（MD）的半滑舌鳎体表黏膜菌群结构。结果表明：在 MH、PMD 和 MD 样本中分别鉴定到了 4 036、1 758、1 763 个 OUTs（Operational Taxonomic Units）。在属分类水平上，MH 样品中 Pseudoalteromonas、unidentified_Chloroplast、Blautia 和 Bifidobacterium 丰度较高，而在 PMD 和 MD 样品中，其优势菌群是 Pseudomonas 和 Vibrio。物种注释表明，MH 样品中的细菌菌群结构比 PMD 和 MD 样品中的细菌群落更具多样化。细菌分离结果显示，在 PMD 和 MD 样品中发现了更多潜在的致病菌。综上，在养殖半滑舌鳎溃疡病的发生过程中，鱼体表皮黏膜细菌菌群的丰度、多样性及均一性水平均显著下降。研究结果为阐明半滑舌鳎溃疡病的发生机制提供了新思路。关键词：半滑舌鳎；溃疡病；黏膜菌群中图分类号院S941文献标识码院ADOI 编码院10.3969/j.issn.10066500.2023.S.013Analysis of Mucus Bacterial Communities Associated to Skin Ulcer Disease of Chinese Tongue Soles渊Cynoglossus semilaevis冤WANG Zhenhui1,FU Jiandong1,XUE Shuxia2(1.Tianjin Haifa Zhenpin Industrial Development Company Limited,Tianjin 300450,China;2.College of Life Sciences,Tianjin Nor鄄mal University,Tianjin 300387,China)Abstract:Skin ulcer disease is an epidemic disease affecting cultured Chinese tongue sole,and the mucus bacteria plays an importantrole in maintaining fish health.In order to analyze the relationship of skin mucus bacterial communities and the occurrence of skin ul鄄cer disease,the skin mucus bacterial communities with three typical statuses including healthy(MH),early stage of the disease(hav鄄ing pustules on the skin)(PMD),and late stage of the diseases(having obvious ulcers on the skin)(MD)were analyzed by sequencingthe V4 hypervariable region of the 16S rRNA gene using pyrosequencing technique.The result showed that 4 036,1 758 and 1 763operational taxomonic units(OTUs)were identified in MH,PMD and MD samples,respectively.The genus taxonomic analysis showedthat Pseudoalteromonas,unidentified_Chloroplast,Blautia and Bifidobacterium were more abundant in MH sample whereas in PMDand MD samples were Pseudomonas and Vibrio.In addition,tags annotation showed that the bacterial community in the MH samplewas much more diverse than that in PMD and MD samples.The bacterial isolation results showed that more potential pathogenic bac鄄teria were also found in PMD and MD samples.In conclusion,the abundance,diversity and evenness levels of the mucus bacterialcommunities of the fish are significantly decreased during the development of ulcer disease in cultured Chinese tongue soles.The re鄄sults of the study provides new ideas to elucidate the mechanism of ulcer disease in Chinese tongue soles.Key words:cynoglossus semilaevis;skin ulcer disease;mucus bacterial communities天津农业科学 栽蚤葬灶躁蚤灶 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽圆园23袁29渊S冤院52-56袁62誗畜牧兽医与水产养殖半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）主要分布于我国黄渤海近海海域，是我国重要的海水养殖鱼类1。高密度集约化的养殖模式导致半滑舌鳎病害频发，养殖成活率降低，经济损失严重，制约了半滑舌鳎养殖业的健康可持续发展2。根据已有的研究结果3-5，结合笔者对天津地区养殖半滑舌鳎疾病调查情况，溃疡病被认为是目前危害半滑舌鳎养殖重要的细菌性疾病。溃疡病发病初期，表皮会形成一些小的脓包，然后脓包会进一步发展成较大面积的溃疡灶，造成鱼体死亡。增刊鱼类针对病原体拥有较多的防御机制，其中体表黏膜组织为重要的第一道物理防御屏障6-7。研究表明，鱼类黏膜组织中定植着大量的细菌，一个平衡稳定的细菌群落对维持鱼体健康起了重要的作用8-9。然而，鱼类黏膜菌群结构可能会被多种因素干扰而失去平衡，包括网捕、使用抗生素10、盐度11、遗传12等。目前针对半滑舌鳎黏膜组织中细菌群落结构的研究较少，对于半滑舌鳎黏膜组织中细菌群落结构与溃疡病发生之间的关系还不明晰。本研究利用高通量测序技术分析了健康的、患病初期和患病期的半滑舌鳎体表黏膜菌群结构，阐明了半滑舌鳎黏膜组织中细菌组成与溃疡病发生之间的关系。1材料与方法1.1试验材料半滑舌鳎取自天津市海发珍品实业发展有限公司，从养殖池中随机取 5 尾没有明显疾病症状的半滑舌鳎，平均体质量（243依13）g，设为 MH 组；5 尾体表有脓包的鱼体，平均体质量（225依17）g，设为 PMD组；5 尾体表有明显溃疡灶的鱼体，平均体质量（236依24）g，设为 MD 组（图 1）。将每组鱼放到解剖盘中，用无菌水冲洗其体表。用灭菌的手术刀从鱼体有鳞一侧刮取粘液，放入离心管，-80 益保存。使用DNA 提取试剂盒（Omega Bio-Tek，美国）进行 DNA提取。将 DNA 稀释到 1 ng 滋L-1。1.216SrDNA 文库的构建及高通量测序文库构建参考 Xue 等13的方法进行。PCR 扩增16S rDNA 的高变异区，引物为 515F-806R14，扩增反应体系为 Phusion 高保真 PCR Master Mix（NewEngland Biolabs）。利 用 TruSeq DNA PCR-freeSample Preparation Kit（Illumina，美国）建立测序文库。构 建 好 的 文 库 利 用 Qubit 2.0 Fluorometer（Thermo Scientific）和 Agilent Bioanalyzer 2100 进行质量评估，评估合格的文库在 IlluminaHiSeq2500 平台进行测序。测序由诺禾致源生物科技有限公司完成。1.3数据分析利用 FLASH15等软件对测序数据进行去冗余。使用 UCHIME 算法16将获得的序列与参考数据库进行比对，去除嵌合体序列，最终获得有效序列。利用Uparse17对获得的有效序列进行聚类分析（97%一致性），生成 OTUs。使用 MUSCLE 软件进行多序列比对分析。分别在界、门、纲、目、科和属等分类层次上进行注释。通过 Qiime 软件18计算 Observed species、Chao1、Shannon、Simpson、ACE 和 Goods coverage 指数数值，分析样本中细菌的多样性和复杂性。1.4半滑舌鳎细菌的分离鉴定针对 MH、PMD 和 MD 组的鱼体，用 2216E 平板（天和微生物试剂公司，中国杭州）分别从鱼体体表的脓包（PMD）、溃疡灶（MD），以及肝脏和肾脏中分离细菌。在 28益培养 24h 后，将优势单个菌落接种到新的平板上，进行 16S rDNA 扩增13。PCR 产物进行纯化、测序，通过 BLAST 与 GenBank 数据库进行比对分析。2结果与分析2.1OTUs 分析在 样 品 MH、PMD 和 MD 中 分 别 鉴 定 到 了4 036、1 758、1 763 个 OTUs。Venn 分析显示，3 个样品中共有 902 个 OTUs，而 MH 样品中有 2 369 个特有的 OTUs（图 2）。这表明健康半滑舌鳎鱼体体表的细菌多样性和丰富度显著高于患病鱼体。从Shannon、Simpson、Chao1、ACE、Goodscoverage、observedspecies 和 PD_whole_tree 数据分析中也可以看出，健康鱼体体表菌群的多样性水平更高（表 1）。图 1健康和患溃疡病的半滑舌鳎临床症状MH.健康半滑舌鳎；PMD.患溃疡病初期的半滑舌鳎（箭头示体表脓包）；MD.患溃疡病半滑舌鳎。图 2Venn 图380380385902963802369PMDMDMH王祯辉等：溃疡病的发生对半滑舌鳎体表黏膜菌群结构的影响53天津农业科学第 29 卷项目MHObserved species1 859Shannon4.952Simpson0.812Chao12 621.179ACE2 780.339Goods coverage0.982PD_whole_tree221.510PMDMD9509513.4633.3970.7880.7841 424.4071 491.2591 533.1971 605.9330.9900.989155.362139.3872.2OTUs 注释分析所有的 OTUs 按界、门、纲、目、科和属的分类层次进行注释。在纲分类层面上，MD 和 PMD 样品中，Gammaproteobacteria 分别占 细 菌 总 数 的 92.9%、92.0%；而在 MH 样本中，Gammaproteobacteria 占比72.6%，其次是 Clostridia（3.6%）、Alphaproteobacteria（5.3%）、Chloroplast（1.5%）、unidentified_Actinobacteria（1.7%）、Bacilli(1.8%)和 Betaproteobacteria（1.4%）（图 3-A）。在目分类层面上，MH、PMD 和 MD 样本中，丰度差异最大的是 Alteromonadales（MH 为42.0%、PMD 为 34.7%、MD 为 20.9%）,其 次 为Pseudomonadales（MH 为 11.5%、PMD 为 32.5%、MD为 41.4%），Vibrionales（MH 为 10.1%、PMD 为16.4%、MD 为 17.3%），Clostridiales（MH 为 3.5%、PMD为 0.73%、MD 为 0.76%），unidentified_Chloroplast（MH 为 1.5%、PMD 为 0.027%、MD 为 0.034%），Rhodobacterales（MH 为 2.2%、PMD 为 0.59%、MD为 0.54%），Lactobacillales（MH 为 1.3%、PMD 为0.13%、MD 为 0.17%）（图 3-B）。在科分类水平上，Pseudomonadaceae和 Lachnospiraceae 的丰度在 3 个组中呈现出明显的差异。Pseudomonadaceae 在 MH样本中的占比为 9.9%，而在 PMD 和 MD 样本中的占比分别为 29.3%、38.4%。相反，Lachnospiraceae 在MH 样本中的占比为 2.3%，明显高于 PMD 和 MD 组（分别为 0.29%、0.33%）（图 3-C）。在属分类水平，3个样本中的细菌丰度也存在较大的差异，包括Pseudomonas(MH 为 9.9%、PMD 为 29.3%、MD 为38.4%),Vibrio(MH 为 9.9%、PMD 为 16.4%、MD 为17.2%),unidentified_Chloroplast（MH 为 1.5%、PMD为 0.03%、MD 为 0.03%），Blautia（MH 为 1.1%、PMD为 0.06%、MD 为 0.06%）（图 3-D）。表 1各样品中测序数据多样性分析A.纲分类水平丰度分析；B.目分类水平丰度分析；C.科分类水平丰度分析；D.属分类水平丰度分析。图 3各样品中优势度最高的前 10 种 OTUs 丰度分析2.3黏膜菌群多样性和均一性分析为了进一步分析健康和患溃疡病半滑舌鳎体表菌群的差异，使用稀释曲线和等级丰度曲线来阐释样本中 OTUs 的分布特征14,19，稀释曲线是通过计算代表 OTUs 的随机选择的测序序列数量而绘制（图4）。稀释曲线体现了测序数据的合理性，并间接反映了细菌群落的丰度和多样性水平。MH 样品中的20 797 条序列代表了超过 1 368 个观察到的物种，而在 PMD 和 MD 样品中，这些序列分别代表了667、662 个物种。这表明 MH 样品中细菌的多样性54增刊菌株名称菌株数量/株来源PMDMDPMDMDVibrio harveyi（哈维氏弧菌）611脓包，肝脏溃疡灶，肝脏，肾脏Vibrio alginolyticus（溶藻弧菌）37脓包肝脏，肾脏Vibrio rotiferianus（轮虫弧菌）79脓包，肝脏，肾脏溃疡灶，肝脏，肾脏Vibrio vulnificus（创伤弧菌）77脓包，肝脏溃疡灶，肝脏Vibrio parahaemolyticus（副溶血弧菌）23脓包溃疡灶Vibrio fortis（强壮弧菌）03-肝脏Vibrio shilonii（希洛氏弧菌）34脓包溃疡灶，肝脏Vibrio ponticus（黑海弧菌）12脓包溃疡灶，肝脏Pseudoalteromonas ruthenica（鲁塞尼亚假交替单胞菌）03-肝脏Shewanella algae（海藻施万氏菌）23肝脏肝脏程度更高。根据每个 OUT 的丰度对其进行排序，以OTUs 的丰度为 Y 轴，排序的次序为 X 轴，绘制等级丰度曲线（图 5）。曲线越平坦，表明样品中细菌种类的分布越均一。从图 5 可以看出，与 PMD 和 MD 样品相比，MH 样品的等级丰度曲线显示出更均衡的细菌物种分布。2.4患溃疡病鱼体细菌分离鉴定从患溃疡病的半滑舌鳎体内共分离获得 83 株细菌（表 2），经初步鉴定，这些细菌大部分为弧菌，其中哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）17 株，轮虫弧菌（V.rotiferianus）16 株，创伤弧菌 14 株（V.vulnificus）。从健康的半滑舌鳎体内未分离到潜在致病菌。图 4MH尧PMD 和 MD 样品测序结果的稀释性曲线图 5MH尧PMD 和 MD 样品测序结果的等级丰度曲线表 2从患溃疡病的半滑舌鳎体内分离鉴定的潜在致病菌3讨论与结论半滑舌鳎是我国北方地区重要的海水养殖鱼类，皮肤溃疡病的发生给半滑舌鳎养殖业造成了较大的损失。已有研究表明，从患溃疡病的半滑舌鳎体内分离获得了多种细菌性病原3-5。本研究也从患病鱼体中分离获得了包括哈维氏弧菌、溶藻弧菌和轮虫弧菌在内的多种病原菌，提示该病是由多种病原感染引起的综合性疾病。本研究所采集的样本包括健康的和自然发病的鱼体（包括发病早期和晚期），可以客观地反映溃疡病的发生对鱼体体表黏膜菌群的影响。与陆生动物相比，鱼类体表黏膜与水环境直接接触，体表黏膜中存在一个复杂的动态生态系统20，这个生态系统的稳定对维持鱼体健康发挥了重要的作用。在之前的研究中已经阐明了养殖鱼类溃疡病的发生与养殖水体中细菌菌群之间存在潜在的相关性13。因此，笔者推测养殖半滑舌鳎溃疡病发生与鱼类体表黏膜中细菌菌群结构的转变相关。本研究结果显示，半滑舌鳎体表黏膜中细菌菌群的多样性与溃疡病表现出一定的关联性。与患溃疡病的半滑舌鳎相比，健康鱼体的表皮黏膜菌群丰度更高，更具多样化和均一性。这表明健康鱼体表皮黏膜中丰富、多样、均衡的细菌菌群可能会抑制条件致病菌的繁殖。相反，表皮黏膜中失衡的细菌菌群会使致病菌“有机王祯辉等：溃疡病的发生对半滑舌鳎体表黏膜菌群结构的影响55天津农业科学第 29 卷可乘”，导致溃疡病的发生。本研究中，常见的鱼类致病菌，如假单胞菌和弧菌，在患溃疡病的鱼体体表黏膜中丰度显著增加，增加了半滑舌鳎患病的风险。Gammaproteobacteria 是鱼类表皮黏膜和肠道中的优势菌群21-22。本研究结果表明，在 MH、PMD 和MD 3 个样本中，Gammaproteobacteria 也具有较高的丰度，但是其丰度在 3 个样本中呈现出显著的差异（MH 中 72.6%、PMD 中 92.0%、MD 中 92.9%）。Gammaproteobacteria 包含一些鱼类条件致病菌，如弧菌和假单胞菌。弧菌是海水中的常见细菌，是众所周知的水产养殖动物的致病菌，弧菌的感染和流行会给水产养殖造成灾难性的损失23。假单胞菌也是海水养殖鱼类的重要致病病原24。本研究结果表明，与健康鱼体相比，患溃疡病半滑舌鳎体表黏膜中弧菌和假单胞菌的丰度显著升高。另外，健康鱼体体表黏膜中 Lachnospiraceae 丰度要显著高于患病鱼体。Pince 等25报道，Lachnospiraceae 可以通过竞争性排斥保护鱼类体表角质细胞免受病原体的侵染。患溃疡病半滑舌鳎体表黏膜中 Lachnospiraceae 丰度的降低，减弱了其对半滑舌鳎体表的角质细胞的保护作用，间接增加了病原菌的侵染机会。微生物生态系统的功能和稳定性受到其丰度和均一度的影响26-27。本研究中，健康和患溃疡病半滑舌鳎表皮黏膜中的细菌群落结构存在着明显的差异。健康样本中细菌的 OTUs 数量、shannon 指数、Chao1、ACE 数值都显著高于患病样本。另外，稀释度和等级丰度分析表明，健康鱼体体表黏膜中细菌菌 群 比 患 溃 疡 病 鱼 体 更 具 多 样 性 和 均 一 性。Hillebrand 等28指出，一个多样、均衡的细菌菌群可以为宿主提供更好的保护。由此，笔者可以推测，半滑舌鳎表皮黏膜中细菌菌群结构的显著变化可能是半滑舌鳎溃疡病发生的一个关键因素。表皮黏膜中细菌菌群的结构变化可以作为监测半滑舌鳎溃疡病发生的指标。参考文献院1 葛仑华,江博赟,孙敬锋,等.三种 DNA 提取方法对半滑舌鳎肠道菌群高通量测序结果的影响J.天津农学院学报,2022,29(3):29-35.2 陈君.工厂化循环水养殖半滑舌鳎主要细菌性疾病及其控制D.上海:上海海洋大学,2012.3 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