柯里拉京调控AMPK-自噬信号改善高脂高果糖饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝病.pdf

网络出版时间：网络出版地址：肝脏药理学柯里拉京调控 自噬信号改善高脂高果糖饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝病汪晶莹，杜宏梅，陈明，曹辉，童宁，叶明灯，俞斐 南京中医药大学附属南京医院（南京市第二医院）药学部，江苏 南京 ；安徽医科大学基础医学院药理学教研室，安徽 合肥 ：文献标志码：文章编号：（）中国 图 书 分 类 号：；摘要：目的探究柯里拉京通过调控 自噬信号对高脂高果糖饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝病的影响。方法健康雄性 周龄 小鼠随机分为对照组、模型组和柯里拉京给药组，其中模型组和柯里拉京给药组小鼠于 周龄开始给予高脂高果糖饮食饲养 周，柯里拉京给药组小鼠同时腹腔注射柯里拉京 ，隔天给药 次，连续给药 周，对照组和模型组给予等剂量生理盐水。造模和给药结束后小鼠处死并记录其肝质量，染色、油红 染色、染色观察肝组织病理学特征，试剂盒检测血清和肝脏组织中生化指标，检测肝脏自噬和 水平。结果实验结果发现，模型组小鼠肝质量增加，血清中 、明显升高，肝脏中出现了大量的脂肪空泡和严重的脂质沉积并有轻度的胶原纤维增生，肝脏中 水平明显升高，柯里拉京干预后小鼠肝质量降低，肝脏病理改变得到明显改善，水平降低；结果发现，模型组肝脏中 和 等自噬相关蛋白水平明显降低，水平也明显降低，柯里拉京干预后明显升高 ，并上调自噬水平。结论柯里拉京可以改善高脂高果糖饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝病，其机制可能是通过促进 磷酸化进而上调自噬水平。关键词：高脂高果糖饮食；非酒精性脂肪肝；柯里拉京；自噬开放科学（资源服务）标识码（）：收稿日期：，修回日期：基金项目：国家自然科学基金资助项目（）作者简介：汪晶莹（），女，本科，研究方向：肝脏药理，：；俞斐（），男，本科，主任药师，研究方向：临床药学，通信作者，：非酒精性脂肪肝（，）是指在没有长期饮酒的情况下，肝脏出现大量脂质沉积，并伴随胰岛素抵抗、血脂异常和全身炎症等症状 。目前，已经是全球最常见的肝脏疾病，它可以从慢性肝炎（，）发展肝硬化（，），最终导致肝癌（，）。因其病因复杂，机制尚不清楚，目前缺乏有效的防止措施。目前，治疗 的主要手段在于抑制脂质累积和肝脏损伤，近年来研究发现，自噬可能是治疗 的新靶点，细胞自噬可以通过调节脂质代谢，减少氧化应激，改善肝细胞损伤 。研究发现，自噬可受到磷酸腺苷活化蛋白激酶（，）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（，）等 多 个 信 号 调 控 。是一种丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶，受细胞能量水平调控，是细胞代谢的主要调节因子。的活性主要受细胞内 和 的相对数量调控，通过抑制消耗 的合成代谢过程，促进产生 的分解代谢过程，从而恢复能量平衡。可以通过两种机制有效促进自噬，一方面是 直接磷酸化，另一方面是 负调节 ，而 的抑制同时抑制了细胞合成代谢，并诱导自噬 。大量研究发现，增加肝脏中 活性可预防和改善 发生 。柯里拉京（）是一种水溶性鞣质物质，主要成分提取于龙眼、叶下珠和藏余甘子等中药材中，可抑制 肿瘤病毒逆转录酶的活性，起到抗肿瘤效果 。除此之外，近年来研究发现，对肝脏具有重要保护作用，并且可以通过降低高脂小鼠的血脂、肝脏中脂质水平及脂质代谢来挽救肝脏脂肪变性 。除此之外，有研究报道 可通过改善小鼠的脂质代谢和葡萄糖稳态来预防 。中国药理学通报 ；（）：本课题通过采用高脂高果糖饮食诱导小鼠发生 ，探究 在 小鼠肝脏中对 自噬信号的影响，阐述 对小鼠 的保护作用及其可能的机制。材料与方法 材料 药品与试 剂 （武 汉 天 植 物；纯度 ）购自武汉天植生物技术有限公司。用组织裂解液、蛋白酶抑制剂购自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗 抗体（，）、兔抗 抗体（，）、兔抗 抗体（，）分别购自 公司和 公司；检测剂盒对天门冬氨酸氨基转移酶（）、丙氨酸氨基转移酶（）、总胆固醇（）、三酰甘油（）和低密度脂蛋白胆固醇（）试剂盒（，）均购于南京建成生物公司。实验动物 级 小鼠，周龄，约 ，购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号：（苏），合格证编号：。实验仪器全自动轮转石蜡切片机（，德国莱卡）；组织包埋机（，德国莱卡）；智能组织切片成像分析系统平台（，美国 公司）；电子天平（，上海精密仪器有限公司）；酶标仪（，美国 ）；高速冷冻离心机（，德国 ）；（美国 ）。方法 模型的建立及 预防性给药干预 只雄性 周龄 小鼠，随机分为正常饮食组（）、高脂高果糖饮食组（）和高脂高果糖饮食 柯里拉京组，每组 只小鼠，连续造模 周。正常饮食组给予基础生长饲料，自由饮用清洁级自来水；组给予特制高脂饲料，自由饮用 果葡萄糖浆水；组与 组饮食饮水一致，同时造模期间按 腹腔注射 溶液，隔天注射 次，连续给药 周。本研究中给药方式以及给药剂量均参照已发表文献 。造模和给药结束后，麻醉小鼠，摘眼球取血于高速冷冻离心，取上清；取肝脏组织冻存于 冰箱；多聚甲醛固定、病理检测和蛋白表达检测。血清指标检测使用试剂盒检测血清和肝脏中 、，实验方法按试剂盒（南京建成）说明操作。苏木精 伊红（，）染色、染色取肝脏组织，多聚甲醛溶液固定 ，脱水，石蜡包埋，切片 ，烤片，梯度酒精脱蜡，水化后进行 染色和 染色，染色后常规脱水，透明，干燥，中性树胶封片，显微镜镜检，图像采集分析。油红 染色取肝脏组织，多聚甲醛固定 ，蔗糖梯度脱水，包埋，切片 ，干燥，固定 ，冲洗，油红染液避光浸染 ，蒸馏水洗；酒精分化，蒸馏水洗；苏木精染 ，自来水洗，分化，自来水洗，返蓝，流水冲洗，甘油明胶封片，封片后显微镜镜检，图像采集分析。将收集保存在 冰箱的肝组织使用 裂解液裂解，变性、电泳、转膜、封闭，兔抗一抗抗体 孵育过夜，洗膜 次，山羊抗兔 二抗室温孵育 ，洗膜，显影，软件分析。统计学分析统计数据用珋 表示，两组间比较用 检验，多组之间采用 进行分析统计，采用 软件对结果进行统计作图。结果 对小鼠肝脏形态及质量的影响如 结果显示，相较于正常饮食组，高脂高果糖饮食组的小鼠肝脏体积明显肿大，整体呈黄褐色，表面分布黄白色颗粒状物质，用手触摸颗粒感明显（），模型组小鼠肝质量明显增加（）。给予 处理后，其肝脏形态接近于正常组，肝质量也明显降低（，）。对小鼠血液和肝脏中脂质水平和转氨酶的影响与 组相比较，组小鼠血清中 和 酶活性明显升高，而 能明显降低模型组小鼠血清中 与 酶活性（），但对于肝脏中 和 酶活性 组之间没有明显差异（）。除此之外，可以明显降低 组小鼠肝脏中升高的 水平，但是对于 和 没有明显影响（）。上述结果提示，可明显降低高脂高果糖饮食诱导小鼠 、水平以及肝脏中脂质水平。对小鼠肝脏病理学改变的影响由 中 染色结果可见，组小鼠肝脏组织结构正常，肝细胞大小均匀，排列规则，形态结构清晰，组小鼠肝细胞排列层次紊乱，细胞浆可见大量大小不等的圆形脂肪空泡，而 组中国药理学通报 ；（）（珋 ，）：；：；小鼠肝脏的脂肪空泡明显减少，细胞排列层次较规则，形态结构较清晰。表明 可明显改善高脂高果糖饮食诱导的小鼠肝脏的损伤和肝脏脂肪变性（，）。染色结果可见，被染成蓝色的胶原纤维与被染成红色的细胞质（），组小鼠肝脏组未发现明显的胶原纤维，组小鼠肝脏中出现少量的胶原纤维，并有假小叶形成，组小鼠肝脏胶原纤维明显减少（，）。表明 可改善高脂高果糖饮食诱导的小鼠肝脏中轻度纤维化。上述结果提示，在高脂高果糖诱导的小鼠 中，能够减轻肝脏的损伤，降低肝脂肪变性，延缓纤维化的发生。对小鼠肝脏中脂质沉积水平影响油红 染色显示，组小鼠肝脏中未见橘红色的脂滴，可见清晰地被染成蓝色的细胞核，而 组小鼠肝脏可见大量的橘红色的脂肪沉积，细胞质内出现大量的脂滴，细胞核不明显，组与 组相比较，橘红色脂滴明显减少，细胞核较为清晰（，），说明 明显降低 组小鼠肝脏中脂滴沉积水平，上述结果提示，在高脂高果糖饮食诱导的小鼠 中，能够明显改善 组小鼠肝脏中脂质沉积。对小鼠肝脏自噬水平的影响 结果显示，与 组小鼠相比，组小鼠肝脏组织中 和 等自噬相关蛋白表达水平明显降低，组与 组相比较 和 蛋白表达水平明显升高（，）。上述结果提示 能够上调自噬水平。（珋 ，）：；：；：，；：，：；中国药理学通报 ；（）（珋 ，）：，：；，（珋 ，）：，：，；对小鼠肝脏 水平的影响 结果显示，与 组小鼠相比，组小鼠肝脏中 蛋白表达水平明显降低，组与 组相比较 蛋白表达水平明显增加（，）。上述结果提示，能够促进 磷酸化，从而上调 组小鼠肝脏自噬水平。讨论研究发现，高脂高果糖饮食可导致动脉粥样硬化、高脂血症、脂肪肝等多种代谢系统疾病发生，是研究上述代谢疾病，尤其是肝脏疾病发病机制的较好模型 。本实验采用高脂高果糖饮食诱导 小鼠建立 模型 ，实验结果表明，高脂高果糖饮食造模后小鼠血清中 、明显升高，肝脏组织出现大量脂肪空泡和肝脂肪变性，脂质沉积明显，以及轻度胶原纤维增生，具 有 的 基 本 特 征，提 示 成 功 诱 导 小 鼠 出 现 。本研究通过病理学、分子生物学和药理学的方法探索了 药物是否可以改善小鼠中国药理学通报 ；（）（珋 ，）：；：；及其相关机制。我们的发现总结如下：）处理可明显降低高脂高果糖饮食诱导的小鼠肝脏脂质沉积增多，肝细胞空泡化和脂肪变性，改善肝脏病理损伤；）明显降低肝功能指标 、水平及其肝脏中 脂质水平；）可通过促进 磷酸化，上调自噬水平，改善肝损伤。是一种水溶性鞣质物质，随着人们对鞣质植物的深入研究发现，富含鞣质的植物药对癌症、动脉粥样硬化、中风和缺血性心肌病，都有很好的作用 ，。研究发现，可以通过改善氧化应激来减轻高脂饮食诱导的 小鼠的 疾病 。本研究发现，可以降低高脂高果糖饮食诱导的小鼠血清中 和 水平，明显减少肝脏组织中空泡样脂肪变性、脂质沉积和胶原纤维形成，表明 能很好的改善高脂高果糖饮食所诱导的肝脏的病理损伤。另外，给药处理后，组小鼠 水平明显降低，而 和 水平并无明显改变，表明 可能主要通过调节 水平来改善小鼠肝脏组织脂质沉积，最终达到改善肝脏上述病理损伤的结果。脂质的代谢异常会促使组织分泌大量炎症因子，异常升高的炎症因子会促进自噬，而自噬作为真核生物细胞遭遇各种应激压力时发生的一种基本应答方式，参与细胞的多种生命活动，使细胞在各种应激条件下维持一种动态平衡状态 。自噬主要参与细胞内物质周转的过程，使得细胞内一些损坏的蛋白质或细胞器以及胞内病原体被溶酶体降解，以循环利用，让细胞的正常代谢和功能得以维持，从而维持机体的正常运行。研究发现，自噬可通过调节脂质代谢，减少氧化应激和炎症进而改善肝脏疾病过程中的损伤 。肝脏细胞中富含溶酶体，并具有高水平的代谢应激诱导自噬，肝细胞自噬发生障碍可引起氧化应激和炎症水平的增加，导致肝脏疾病 。本实验结果表明，干预后，组小鼠肝脏中 、的表达水平明显升高，和 是自噬过程中重要相关蛋白，其蛋白表达的高低直接反映细胞自噬水平，实验结果提示，可以增加肝细胞的自噬水平，进而起到保护肝脏作用。此外，干预后，组小鼠肝脏中 水平明显增加，提示 可以通过促性 磷酸化诱导细胞自噬，进而调节小鼠肝脏中脂质代谢，减少肝脏脂质沉积，从而减少脂质过氧化引起的氧化应激和炎症，起到保护肝脏的作用。综上，可能通过调节 途径，增强 组小鼠肝脏自噬水平，降低氧化应激和炎症，减轻肝脏损伤和脂质沉积，进而起到保护肝脏作用。本实验研究将为 用于 临床治疗提供实验依据。参考文献：，：，（）：李相迁，王玮，贾艳红，等 细胞自噬与非酒精性脂肪性肝病 中华肝脏病杂志，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，中国药理学通报 ；（），：，：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：刘国翔，戴平，皇甫梦杰，等 蛇床子素通过 通路诱导 细胞自噬 中国药理学通报，（）：，（）：，（，；，）：，（），：；中国药理学通报 ；（）