巨噬细胞主穹窿蛋白通过促进骨髓间充质干细胞成骨分化调控骨再生.pdf

文章编号（）巨噬细胞主穹窿蛋白通过促进骨髓间充质干细胞成骨分化调控骨再生杨燕，赵娜，马俊青（南京医科大学附属口腔医院正畸科，江苏省口腔疾病研究重点实验室，江苏省口腔转化医学工程研究中心，江苏 南京）摘要 目的：探究骨髓巨噬细胞主穹窿蛋白（）对骨再生修复的影响。方法：在野生型（）小鼠和特异性敲除巨噬细胞（）的小鼠中分别构建胫骨骨皮质缺损模型，通过 扫描与重建技术、苏木素伊红染色观察骨再生情况；体外分离培养 和 小鼠骨髓来源的巨噬细胞，并分别与野生型骨髓间充质干细胞（）共培养，通过碱性磷酸酶染色、成骨分化标记基因实时荧光定量 实验，观察敲除巨噬细胞 对共培养体系中的 成骨向分化的调控作用；通过细胞因子芯片实验检测巨噬细胞细胞因子的分泌。结果：骨缺损第 天，扫描及重建结果显示 小鼠缺损区矿化组织少于 小鼠（）；苏木素伊红染色结果显示 组小鼠缺损区骨痂面积小于 小鼠；与 组巨噬细胞共培养的 的成骨分化标记基因水平显著低于与 组巨噬细胞共培养组（）；敲除 的巨噬细胞分泌更多抑制成骨的细胞因子、。结论：巨噬细胞 可能通过促进 成骨分化进而调控骨再生修复。关键词 主穹窿蛋白；巨噬细胞；骨再生；成骨分化；细胞因子中图分类号 文献标识码 ，（，）：，：（）：（）（），（）（），（），：，（）；，（），：；基金项目：国家自然科学基金（）；江苏省科教能力提升工程 江苏省研究型医院（），江苏省医学创新中心（）通信作者：马俊青，：口腔颌面部骨组织是支撑面部结构的基础，外伤、感染、肿瘤等原因造成的骨缺损不仅损害了颌面部的功能和美观，也造成了患者心理损伤。因此，如何较好地修复骨缺损是口腔医学领域亟待解决的重要问题。骨再生过程中涉及到多种类型的细胞，其中，骨髓间充质干细胞（，）是骨形成的关键细胞，分化为成骨细胞，进一步矿化细胞外基质，形成骨组织。此外，由于骨髓巨噬细胞具有强大的可塑性及旁分泌能力，近年，越来越多的研究聚焦于口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），巨噬细胞在骨再生中发挥的作用。以往研究显示，巨噬细胞可以通过分泌不同的细胞因子，改变骨微环境，进而影响成骨细胞的生成，如巨噬细胞分泌的 趋化因子配体 （，）、肿瘤坏死因子（，）可抑制 成骨分化，而其分泌的骨形态发生蛋白（，）、抑瘤素（，）则可以促进 成骨分化。因此，巨噬细胞有望成为骨再生治疗的新靶点，但巨噬细胞调控 成骨分化的具体途径和深层机制尚不清楚。主穹窿蛋白（，）是穹窿体的主要结构蛋白，由于其在多药耐药性中的重要作用，因此也被称为“肺部耐药性相关蛋白”。在骨髓中高表达于单核细胞系，如单核细胞、巨噬细胞、破骨细胞等，大部分位于细胞质中。除了经典的多药耐药作用外，越来越多的研究表明 参与调控巨噬细胞的细胞因子分泌。例如，抑制小鼠单核巨噬细胞白血病细胞 细胞中细胞凋亡信号调节激酶 氨基末端激酶（，）信号介导的基质金属蛋白酶（，）产生，减少动脉粥样硬化不稳定斑块的形成。还可以抑制腹膜巨噬细胞中的核因子（，）信号，从而减少 的产生，减轻局部炎症。然而，目前还不清楚 是否调控骨髓来源的巨噬细胞的细胞因子分泌，从而调节 成骨分化，在骨再生修复中发挥作用。因此，本研究旨在利用巨噬细胞特异性 敲除小鼠，探索巨噬细胞 在 成骨分化及骨再生修复中的作用。材料与方法 实验动物与试剂 只 级雄性 周龄 野 生 型（，以下简称）小鼠购于上海南方模式生物科技发展有限公司，体质量（）。只 级雄性 周龄巨噬细胞特异性敲除（以下简称）小鼠由南京医科大学江苏省心血管病分子干预重点实验室赠予，体质量（）。所有动物实验均经南京医科大学动物伦理委员会批准（编号）。培养基（，美国），小鼠 培养基、小鼠 成骨诱导培养基（广州赛业），胎牛血清（，）、青链霉素、磷 酸 盐 缓 冲 液（，）、胰蛋白酶（，美国），巨噬细胞集落刺激因子（，）、人细 胞 因 子 固 相 抗 体 芯 片（，美国），红细胞裂解液、苏木素伊红（，）染色试剂盒、碱性磷酸酶（，）染色试剂盒、红细胞裂解液（上海碧云天），小室（，美国），无蛋白快速封闭液（上海雅酶），提取试剂盒、逆转录试剂盒（南京诺唯赞），甘油醛磷酸脱氢酶（，）一抗（，美国），一抗（，英国）。方法 构建小鼠胫骨骨皮质缺损模型 和 小鼠充分麻醉消毒后，切开表面软组织，暴露胫骨骨面，使用牙科慢速手机，用钻头制备直径为 、深 的胫骨骨皮质缺损，钻磨同时以生理盐水冲洗，防止温度过高损伤局部软硬组织，生理盐水冲洗伤口，逐层对位缝合后重新放入鼠笼。小鼠胫骨 扫描和 染色术后第 天，脱颈处死小鼠，分离胫骨，多聚甲醛固定过夜，在 、条件下行小鼠胫骨组织 扫描，并用 软件行三维重建，观察缺损区的骨痂形成情况。胫骨 多聚甲醛固定过夜，常规脱钙 周后，进行组织脱水和石蜡包埋，厚度切片。根据 染色试剂盒说明书进行染色，并在正置显微镜下进行观察和拍摄。小鼠骨髓巨噬细胞的提取和培养分别脱颈处死、小鼠后剥离软组织，收集胫骨和股骨，置于含双抗的 中，转移至超净台。使用无菌眼科剪剪去长骨两端，用含 培养基的注射器针头冲洗髓腔，经 目滤网过滤后收集滤液于离心管内，离心 ，弃上清液。加入红细胞裂解液，吹打混匀后静置 ，离心 ，收集细胞沉淀，用含有 和 的 培养基重悬细胞，以 个 孔接种于 孔板，每 换液 次，诱导分化 ，即得到成熟的巨噬细胞。小鼠 的提取和培养 小鼠脱颈处死后以 同样方法收集长骨，改用含有小鼠 培养基的注射器针头冲洗髓腔，经 目滤网过滤后收集滤液，以 个皿接种于中皿，每 换液 次。杨燕，等巨噬细胞主穹窿蛋白通过促进骨髓间充质干细胞成骨分化调控骨再生 共培养体系为明确巨噬细胞 对 成骨分化的间接调控作用，采用共培养小室，分别将 或 小鼠骨髓来源的巨噬细胞与 小鼠来源的 以 的比例种在 孔板 小室的上室及下室，加入成骨诱导培养基，诱导 ，分组为：无共培养的 为对照组，与 巨噬细胞共培养的 为 组，与 巨噬细胞共培养的 为 组。染色多聚甲醛固定 中各组 ，按照 染色试剂盒说明书配制染液，常温、避光染色 ，随后吸弃染料，用倒置显微镜进行观察和拍摄。实时荧光定量 实验提取 中 各 组 总，逆 转 为。对成骨分化标记基因 相关转录因子（，）、型胶原蛋白（，）、骨钙素（，）及内参基因 肌动蛋白（）进行检测（引物序列见表）。采用 法计算并分析目的基因相对表达量。表 引物序列 基因名称引物序列（）：细胞因子芯片检测收集体外培养的 和 小鼠骨髓来源的巨噬细胞的细胞培养上清液后，按照小鼠细胞因子 固相抗体芯片试剂盒说明进行孵育，显色。统计学分析用 软件进行分析，采用独立样本 检验比较，以 为差异具有统计学意义。结 果 小鼠骨再生修复能力减弱通过 对缺损区域进行扫描分析显示，小鼠胫骨骨皮质缺损模型建立 后，小鼠骨缺损区域形成的矿化组织少于 小鼠。进一步三维重建分析显示小鼠骨缺损区域的骨体积 组织体积（，）分 别 为（）和（），组的骨再生能力强于 组（，图、）。染色结果显示，小鼠缺损区域的骨痂少于 小鼠（图、）。、：分别为 小鼠和 小鼠胫骨骨皮质缺损术后缺损处 扫描图；、：分别为 小鼠和 小鼠胫骨骨皮质缺损术后缺损处 染色（）；虚线圆圈所示为骨缺损区域。图 巨噬细胞 对骨再生修复的影响 口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），巨噬细胞 促进 成骨分化成骨诱导 后，的 染色结果显示，组染色强度低于 组（图）。实时荧光定量 结果同样表明，与 组相比，组的 其成骨分化标志基因、的表达显著降低（，图）。调控巨噬细胞成骨分化细胞因子的分泌根据细胞因子芯片检测结果，对变化的细胞因子进行热图分析，热图结果显示，与 组相比，组巨噬细胞分泌更多、（图）。：染色（）；：成骨分化标志基因表达情况，：与 组相比，。图 巨噬细胞 对 成骨分化的影响 绿色：低表达值；红色：高表达值。图 巨噬细胞 对细胞因子分泌的影响 讨 论 是穹窿复合体的主要结构蛋白，在肿瘤细胞中参与核质转运、细胞增殖与凋亡、信号转导等过程。然而，目前尚无 对骨髓巨噬细胞功能的相关研究报道。本研究首次揭示了 与骨髓巨噬细胞分泌功能的联系，通过体外实验，表明巨噬细胞敲除 后导致促炎因子 等上调。以往研究表明，能够作为脂肪组织巨噬细胞中的炎症“守门员”，抑制 信号通路，减少促炎细胞因子 的产生。能够抑制巨噬细胞 信号通路，减少 的产生。这些研究佐证了我们的结论，表明 在巨噬细胞中具有抑炎功能。巨噬细胞在骨缺损修复中的作用依赖于其强大的旁分泌能力，调控 成骨分化。传统的研究巨噬细胞对 成骨分化作用的方法，是使用含有巨噬细胞培养上清液的条件培养基，但这种方法忽略了细胞间的复杂通讯，因而近年来逐渐被共培养体系所替代。研究报道，巨噬细胞在体外共培养体系中能够促进 成骨分化。本课题在共培养体系中，对 进行成骨诱导，结果与文献结论一致，表明巨噬细胞促进 成骨分化，而 的缺失损害了这种促成骨能力。鉴于这种调控作用是由可溶性因子所介导的，我们通过细胞因子芯片，检测 敲除后巨噬细胞中分泌发生改变的细胞因子，结果显示抑制成骨分化的细胞因子如、分泌增多，这一发现与以往文献报道的缺乏 导致巨噬细胞、等炎症因子表达上调的现象一致。巨噬细胞根据表面标志物和功能特征分为 型（促炎型）和 型（促组织修复型）两种极化表型，型分泌更多的促炎细胞因子如、，而 型巨噬细胞则更多地分泌促进组织修复的细胞因子如，这一发现提示 可能参与对巨噬细胞极化的调控，值得进一步探究。除了能够抑制 成骨分化，也能通过激活破骨前体细胞中的胞外信号调控激酶（，）信号通路，促进破骨分化和成熟，加重骨吸收，这可能是 组小鼠骨再生受损的另一个原因。值得一提的是，在骨缺损修复的最后重塑阶段，破骨细胞通过去除暂时性的硬骨痂 编织骨，将骨重塑为解剖学上成熟的板层骨，从而参与骨修复过程。由于巨噬细胞与破骨细胞的谱系关系密切杨燕，等巨噬细胞主穹窿蛋白通过促进骨髓间充质干细胞成骨分化调控骨再生（破骨细胞来源于髓系单核 巨噬细胞谱系），因此，巨噬细胞中的 敲除可能会直接影响破骨细胞功能。事实上，本课题组前期研究已经证实，通过钙调磷酸酶活化 细胞核因子（，）通路抑制破骨细胞分化，在骨质疏松进展中发挥负性调节作用。这提示巨噬细胞中的 可能通过促进骨形成、抑制骨吸收双重途径，在骨缺损修复过程中发挥正向调节作用。综上，巨噬细胞 可以有效抑制 等抑成骨细胞因子的分泌，促进 成骨分化和骨再生。本研究为今后骨折愈合提供新的治疗思路和有效靶点。但巨噬细胞内信号通路十分复杂，通过何种机制调节这些细胞因子分泌仍需进一步研究。参 考 文 献 ，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：，：，（），（）：，（）：，（）：，（），（）：（收稿日期：）（本文编辑：钟旖）口腔生物医学 年 月（第 卷第 期），