咖啡酸分子烙印聚合物的制备及其在金银花抗炎作用评价中的应用研究.pdf
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1、Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med咖啡酸分子烙印聚合物的制备及其在金银花抗炎作用评价中的应用研究陈腾飞1,古江勇2,高云航1,宋玲1,李晗1,侯红平1,彭博1,徐筱杰3,叶祖光1,张广平1*1.中国中医科学院 中药研究所,北京 100700;2.广州中医药大学 基础医学院,广东 广州 510006;3.北京大学 化学与分子工程学院,北京 100871摘要 目的:制备咖啡酸分子烙印聚合物(MIP)并特异性地去除金银花提取物中的咖啡酸,考察咖啡酸去除前后金银花提取物抑制前列腺素 E2(PGE2)释放的变化,从整
2、体上评价其抗炎活性。方法:采用溶胶-凝胶法,以粒径为 62105 m 的二氧化硅微珠为载体、咖啡酸为模板分子、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷为功能单体、四乙氧基硅烷为交联剂、四氢呋喃为溶剂,合成了咖啡酸 MIP。以此 MIP 作为液相色谱固定相,以甲醇-乙酸(5001 和 91)为流动相,特异性去除了金银花提取物中的咖啡酸。通过脂多糖刺激巨噬细胞 RAW264.7 释放 PGE2实验评价去除咖啡酸前后金银花提取物的抗炎作用。结果:溶胶-凝胶法制备的咖啡酸 MIP 能够从复杂体系中特异性地分离和富集微量的咖啡酸,对咖啡酸的容量因子和烙印效率分别为 15.8 和 9.7,最终从金银花提取物 2.6 g
3、 中分离了咖啡酸146 g,纯度为 92%,回收率为 89%。金银花提取物和去除咖啡酸的提取物在质量浓度为 100、200、400 g mL1时对脂多糖诱导的 RAW264.7 细胞释放 PGE2的抑制率分别为 5.8%、35.6%、62.5%和 5.4%、13.3%、57.5%,去除微量咖啡酸以后的提取物在 3 个质量浓度时的抑制率较金银花提取物均有所降低。结论:咖啡酸是金银花提取物抗炎活性的一个重要成分,咖啡酸分子烙印聚合物可以实现金银花提取物中微量咖啡酸的特异性分离,分子烙印技术能够在保证中药完整性的前提下评价中药的药理活性。关键词 分子烙印聚合物;金银花;前列腺素E2;咖啡酸;液相色谱
4、中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 1673-4890(2023)08-1738-07 doi:10.13313/j.issn.16734890.20230214002Preparation of Caffeic Acid Molecular Imprinted Polymer and Its Application in Evaluation of Anti-inflammatory Effect of Lonicerae Japonicae FlosCHEN Teng-fei1,GU Jiang-yong2,GAO Yun-hang1,SONG Ling1,LI Han1,HO
5、U Hong-ping1,PENG Bo1,XU Xiao-jie3,YE Zu-guang1,ZHANG Guang-ping1*1.Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;2.School of Basic Medical Science,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China;3.College of Chemistry and Molecula
6、r Engineering,Peking University,Beijing 100871,ChinaAbstract Objective:To prepare a molecularly imprinted polymer(MIP),specifically remove caffeic acid(CA)from Lonicerae Japonicae Flos extract,investigate the inhibitory effect on the release of prostaglandin E2(PGE2)of Lonicerae Japonicae Flos extra
7、ct before and after CA removal,and evaluate its anti-inflammatory activity on the whole.Methods:CA MIP had been prepared through the sol-gel coating method by using CA,silica beads(62-105 m),tetrahydrofuran,3-aminopropyltriethoxysilane,and tetraethoxysilane as a template,supporting matrix,solvent,fu
8、nctional monomer,and cross-linker,respectively.The specific separation of CA from Lonicerae Japonicae Flos extract was achieved by using this MIP as the liquid chromatographic stationary phase with methanol-acetic acid(500:1 and 9:1)as the mobile phase.The release of PGE2 from RAW264.7 cells stimula
9、ted by lipopolysaccharide(LPS)was investigated to evaluate the 基础研究 基金项目 国家重点研发计划项目(2018YFC1708200,2018YFC1708204);内蒙古自治区科技重大专项(2019ZD004)*通信作者 张广平,研究员,研究方向:中药药理毒理;Tel:010-64031832,E-mail:1738Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Medanti-inflammatory effects of the extract before
10、 and after CA was removed.Results:The CA MIP prepared by the sol-gel method could specifically separate and enrich small amounts of CA from complex systems.The capacity factor and imprinted factor for CA were 15.8 and 9.7,respectively.Finally,146 g CA was separated from the extract of Lonicerae Japo
11、nicae Flos of 2.6 g,and the purity and recovery of CA were 92%and 89%.The inhibition rate of PGE2 release of Lonicera Japonica Flos extracts and the extracts without CA in 100,200,and 400 g mL1 were 5.8%,35.6%,and 62.5%,as well as 5.4%,13.3%,and 57.5%,respectively.After the removal of trace CA from
12、the extract of Lonicerae Japonicae Flos,the inhibition rate of PGE2 production was reduced.Conclusion:CA is an important component of the anti-inflammatory activity of Lonicerae Japonicae Flos extract.The MIP can achieve the specific separation of trace CA in Lonicerae Japonicae Flos extract.The mol
13、ecular imprinting technology can evaluate the pharmacological activity of traditional Chinese medicine on the premise of ensuring the integrity of traditional Chinese medicine.Keywords molecularly imprinted polymer;Lonicerae Japonicae Flos;PGE2;caffeic acid;liquid chromatography分子烙印聚合物(MIP)也称为分子印迹聚合
14、物,是通过模板分子与功能单体的共聚作用合成能够与模板分子特异性结合的一种有特定空间构型的高分子聚合物1-2,具有识别性好、特异性高、物理和化学性质稳定的特点3,可应用于生物传感器4、化合物的手性分离5、催化6、固相萃取7-8及样品中微量成分的分析9-10等多个领域。传统的MIP制备是采用本体聚合、沉降聚合等方法,将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂混合后,通过光或热来引发聚合3,对合成条件要求较严格,制备过程也会消耗大量的模板分子,由于制备条件的限制,难以应用于大规模样品的制备与分离。表面烙印法为解决这一问题提供了方法。表面烙印法是将模板分子和功能单体通过预组装形成的复合物接枝到二氧化硅、聚苯
15、乙烯等材料的表面,再由交联剂将其固定的一种方法11。这种聚合物制备过程消耗的模板分子较传统的方法少,且能在载体的表面形成一层与模板分子特异结合的薄膜,使模板分子与结合位点的吸附-解吸作用更为快速12-15。本课题组自2001年将分子烙印技术应用于中药活性成分的分离以来16,采用 MIP 相继从不同中药材中分离到了微量活性成分17-18。金银花(Lonicerae Japonicae Flos)别名双花、忍冬花等,为忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花,具有清热解毒、疏散风热之功效19。其化学成分主要包括咖啡酸(CA)等有机酸20、环烯醚萜苷21
16、、黄酮20,22等类成分。有机酸类作为金银花的一类主要活性成分,在其抗炎活性中发挥着重要的作用。有报道表明 CA具有抗炎的活性23-24,其衍生物也具有抗氧化和抗炎的活性25-26。但是中药作为一个复杂的体系,其药理活性不能简单以含有的1个或者多个单体成分进行评价。因此,本研究以金银花为研究对象,以金银花中抗炎活性较强的CA为模板分子,采用溶胶-凝胶法,制备了CA MIP,以此聚合物作为液相色谱的固定相,在保证金银花提取物完整性的前提下,从中去除了微量的CA,并通过脂多糖(LPS)诱导小鼠 单 核 巨 噬 细 胞 RAW264.7 释 放 前 列 腺 素 E2(PGE2)的实验评价去除CA前后
17、金银花提取物的抗炎活性,为中药的药理活性和作用机制研究提供新的思路和方法。1材料1.1细胞RAW264.7细胞由中国医学科学院提供。1.2样品金银花药材购于北京同仁堂药店有限责任公司,经中国中医科学院中药研究所张广平研究员鉴定为忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。1.3试药CA(纯度:98%,用于制备MIP,南京泽朗医药科技有限公司);对照品 CA(批号:110885-201703,纯度:99.7%)、绿原酸(CGA,批号:110753-201817,纯度:96.87%)均购于中国食品药品检定研究院;62105 m二氧化硅微珠(使用前经 2.
18、0 mol L1的盐酸水溶液于 60 活化 6 h)、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTS)均购于阿法埃莎(天津)化学有限公司;四乙氧基硅烷(TEOS,北京百灵威科技有限公司);实验所用其他试剂为分析纯或色谱纯;胎牛血清(批号:111030,浙江天杭1739Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med生 物 科 技 有 限 公 司);DMEM 培 养 基(批 号:8112037,美国Fisher公司);LPS(南京百康生物科技有限公司);PGE2检测试剂盒(批号:03121212,美国Enzo Life Scienc
19、e公司)。1.4仪器与耗材UV-2550 型 紫 外-可 见 分 光 光 度 计(日 本Shimadzu 公司);分析与半制备高效液相色谱仪(由322型泵和152UV/Vis型检测器组成,北京吉尔森科技有限公司);HP 1100型高效液相色谱仪(美国 Agilent 公司);3111 型 CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司);XDS-1B型倒置显微镜(江苏科学仪器有限公司);500目筛(上海丰行筛网制造有限公司);0.46 m注射器过滤器和不锈钢空柱(50 mm4.6 mm)均购于北京迪马科技有限公司;不锈钢空柱(100 mm10.0 mm,大连依利特分
20、析仪器有限公司)。2方法2.1CA MIP 的合成及高效液相色谱法(HPLC)评价以 CA 为模板分子、APTS 为功能单体、TEOS为交联剂,采用溶胶-凝胶法制备MIP。MIP的制备方法:取 CA 0.2 mmol 溶于四氢呋喃 7 mL,加入APTS 2.4 mmol,室温磁力搅拌2 h,加入已活化的62105 m 的二氧化硅微珠 3.5 g,继续搅拌 2 h,再加入TEOS 6 mmol,继续搅拌1 h,加入1 mol L1的乙酸水溶液 1 mL,搅拌 18 h 完成反应。反应完成后聚合物用甲醇冲洗2次,抽滤,70 烘干。过500目筛去除小颗粒后,用甲醇-乙酸(91)搅拌冲洗,以除去模板
21、分子,最后用甲醇冲洗,抽滤后,70 烘干即得。空白烙印聚合物(NIP)的制备方法除不加入模板分子外,其余步骤同 MIP制备。将 一 定 量 的 MIP 或 NIP 填 入 不 锈 钢 空 柱(50 mm4.6 mm),将装好的色谱柱连接到高效液相色谱仪上,先后用甲醇-乙酸(91)、甲醇冲洗至基线平稳。用丙酮测定死时间,每次进样5 L,丙酮检测波长为 254 nm;5 mmol L1 CA 和 5 mmol L1 CGA每次进样20 L,检测波长为324 nm;流速为0.60 mL min1,流动相为甲醇-乙酸(5001)和甲醇-乙酸(91)。容量因子(k)和烙印效率(IF)分别按照公式(1)和
22、公式(2)计算。k(tRt0)/t0(1)IFkMIP/kNIP(2)式中,tR为样品的保留时间(min),t0为死时间(min);kMIP和kNIP分别为MIP和NIP的容量因子。2.2金银花提取物中CA的分离取金银花药材粉碎成粗粉,取粗粉50 g,称定质量,置1000 mL圆底烧瓶中,用75%乙醇回流提取3次,每次600 mL,提取30 min27,合并提取液,滤过浓缩后,冷冻干燥,得金银花提取物。取金银花提取物4.0 g,加50%甲醇20 mL超声处理30 min,经0.46 m过滤器滤过,得0.20 g mL1的金银花提取物溶液。将CA MIP填充到不锈钢空柱(100 mm10.0 m
23、m)中,连接高效液相色谱仪,先后用甲醇-乙酸(91)、甲醇洗柱到基线平稳。上样前,用甲醇-乙酸(5001)平衡,流速为 2.4 mL min1,检测波长为 324 nm,样品为上述金银花提取物溶液,每次进样1 mL,进样后,先用甲醇-乙酸(5001)洗脱50 min,再用甲醇-乙酸(91)洗脱,分别收集洗脱液,减压回收有机溶剂后,冷冻干燥。按公式(3)计算CA的回收率(R)。RMCA/(VC0Q)100%(3)式中,MCA为金银花中分离到CA的质量(mg);V为金银花提取物溶液的进样总体积(mL);C0为金银花提取物溶液的质量浓度(g mL1);Q为金银花提取物中CA的质量分数(mg g1)。
24、2.3提取物指纹图谱及CGA、CA含量测定2.3.1色谱条件Phenomenex Luna C18(2)色谱柱(250 mm4.6 mm,5 m),流速为1.0 mL min1,检测波长为 324 nm;流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(020 min,12%30%A;2060 min,30%50%A),进样体积10 L28。2.3.2对照品储备液配制取 CA、CGA 对照品,精密称定,置10 mL量瓶中,加适量的50%甲醇溶解后定容至刻度,配制成CA和CGA质量浓度分别为200、800 g mL1的混合对照品储备液。2.3.3供试品溶液制备取金银花提取物、去除CA的金银
25、花提取物、金银花提取物中分离的 CA,精密称定,用 50%甲醇 10 mL 超声提取后测定 CA含量,用 50%甲醇 100 mL 超声提取后测定 CGA1740Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med含量。2.3.4方法学考察取CA和CGA质量浓度分别为200、800 g mL1的混合对照品储备液,用50%甲醇依次稀释成 CA 质量浓度分别为 100.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 g mL1,CGA质量浓度分别为400、160、80、40、20、10 g mL1的系列混合标准曲线溶液,各精密
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