人类免疫缺陷病毒(I型)HIV-RNA核酸定量检测SOP.doc
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1、 . 人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测系统标准操作程序1. 目的:规范超敏PCR仪器配置系统及人类免疫缺陷病毒(HIV-I RNA)的检测过程,确保检测结果的准确性和重复性。2. 检测方法和原理2.1 检测方法:TaqMan探针荧光定量PCR法。2.2 检测原理:人类免疫缺陷病毒(I型)核算定量检测试剂盒(PCR-荧光法)采用核酸扩增技术,定量检测人血浆中HIV-I RNA。该方法包括三个主要步骤:(1)样品制备以分离HIV-I RNA;(2)靶RNA的逆转录形成互补DNA(cDNA);(3)靶(cDNA)的PCR扩增以及裂解的、靶特异性的、双标记寡核苷酸探针的检测。3. 标本要求3.1
2、标本类型:血浆(EDTA抗凝)。3.2 标本的采集与处理3.2.1 标本采集量:采集患者静脉血6 mL(EDTA抗凝真空采血管)。3.2.2 标本处理:标本采集后应在2小时内送至实验室,实验室收到标本后在1小时内处理标本。3.2.2.1签收:门诊、住院以及CDC标本签收条码,并做好相关登记工作。 3.2.2.2编号:对标本进行唯一编号,内容如下:“年月日6位数字+标本号3位数字”,例如2018年1月1日收到一个HIV-RNA标本即编号为:“180101401”。3.2.2.3离心:800-1600g,20min离心标本。3.2.2.4标本保存:血浆在室温(25-30)最多存储1天;2-8最多存
3、储6天;-20-80可存储6周。将待检血浆以2管每管1200 uL量存储于2.0mL戴螺旋盖的无菌聚丙烯管,在管壁编写如3.2.2.2的编号。未检标本放置于专用样本盒中,冻存于-80 冰箱。已检血浆置-80C冰箱保存2个月,到期后按科室有关程序作废弃标本处理。4.仪器和试剂4.2 试剂:(配套封闭试剂)4.2.1 试剂盒(包含核酸提取试剂、质控品及阳性定量参考品组分、PCR 检测试剂组分)保存于2-8环境下,有效期22个月。4.2.3试剂开瓶后,在室温条件下放置时间不应超过72小时;2-8条件下不超过30天。4.2.4 主要组成成份:组份名称规格数量质控品阴性质控品1000L/管1临界阳性质控
4、品1000L/管1强阳性质控品1000L/管1HIV2CS148测试1HIV2CS248测试1HIV2CS348测试1HIV2CS448测试15.标准操作5.1 COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48 的配置如下:配置实验所需的架子和耗材相应位置COBAS AmpliPrep_COBASTaqMan 48a. K-tubes放在样本架上b. 带有K-tips 的K-tip 架c 将带有样本或质控的S-tubes 放在样本架上d. 带有SPUs 的SPU-架e. CS1放在一个试剂架f. CS2, CS3, CS4放在一个试剂架g. 将空的K-carrier 放在 K-c
5、arrier 架上样本核酸提取完成后:K-carrier上的K-tubes 手工转移 F-HM-PF-HJ-LAB-EM-P(M-P)6.2. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48上使用试剂及耗材的保存及注意事项:1). 所有试剂(HIV-I test试剂)2-8保存,即拿即用;2). 试剂启用后,可保存28 days (2-8);3). 试剂启用后,在Cobas Ampliprep上累计使用时间最多64 hrs;4). CTM(-)阴性质控、L(+)弱阳性质控、 H(+)强阳性质控,使用后的废弃;5). 洗液2-30保存,打开后可使用28 days;6). 耗材(S
6、-tube/样本条码/K-tip/K-tube/SPU)常温保存。6.3. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48上使用样本的保存及注意事项:1). 需要的样本为血浆;2). 血样在225 下运输,24hrs内 (HIV RNA)收集出血浆(室温800-1600g离心 20分钟);3). HIV RNA检测:血浆可在室温下(25-30)保存最多1天,在28最多保存6天,或者-20-80下长期保存,至少6周;4). 血浆建议倒取1100-1200 L进行保存;5). 血浆冷冻时,最多冻融5次不损失HIV RNA。6.4. COBAS AmpliPrep_COBAS Taq
7、Man 48 HBV DNA定量检测操作流程:A仪器初始化及维护A1 打开COBAS AmpliPrep 和 COBAS TaqMan 开关,等待仪器初始化完成,为 stand-by 状态A2登陆电脑及 AMPLILINK 软件登陆Windows XP操作系统( User ID 和 password)a) 双击桌面上AMPLILINK 软件图标b) 登陆AMPLILINK 软件( User ID 和 password)A3通过软件Status界面检查洗液量是否足够,如不够需要更换新的洗液A4检查软件维护界面Due 按钮下列出的需要进行的维护内容,按照维护手册进行相应内容的维护工作 ,COBAS
8、 AmpliPrep 仪器自动进行系统初始化工作B加载试剂将所有试验需要的试剂匣从 2-8C 冰箱拿出,立即放在试剂架上并放入 COBAS AmpliPrep 仪器中,试验开始前在仪器上平衡至少30分钟。不要将试剂匣放在仪器外进行温度平衡,以免在试剂匣表面形成水凝结,造成条码的损坏。如果在试剂匣表面有水凝结,不要对条码部位进行擦拭,以免损坏条码造成仪器无法对条码进行辨识。B1将CS1 试剂匣放在一个试剂架上,将试剂匣 CS2, CS3 和CS4 放于另一个试剂架上B2将放有CS1的试剂架放入到COBAS AmpliPrep 仪器中的A位置B3将放有CS2, CS3 和 CS4的试剂架放入到CO
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