抗菌肽Cathelicidin-1真核表达及发酵液抑菌活性鉴定.pdf
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1、全健康DOI:10.15886/ki.rdswxb.20230010主持人:韩谦、刘萌萌抗菌肽 Cathelicidin-1 真核表达及发酵液抑菌活性鉴定李飞航,武浩恒,李宏,李娟娟,马香,唐燕琼,刘柱(海南大学生命科学学院,海口570228)摘要:为了获得体外表达的高活性抗菌肽,通过分子克隆技术构建了抗菌肽 Cathelicidin-1 重组载体,在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115 中表达,并鉴定包含该抗菌肽的发酵液的抑菌活性。通过 DNA 全合成技术合成编码抗菌肽 Cathelicidin-1 的全长基因,采用 PCR 技术扩增靶标基因并与真核表达载体 pGAPZA 连
2、接,获得重组质粒 pGAPZA-Cathelicidin-1;将重组质粒转化至大肠杆菌 DH5 中扩增,提取质粒并经单酶切处理后转化毕赤酵母 GS115;使用 YPD 培养基培养酵母,72h 后收集发酵液,通过 Tricine-SDS-PAGE 检测抗菌肽表达,并通过抑菌圈与抑菌曲线测定鉴定发酵液的抑菌活性。结果表明,抗菌肽 Cathelicidin-1 以分泌肽形式表达于发酵液中,并且该发酵液能够显著抑制大肠杆菌(Escherichia coli)的生长,而对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)则无明显抑菌效果。关键词:抗菌肽;真核表达;发酵液;抑菌效果中图分类号:Q
3、78;TQ920.1文献标志码:A文章编号:16747054(2023)05047407李飞航,武浩恒,李宏,等.抗菌肽 Cathelicidin-1 真核表达及发酵液抑菌活性鉴定 J.热带生物学报,2023,14(5):474480.doi:10.15886/ki.rdswxb.20230010抗菌肽(antimicrobialpeptides,AMPs)也称抗微生物肽和宿主防御肽,是一类具有抗菌活性的小分子量多肽,一般由 2050 个氨基酸组成,具有净正电荷,广泛存在于各类植物、动物、真菌、细菌以及人体中13。依据来源的不同,可将抗菌肽划分为动物抗菌肽、微生物抗菌肽及人造抗菌肽等4。抗菌肽
4、参与多种生物学功能,比如免疫调节、血管生成、伤口愈合、抗炎活性和抗肿瘤活性。随着对抗菌肽研究的不断深入,人们发现与传统抗生素相比,抗菌肽会作用于病原菌细胞膜,通过物理方式使病原菌死亡,因而不易使病原菌产生耐药性,其作为抗生素的替代药物具有巨大发展潜力56。相关研究表明,抗菌肽在临床试验中已取得成功,但受限于其来源,难以投入实际应用7。Cathelicidin-1 是 2006 年从鸡(Gallusdomesticus)中分离鉴定出来的一种抗菌肽,由26 个 氨 基 酸 组 成,一 级 结 构 为 NH2-RVKRVWPLVIRTVIAGYNLYRAIKKK-COOH,其具有广谱抑菌活性,能有效
5、抑制单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、淋球菌(Neisseriagonorrhoeae)和大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌的生长89。目前,对于该抗菌肽,获取途径仍局限于天然提取和化学合成,成本高昂,而通过基因工程技术构建工程菌株可以高效、低廉、大量生产抗菌肽。因此,笔者拟通过分子克隆技术构建抗菌肽 Cathelicidin-1 重组载体,在毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115 中表达,并鉴定包含该抗菌肽的发酵液的抑菌活性,旨在获得体外表达的高活性抗菌肽,为纯化抗菌肽Cathelicidin-1、研究其作用机制及实际应用奠
6、定基础。收稿日期:20230209修回日期:20230320基金项目:海南省重点研发计划项目(ZDYF2021XDNY181)第一作者:李飞航(1998),男,海南大学生命科学学院 2020 级研究生.E-mail:通信作者:唐燕琼(1968),女,教授,博士生导师.研究方向:遗传学及生物防控.E-mail:第14卷第5期热带生物学报Vol.14No.52023年9月JOURNALOFTROPICALBIOLOGYSep.20231材料与方法1.1实验材料本研究使用的菌株与质粒见表 1。表1实验材料及来源实验材料相关属性来源菌株StrainsE.coliDH5野生型,用于质粒克隆实验室保存P.
7、pastorisGS115野生型,用于表达外源蛋白实验室保存E.coliK88野生型,用作指示菌实验室保存S.aureusATCC25923野生型,用作指示菌实验室保存质粒PlasmidspGAPZA毕赤酵母蛋白胞外表达载体实验室保存pGAPZA-Cathelicidin-1用于表达蛋白本实验构建1.2实验试剂从美国NEB公司选购限制性核酸内切酶和 T4DNA连接酶;2PhantaMaxMasterMix,DL5000DNAMarker、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自中国 Vazyme公司;双色预染蛋白 Marker、酵母基因组提取试剂盒和蛋白上样缓冲液购于中国生工公司;其
8、他所用试剂为国产分析级。1.3Cathelicidin-1 的合成、扩增及纯化抗菌肽 Cathelicidin-1 的全长核苷酸序列由中国生工公司合成,以该核苷酸序列为模板,通过引物对Cathelicidin-1-F/Cathelicidin-1-R 扩增Cathelicidin-1目的基因(Cathelicidin-1-F:5-CCGGAATTCCG-AGTAAAGCGAGTTTGGCC-3 ;Cathelicidin-1-R:5-TGCTCTAGAGCACCTTGAAAGTACAAG-TTTTCCTTC-3)。PCR总反应体系为12L,体系包括:0.5L 上游引物,0.5L 下游引物,1L
9、 模板,6L2PCRmix,4LddH2O。PCR产物经由电泳进行检测,依照试剂盒操作,回收目的条带。1.4pGAPZA-Cathelicidin-1 重组载体构建首先用限制性核酸内切酶 Xba与 EcoR消化pGAPZA 质粒与目的基因片段,酶切总体系共100L,组分如下:1L 内切酶 Xba,1L 内切酶 EcoR,10LCutsmart 缓冲液,500ng 目的基因和 500ng 空载质粒,60LddH2O。依照试剂盒说明书,回收酶切产物,使用酶标仪测定浓度,并通过 T4DNA连接酶 20 连接 1h。通过热激法转化 E.coliDH5细胞,37孵育1h后涂布到含25mgL1博莱霉素的L
10、B固体培养基上,37恒温过夜培养,随机选取单菌落至LB培养基中,恒温过夜培养 12h,过夜培养物提取质粒,用 目 的 基 因 扩 增 引 物 对 Cathelicidin-1-F/Cathelicidin-1-R进行 PCR,将待测样品送至海南楠山生物技术有限公司测序。1.5pGAPZA-Cathelicidin-1 重组载体扩增、单酶切及真核转化选取测序正确的阳性转化子到含有 25mgL1博莱霉素的LB培养基中,37恒温 振 荡 过 夜。用 质 粒 萃 取 试 剂 盒 纯 化 回 收pGAPZA-Cathelicidin-1 重组载体,并用内切酶BamHI 酶切消化,处理体系为 50L,包括
11、:内切酶 BamHI1L,Cutsmart 缓冲液5L,质粒600ng,ddH2O30L。依照试剂盒操作步骤回收单酶切产物,电转至毕赤酵母 GS115 感受态细胞中。酵母细胞在30孵育1h后涂布到含50mgL1博莱霉素的 YPDS 固体培养基上,30恒温培养48h,随机选取单克隆菌落转移到YPD培养基中30 恒温振荡培养,经蜗牛酶处理 1h 后,提取酵母基因组,用验证性引物 pGAP-F/3AOX1 进行PCR 以验证阳性克隆子(pGAP-F:5-GTCCCTAT-TTCAATCAATTGAA-3;3AOX1:5-GCAAATG-GCATTCTGACATCC-3),将待测阳性克隆子送至海南楠山
12、生物技术有限公司测序。1.6Tricine-SDS-PAGE 凝胶电泳分析挑经测序的酵母阳性转化子单菌落至含 50mgL1博莱霉素的 5mLYPD 培养基中,30恒温振荡培养48h。将酵母培养物按初始浓度 106CFUmL1转接到200mLYPD培养基中,于 30发酵培养72h,然后 5000rmin1离心 10min,经滤膜过滤并收集发酵液。取 20L 发酵液与 20L2蛋白上样缓冲液混匀,以转入空载质粒的酵母发酵液为对照,使用试剂盒配置 18%Tricine-SDS-PAGE凝胶,随后进行电泳分析,使用考马斯亮蓝处理1h,经脱色液处理 3h后观察结果。1.7重组酵母发酵液抑菌活性鉴定以大肠
13、杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌,使用牛津杯法与抑菌曲线法分别测定发酵液抑菌活性。对于牛津杯法,先将转接培养的 2 种指示菌恒温培育 12h,取 5106CFU 的初始菌量涂板,待平板晾干后,将牛津杯竖直放置其上,往其中加入 100L 发酵液,第5期李飞航等:抗菌肽 Cathelicidin-1 真核表达及发酵液抑菌活性鉴定47537 放置 12h 后,观察有无抑菌圈,使用游标卡尺记录其直径。对于抑菌活性测定,先使用 96 孔板接种 107CFU 初始指示菌菌量,培养总体积 200L,然后加入不同体积的发酵液,使其体积分数分别达到 25%、50%、75%和 100%,以转入空载质粒重组菌株等体积分
14、数的发酵液体为阴性对照,设置 3 个生物学重复,37 恒温培养 24h,在培养期间,每 3h 测定 1 次 OD600吸光值,绘制抑菌曲线。2结果与分析2.1pGAPZA-Cathelicidin-1 表达载体构建为了获得分泌至 P.pastoris 胞外的抗菌肽,以便于后续检测,选用 pGAPZA 为载体,将外源片段插入其中 因子分泌信号肽编码序列下游。从图 1 可知,重组载体在其表达的蛋白 N端添加酿酒酵母因子分泌信号肽,使得表达的抗菌肽可以分泌到发酵液中。pGAPZA 的 GAP 启动子为组成型启动子,无需诱导物即可表达重组蛋白。oriori11pGAPZ ApGAPZ A-Cathel
15、icidin-13 246 bp3 147 bpGAP promoterGAP promoter-factorsecretion signal-factorsecretion signalEcoR I(760)Xba I(823)AOX1 terminatorAOX1 terminatorCathelicidin-1BamH I(1 228)TEF1 promoterTEF1 promoterBleoRBleoRCYC1terminatorCYC1terminator图1pGAPZA 空载体与携带外源片段的 pGAPZA-Cathelicidin-1 重组载体图谱通过 PCR 扩增 Cathe
16、licidin-1 全长序列(123bp),并在其 5及 3端分别引入相应的酶切位点。通过电泳分析 PCR 产物,由图可知在大约120bp 处存在 1 条明亮单一的条带,即为目的条带,表明获得符合预期的 PCR 产物(图 2)。250100bpM1图2Cathelicidin-1 编码基因 PCR扩增产物M:DL5000DNAMarker;1:目的基因PCR产物。纯化PCR产物,与 pGAPZA 载体用相同的内切酶 Xba和 EcoR双酶切处理,回收酶切产物。接着,将酶切产物连接,构建融合表达载体pGAPZA-Cathelicidin-1,通过热激导入 E.coliDH5细胞中,均匀涂布到有
17、25mgL1博莱霉素的抗性平板上。最后,随机挑取抗性平板的单菌落,通过菌液PCR 验证是否为阳性。电泳结果表明,可以获得120bp 左右的目的条带,PCR 产物条带单一且浓度丰富(图 3,泳道39)。随后提取质粒,送至海南楠山生物技术有限公司,测序对比表明已构建成功重组载体。2.2Cathelicidin-1 的真核表达及Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析pGAPZA 载体能够整合到酵母染色体上,具有较高遗传稳定性。为了防止环状载体与染色体整合时发生随机断裂,在将重组载体 pGAPZA-Cathelicidin-1 转化酵母之前首先对其进行单酶切,以固定断裂位点。由图 4 可知,通过
18、内切酶 BamHI 对重组载体进行单酶切后,酶切后的线性质粒(图 4,泳道 24)泳动速度要低于未酶切的环状质粒(图 4,泳道 1),证明酶切成功,随后纯化单酶切产物。将重组载体单酶切产物电转化至 P.pastorisGS115 感受态细胞中,均匀涂布在有 50mgL1博莱霉素抗性平板上,挑选阳性克隆,转接到 5mlYPD 培养基中,培养 24h,经蜗牛酶处理后,提取基因组,通过 PCR 扩增后,电泳验证。由图可知,能够获得与阳性对照大小一致的目的产物,PCR 产物条带单一且浓度丰富(图 5,泳道 3)。476热带生物学报2023年回收 PCR 产物,送至海南楠山生物技术有限公司分析,结果表明
19、,重组载体已整合到酵母基因组中,且开放阅读框未出现突变,一致性达100%(图 6-A 和图 6-B)。最后,将重组酵母转接到 YPD 培养基中发酵 72h,离心收集发酵液,进行 Tricine-SDS-PAGE 分析,结果表明,与转化空载体的菌株相比,表达抗菌肽的重组菌株发酵液在 10kDa 处出现显著目的条带,与预期大小一致,表明抗菌肽以胞外分泌形式表达(图 7)。2.3发酵液抑菌活性测定以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别为革兰氏阴性与阳性指示菌,分别采用牛津杯法和抑菌曲线测定法鉴定本研究重bpM123456789250100图3菌液 PCR 鉴定重组载体转化 E.coliDH5 阳性克隆M:D
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