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桔梗元参汤对过敏性哮喘小鼠气道炎症和黏液分泌的影响及其机制.pdf
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1、第 50 卷 第 1 期2024年 1 月吉林大学学报(医学版)Journal of Jilin University(Medicine Edition)Vol.50 No.1Jan.2024DOI:10.13481/j.1671587X.20240102桔梗元参汤对过敏性哮喘小鼠气道炎症和黏液分泌的影响及其机制唐红梅,李月蛟,王星,王志彬,袁谢芳,王孝芸(西南医科大学附属医院炎症与变态反应实验室,四川 泸州 646000)摘要 目的目的:探讨桔梗元参汤(JGYST)对过敏性哮喘小鼠气道组织炎症和黏液分泌的影响,并阐明其相关作用机制。方法方法:40 只雄性 C57BL/J 小鼠随机分为对照组、
2、JGYST 组、卵清蛋白(OVA)组及 OVA+JGYST 组。OVA 组和 OVA+JGYST 组小鼠用 50 g OVA 腹腔注射致敏,每周2 次,致敏后连续 7 d 用 OVA 20 g 滴鼻激发哮喘;OVA+JGYST 组小鼠每次 OVA 激发前 1 h 用JGYST 200 L 灌胃,共灌胃 7 次;对照组用相同剂量的 PBS 缓冲液腹腔注射、滴鼻和灌胃;JGYST组小鼠用相同剂量 PBS 缓冲液腹腔注射和滴鼻,用相同剂量 JGYST 灌胃。采用 HE 染色和过碘酸-雪夫(PAS)染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现并计算炎症评分和 PAS 评分,流式细胞术检测各组小鼠肺组织中嗜酸性粒
3、细胞、中性粒细胞、辅助性 T 淋巴细胞 1(Th1)、辅助性 T 淋巴细胞 2(Th2)和树突状细胞(DCs)数及成熟 DCs百分率和活性氧(ROS)水平,实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)法检测各组小鼠肺组织中白细胞介素 4(IL-4)、白细胞介素 10(IL-10)和肿瘤坏死因子 (TNF-)mRNA 表达水平。结果结果:HE 染色和 PAS 染色,对照组小鼠气道和肺泡结构完整、无炎症细胞浸润,无黏液分泌;与对照组比较,OVA 组小鼠气道组织周围有大量炎症细胞浸润,炎症评分和 PAS 评分明显升高(P0.01);与 OVA 组比较,JGYST 组和 OVA+JGYST 组小鼠气道组织炎
4、症细胞浸润减少,炎症评分和 PAS评分明显降低(P0.01)。流式细胞术检测,与对照组比较,OVA 组小鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、Th2 和 DCs数均明显增加(P0.05 或 P0.01),成熟 DCs百分率和 ROS 水平均明显升高(P0.01);与 OVA 组比较,JGYST 组和 OVA+JGYST 组小鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、Th2 和 DCs 数均明显减少(P0.01),成熟 DCs 百分率和 ROS 水平均明显降低(P0.01)。RT-qPCR 法检测,与对照组比较,OVA 组小鼠肺组织中 IL-4、IL-10和 TNF-mRNA 表达水平升高(P0.01);与 OVA 组比较,J
5、GYST 组和 OVA+JGYST 组小鼠肺组织中 IL-4和 TNF-mRNA 表达水平降低(P0.01),IL-10 mRNA 表达水平升高(P0.01)。结论结论:JGYST 可以减轻过敏性哮喘小鼠气道组织炎症和黏液分泌,其作用机制可能与其减少 Th2 细胞和 DCs数量,降低 ROS 水平和促炎细胞因子表达水平同时升高抗炎细胞因子表达水平有关。关键词 桔梗元参汤;哮喘;气道炎症;活性氧;细胞因子中图分类号 R562文献标志码 AEffect of Jiegeng Yuanshen Tang on airway inflammation and mucus secretion in al
6、lergic asthmatic mice and its mechanismTANG Hongmei,LI Yuejiao,WANG Xing,WANG Zhibin,YUAN Xiefang,WANG Xiaoyun(Inflammation and Allergic Reaction Laboratory,Affiliated Hospital,Southwest Medical University,Luzhou 646000,China)文章编号 1671587X(2024)01001008收稿日期 20230328基金项目 国家自然科学基金青年基金项目(82100021);西南医科
7、大学自然科学基金项目(2022QN010)作者简介 唐红梅(1987),女,四川省泸州市人,助理研究员,医学硕士,主要从事呼吸系统疾病基础和临床方面的研究。通信作者 王孝芸,主管技师(E-mail:)10唐红梅,等.桔梗元参汤对过敏性哮喘小鼠气道炎症和黏液分泌的影响及其机制ABSTRACT Objective:To discuss the effect of Jiegeng Yuanshen Tang(JGYST)on airway tissue inflammation and mucus secretion in the mice with allergic asthma,and to c
8、larify the related mechanism.Methods:Forty male C57BL/J mice were randomly divided into control group,JGYST group,ovalbumin(OVA)group,and OVA+JGYST group.The mice in OVA group and OVA+JGYST group were sensitized with 50 g OVA via intraperitoneal injection twice weekly,followed by 20 g OVA nasal drop
9、s daily for 7 d to induce asthma;the mice in OVA+JGYST group were gavaged with 200 L JGYST 1 h before each OVA challenge,and the administration lasted for 7 d;the mice in control group were given equivalent dose of PBS via intraperitoneal injection,nasal drops,and gavage;the mice in JGYST group were
10、 given the same dose of PBS for intraperitoneal and nasal administration and gavaged with the same dose of JGYST.The pathomorphology of lung tissue of the mice in various groups was observed by HE staining and periodic acid-Schiff(PAS)staining,and the inflammation and PAS scores were calculated;flow
11、 cytometry method was used to detect the numbers of eosinophils,neutrophils,helper T lymphocyte 1(Th1)cells,helper T lymphocyte 2(Th2)cells,and dendritic cells(DCs),as well as the percentage of mature DCs and level of reactive oxygen species(ROS)in lung tissue of the mice in various groups;real-time
12、 fluorescence quantitative PCR(RT-qPCR)method was used to detect the expression levels of interleukin-4(IL-4),interleukin-10(IL-10),and tumor necrosis factor-(TNF-)mRNA in lung tissue of the mice in various groups.Results:The HE and PAS staining results showed that the mice in control group had inta
13、ct airway and alveolar structure,without infiltration of inflammatory cells or mucus secretion;compared with control group,there was a large number of infiltrating inflammatory cells in airway tissue of the mice in OVA group,and the inflammation and PAS scores were increased(P0.01);compared with OVA
14、 group,the infiltration of inflammatory cells in airway tissue of the mice in JGYST group and OVA+JGYST group was decreased,and the inflammation and PAS scores were significantly decreased(P0.01).The flow cytometry results showed that compared with control group,the numbers of eosinophils,Th2 cells,
15、and DCs in lung tissue of the mice in OVA group were increased(P0.05 or P0.01),and the percentage of mature DCs and level of ROS were significantly increased(P0.01);compared with OVA group,the numbers of eosinophils,Th2 cells,and DCs in lung tissue of the mice in JGYST group and OVA+JGYST group were
16、 decreased(P0.01),and the percentage of mature DCs and level of ROS were significantly decreased(P0.01).The RT-qPCR results showed that compared with control group,the expression levels of IL-4,IL-10,and TNF-mRNA in lung tissue of the mice in OVA group were increased(P0.01);compared with OVA group,t
17、he expression levels of IL-4 and TNF-mRNA in lung tissue of the mice in JGYST group and OVA+JGYST group were decreased(P0.01),while the expression level of IL-10 mRNA was increased(P0.01).Conclusion:JGYST can alleviate the airway tissue inflammation and mucus secretion in the mice with allergic asth
18、ma,and its mechanism may be related to reducing the number of Th2 cells and DCs,decreasing the ROS level and expression level of proinflammatory cytokine,and increasing the expression level of anti-inflammatory cytokine.KEYWORDS Jiegeng Yuanshen Tang;Asthma;Airway inflammation;Reactive oxygen specie
19、s;Cytokine哮喘是由多种细胞和炎症因子介导的慢性呼吸系统疾病,是危害全球数百万人健康的全球公共卫生问题。目前哮喘临床治疗以西医治疗为主,包括糖皮质激素、-受体激动剂和白三烯受体拮抗剂等。虽然上述药物可以缓解哮喘症状,但也存在产生耐药性、药物疗效明显下降、机体代谢紊乱和免疫力降低等不良反应。与西药比较,中药具有作用温和、作用时间长和治疗成本低等优势1。桔 梗 元 参 汤(Jiegeng Yuanshen Tang,JGYST)出自清朝名医黄元御 四圣心源,主要成分包括桔梗、元参、杏仁、橘皮、法半夏、茯苓、甘草和生姜,具有清咽解毒、宣肺平喘及和胃降逆的功效。研究2-5表明:JGYST 对小
20、儿化脓性扁桃体炎、变应性鼻炎、急性咽炎和急性呼吸道感11第 50 卷 第 1 期 2024 年 1 月吉林大学学报(医学版)染均有治疗作用。关于 JGYST 对过敏性哮喘的治疗目前尚未见报道。本研究通过建立过敏性哮喘小鼠模型,采用 JGYST 进行干预,观察 JGYST 对哮喘小鼠的影响,并探讨其可能的作用机制。1 材料与方法 1.1实验动物实验动物、药物药物、主要试剂和仪器主要试剂和仪器健康雄性C57BL/J 小鼠 40 只,体质量 2035 g,68 周龄,由重庆腾鑫生物技术有限公司提供,动物使用许可证号:SYXK(川)2018-065。卵清蛋白(ovalbumin,OVA)购 自 美 国
21、 Sigma 公 司,活 性 氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,桔梗、玄参、杏仁、陈皮、法半夏、茯苓、甘草和生姜购自北京同仁堂(集团)有 限 公 司,抗 CD4、抗 CD45、抗CD11c、抗 CD11b、抗 CD86、抗 白 细 胞 介 素 4(interleukin-4,IL-4)、抗 Siglec-F(CD170)、抗Ly6G 和抗干扰素 (interferon-,IFN-)抗体购自美国 Invitrogen公司,RNA 提取试剂盒和实时荧光 定 量 PCR(real-time fluorescence quantita
22、tive PCR,RT-qPCR)检测试剂盒购自南京诺维赞生物 技 术 有 限 公 司。流 式 细 胞 仪 购 自 美 国 ACEA Biosciences 公 司,RT-qPCR 仪 购 自 瑞 士 Roche公司。1.2 实 验 分 组 和 哮 喘 模 型 制 备实 验 分 组 和 哮 喘 模 型 制 备 40 只 雄 性C57BL/J小鼠随机分为对照组、JGYST组、OVA组和 OVA+JGYST 组,每 组 10 只。OVA 组 和OVA+JGYST 组 小 鼠 采 用 OVA 联 合 氢 氧 化 铝Al(OH)3 腹 腔 注 射 致 敏,每 只 小 鼠 50 g OVA+2.5 mg
23、 Al(OH)3,每周 2次;致敏后每只小 鼠 连 续 7 d 用 20 g OVA 滴 鼻 激 发 哮 喘6,OVA+JGYST 组小鼠在每次 OVA 激发前 1 h 用JGYST 200 L 灌胃,共灌胃 7 次;对照组小鼠用相同剂量的 PBS 缓冲液腹腔注射、滴鼻和灌胃;JGYST 组小鼠用相同剂量 PBS 缓冲液腹腔注射和滴鼻,用相同剂量 JGYST 灌胃。造模期间密切观察各组小鼠的健康状况。1.3HE 染色和过碘酸染色和过碘酸-雪夫雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现并计染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现并计算炎症评分和算炎症评分
24、和 PAS 评分评分收集各组小鼠肺组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片后行 HE 染色和PAS 染色,进行炎症评分和黏液分泌情况评估(PAS 评分)。炎症评分。每张切片选取 10 个区域对气道和血管周围组织炎症细胞浸润严重程度和浸润总 体 范 围 进 行 评 分。浸 润 严 重 程 度 评 分:0 分,无炎症细胞;1 分,10 个炎症细胞;浸润总体范围评分:0分,无炎症细胞浸润;1分,炎症细胞浸润范围75%。结合炎症细胞浸润严重程度和浸润总体范围对炎症进行评分,最高评分可达 9分7。PAS评分。每张切片选取10 个区域,对 PAS 阳性杯状细胞进行 PAS 评分:0分,PAS阳性杯状细胞百分率
25、75%8。1.4流式细胞术检测各组小鼠肺组织中中性粒细流式细胞术检测各组小鼠肺组织中中性粒细胞胞、嗜 酸 性 粒 细 胞嗜 酸 性 粒 细 胞、辅 助 性辅 助 性 T 淋 巴 细淋 巴 细 胞胞 1(helper T lymphocyte 1,Th1)、)、辅助性辅助性 T 淋巴细胞淋巴细胞 2(helper T lymphocyte 2,Th2)和 树 突 状 细 胞和 树 突 状 细 胞(dendritic cells,DCs)数数取各组小鼠肺组织,用型胶原酶和 DNA 酶消化过滤获得单细胞,用相应抗体在4 条件下进行染色,0.5 h后上机检测中性粒细胞(CD45+Siglec-FLy6
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