实验室常用液体配制标准操作规程(SOP).pdf

g与常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基：每1000mL加分析纯NaCl 10g,蛋白豚10g,酵母粉5g,用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至7.4(1000mL一般加450叫，高压蒸 汽灭菌15min冷却后使用。2、固体培养基：LB培养基中加入琼脂至1.5%,高压蒸汽灭菌15min后使用。3、10%(g/V)氨苇青霉素钠(Ap)：注射用氨苇青霉素钠(粉末)50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4 ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌,分装后一20度保存，培养细菌时做1000 X使用。注:如果购买的氨革青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用0.22 滤膜过滤除菌后再分装。4、25%(g/V)硫酸卡那霉素(Kan)注射用硫酸卡那霉素(液体)通常是2ml/支，内含0.5g卡那霉素。取25支药剂(50ml),加入4 50ml无菌去离子水中，分装入4 ml灭 菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后一20度保存,培养细菌时做1000 X使用。注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装,溶解后需用0.22 滤膜过滤除菌后再分装。5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入34 ml培养基(卡那霉素抗性培养采用标记试管)，无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37,220r pm 培养。剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4保存。6、化学感受态制备：1)原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称 为感受态细胞(Competent cell)。将细菌置于0,低渗CaCk溶液 中时，菌细胞壁和膜的通透性增强，菌体膨胀成球型。外源DNA与 Ca2+形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，在经42 短暂的热冲击处理(一般热休克90s)后能促进细胞吸收外源DNA 复合物。2)仪器、材料与试剂：超净工作台、低温离心机、摇床、-80冰箱，装液氮的泡沫 盒及液氮、50ml的离心管2个，50ml的注射器及0.22um小过滤器各 1个。高压灭菌的纸张、透气膜、1.5ml的EP管约350-500个，两块 10cm的平皿板及接种环。TB 缓冲液：每200ml液体中含 Mncl2.4 H20Q.176g)、Cacl2.2H2O(0.4 4 g)Kcl(3.73g)PIPES(0.67g)o(注：在电子天平上 的误差3 加水定容至 100mL；(3)Na2s2O3溶液:0.32gNa2s2O3-3H2。,加水定容至 IL；(4)显色液(未加甲醛):30g NaCO3,20mL上述Na2s2O3溶液，加水定容至1L,(临用前加入甲醛，甲醛量如何确定？)o(5)2.3M 柠檬酸：4 83.22g C6H8O7-3H2O,加水定容至 1 L。(三)杂交1、电转液：称取Tr isBase 18.2g,甘氨酸86.5g,先加4 L水溶解，再加甲醇1200ml,定容至6L。2、10 xTN：称取 NaCl 4 38.3g,Tr is 60.57g,加入浓盐酸调节至 PH 8.0,定容至5L o3、封闭液(WB用)：称取5g脱脂奶粉，加入TN,定容至lOOmlo 4、TNT：TN 中加 Tween-20 至 0.05%。5、AP 底物：氯化钠 2.902g,MgCl2.6H2O 0.508g,Tr is-Base 6.087g,加水溶解，加浓盐酸320ul调节pH至9.5,定容至500ml注意事项：NBT、BCIP、N-N-二甲基甲酰胺为有毒试剂，戴乳 胶手套在通风橱中操作。配制用的EP管最好采用新管子，防止漏液,用后的空管注明有毒，用PE手套或是塑料袋包好再丢弃。6、NBT配制：500mgNBT粉末溶于7mlN-N-二甲基甲酰胺，3ml去 离子水中，颠倒混匀，溶解即可。7、BCIP 配制：100mg BCIP粉末溶于10ml N-N-二甲基甲酰胺中，颠倒混匀，溶解 即可。（四）纯化1、10 义裂解液：50mmol/LTr is-HCl（pH7.2）,lOmmol/LEDTA,300mmol/LNaCl.。2、Buffer I：20mmol/LTr is-HCl,5mmol/LEDTA,lOOmM NaCL3、8M Ur ea：称取4 80g的尿素，用Buffer I定容至1升即可。四、细胞培养相关（一）胰酶的配制：（浓度为1%。，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3 遍。2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA2g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染 菌，其余置于4待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。（二）DMEM 配制:1、所需试剂及材料：试剂：DMEM 干粉(GIBCO 10L)、超纯水(MilliQ)、Na2c。3(Sigma)材料：10L玻璃瓶、500ml盐水瓶(灭菌)、0.22um滤膜、滤器(事 先放好两层滤膜并高压灭菌)、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞 2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L,将DMEM干粉倒入，在磁力 搅拌器上搅拌溶解。(3)按照 3.7g/L 加入 Na2cO3。(4)调节 pH 值至 7.27.4o(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。(三)1640、MEM培养基的配制同上，Na2cCh的用量见包装说 明(四)细胞间100X双抗(青霉素、链霉素)的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。配制的步骤以4 00ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗 3遍。2.准备5瓶青霉素(80万单位/瓶)、4瓶链霉素(100万单位/瓶)。3.加入l-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡 后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。用PBS 再次润洗装有青霉素及链霉素的小瓶子，将残留的青霉素及链霉 素溶解，将液体并入配制容器内，重复润洗2次。4.用细胞间专用PBS定容至4 00mL搅拌均匀。5.将配制的母液用0.22um的滤膜过滤除菌，分装到灭菌后的4 mlEP管内，2ml/管,冻存于-20。（4 mlEP管需提前一天灭菌，烘 干过夜。）（五）100X L谷氨酰胺配制（浓度200mM=29.2g/L）所需试剂及材料：L-谷氨酰胺干粉（Sigma）、超纯水（Mili-Q）、1L烧杯、量筒、4 m1EP管（灭菌）。步骤：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3 遍。2.称取相应质量的L-谷氨酰胺干粉，用超纯水溶解后，0.22um小滤 器过滤除菌。按需要分装（如2ml/管）-20C保存。注：勿高压灭菌，过滤后，尽快分装，切勿放在4c过久！（六）100X丙酮酸钠配制（浓度lOOmM llg/L）所需试剂及材料：丙酮酸钠（Sigma）超纯水（Mili-Q）1L烧杯，量筒，1.5mlEP管（灭菌）步骤：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍2.称取相应质量的丙酮酸钠干粉，用超纯水溶解后，0.22um小滤器过滤除菌。按需要分装（如1ml/管）-20C保存。注：勿高压灭菌 过滤后，尽快分装，切勿放在4C过久！（七）Verson配制1.洗净容器：自来水10遍，去离子水5遍，超纯水3遍。2.酉己制Ver son（超纯水配制）：Verson(1 x)(g/L)KC10.4KH2PO40.06NaCl8.0NaHCO30.35Na2HPO412H200.08EDTA0.23.分装到500ml盐水瓶，盖上胶塞（不用灭菌，煮过即可），插上针头（10mL以下的注射器针头），包上铝箔纸。4.120,20min高压湿热灭菌，灭菌后，摆放至细胞间指定位置。（八）细胞间PBS配液PBS缓冲液配方：【IL体系】NaCl 8.0 g,KC10.2g,Na2HPO412H2O 2.9 g,KH2Po4 0.24 g调整pH至7.4具体步骤：1.清洗配液瓶,自来水10遍，去离子水5遍，超纯水3遍。（一般使 用细胞间配液瓶10 L体系）；2.按上述配方准确称量物品，倒入配液瓶（注意：若药品潮解，应 更换）；3.加入超纯水（细胞间配液用，R206）,定容至准确体系，溶解完 全；4.使用细胞间pH计，调配pH至7.4；5.使用细胞间灭菌过的500mL盐水瓶进行分装，标记，加橡胶塞 针头，120,20min高压湿热灭菌；6.灭菌完，摆放至细胞间相应位置。（九）磷酸钙转染试剂配制试剂前，认真清洗配制容器，自来水10遍，去离子水5遍，超 纯水3遍。Cad?0.5 M（500ml）CaCl2.2H2O（MW 147）SigmaUltra C5080 36.75 g溶解于500ml超纯水，0.22um小滤器过滤除菌。50ml样品管分装后，冻存于-20OC oHeBS 2x(1000ml)NaCl(MW 58.4 4)SigmaUltr a S7653 16.36 g(0.28 M final)HEPES(MW 238.3)SigmaUltra H7523 11.9g(0.05M final)Na2HPO4,anhydr ous(MW 14 2)SigmaUltra S7907 0.213 g(1.5 mM final)800 ml超纯水溶解后，用IMol NaOH溶液调PH值至6.98,然后定 容至1000ml。(准确的PH值对转染效率非常重要，请用细胞间内的 精密PH计测量PH值,测量前要校正PH计,线型要在99%101%)0.22um小滤器过滤除菌。50ml样品管分装后，冻存于-2(TC。(+)酸液配制(1L)：重铭酸钾 120g浓硫酸 200ml去离子水补至1000ml具体步骤：1在通风橱中架好塑料桶和搅拌器，确保稳定，不会侧翻。2在塑料桶中10L、15L、20L的位置划好刻度线，以利于后续步骤 的定容。3在塑料桶中加入半桶去离子水，开动磁力搅拌器，缓慢倒入浓硫酸(硫酸遇水放热，倒太快会导致液体飞溅)。4缓慢倒入重倍酸钾，定容后，搅拌至完全溶解。注意事项：废酸液应先用工业级的NaOH中和后方可倒往下水道，否则会腐蚀水管、污染环境，中和过程中会大量放热。五、单克隆抗体制备系统1、PRMI1640HT培养基（10L）:PRMI 1640 干粉 10 包（103.9g/10L）,称取丙酮酸钠（Sodium Pyr uvate,S）l.lg/10L,适量ddH2O溶解后加入。称取黄喋吟（hypoxanthn,H）136.1 mg/10L+胸腺喀碇核昔（thymidine,T）38.8mg/10L+谷氨酰胺（L-Glutamine,L-Glu）3.4 8g/10L,置适量 ddH2O 中在4550条件下溶解后加入。加ddH2O至10L,补加NaHCO3 20g/10Lo 用 Imol/LHCl 调节 pH 至 6.87.0（经验值是 3ml/10L）。过 滤除菌。取少量的培养液置培养瓶中并放入CO?培养箱中，一周后，如培养中未长菌，同一期配制的基础培养液方可使用。2、PRMI 1640 培养基：PRMI 164 0HT培养基配制时不加H（黄喋吟）和T（胸腺喀咤核 昔）即可。3、过氧乙酸：100ml的H2O2加入到200ml的乙酸中，再加入6ml浓H2so4,放 置过夜即可。4、细胞冻存液：90mL胎牛血清+10mLDMSO（二甲亚碉），4冻存。EIA系统六、EIA系统（一）常用溶液:1、2OXCB9.6(1L)：Na2co3 31.8g；NaHC03 58.6g2、1OXPB7.4(1L)：Na2HPO4-7H2O 4 3.4 3g；NaH2Po4 4.56g3、2XED：1XPBS+0.5%酪蛋白+2%明胶+0.1%防腐剂(pr oclin-300)(二)基本操作：1、标本的采取和保存大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本只要待血清自然凝 固、血块收缩后即可取得。应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出 具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标 本可能会增加非特异性显色。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分 布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混 匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后 再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保 存作多次检测，宜少量分装冰存。2试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。从冰箱中取出的 试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的 部分应及时放回冰箱保存。3加样在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注 意不可溅出，不可产生气泡。需稀释的样品可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。若每孔所加样品不同，每板的加样时间不宜超过7分钟,另一方面要注 意不要造成孔间污染；加酶结合物和底物时可用定量多道加液器，使 加液过程迅速完成。错误 正确4保温常见的ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合 物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程 称为温育(incubation),有人称之为孵育。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机 会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个 逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的 酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应 总是需要一定时间的温育。37是实验室中常用的保温温度，也是大 多数抗原抗体结合的合适温度。保温的方式本实验室为恒温箱中温育,为避免蒸发，板上应用封板膜覆盖板孔.反应板不宜叠放，板间要有 一定的空间以保证各板的温度都能迅速平衡，另外，尽量不要将板紧 贴恒温箱的侧壁，因侧壁的温度通常较高。应注意温育的温度和时间 应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两 块板同时测定。5洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的 成败。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应 把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗板前要检查洗瓶中洗液 是否够用，废液瓶中的废液是否超过警戒线，洗头的出液口与吸液口是 否有堵塞,洗瓶、废液瓶、缓冲瓶瓶口是否旋紧，洗板程序是否正确。除包被后的洗板，一般洗板次数为5次，通常第一次洗板时不要离开,注意观察是否有异常，若没问题可以离开为后续实验做准备。6显色和比色6.1 显色显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生 成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间 内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。在定 量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。6.2 比色将板正确放入酶标比色仪的比色架中。比色结果的表达以往通用 光密度(oplical density,OD),现按规定用吸光度(absor bence,A)表示，两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的 右下角，如OPD的吸收波长为4 92nm,表示方法为“A4 50nm”或“OD4 50nm”。6.3 酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的 光度计。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。超出可测上限 的A值常以“over”表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范 围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为0.0002.900,而其 线性范围仅0.0002.000,这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注 意。本实验室酶标仪采用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一 次在最适波长（W1）,第二次在不敏感波长（W2）,两次测定间不 移动ELISA板的位置。例如PMD用4 50nm为Wl,620nm为W2,最终 测得的A值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由板条底部 上的划痕或指印等造成的光干扰。