经鼻吸入复方精油提神醒脑的药效、作用机制及初步安全性研究.pdf
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1、天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1591-1601经鼻吸入复方精油提神醒脑的药效、作用机制及初步安全性研究刘小金,刘日群,郑琴,杨江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室,南昌330 0 0 4摘要:评价复方精油吸对小鼠提神醒脑的功效、作用机制及安全性。采用昆明小鼠经鼻吸嗅复方精油,通过自主活动行为学测试、戊巴比妥钠诱导睡眠实验综合评价复方精油提神醒脑的功效;采用酶联免疫法(ELISA)检测小鼠血、脑内神经递质多巴胺(DA)和谷氨酸(GLU)含量,Westernblot研究复方精油对小鼠不同脑区多巴胺受体DIR蛋白水平的影响,阐明提神醒脑作用机制;单次高剂量吸嗅给
2、药急性毒理学实验考察复方精油安全性,采用气相色谱质谱联用技术(GC-MS)分析复方精油化学成分。动物实验结果表明,与对照组相比,复方精油低、中、高剂量组小鼠吸嗅3d,每日均能显著提高运动距离(P0.01)、平均速度(P0.01),缩短休息时间(P0.01),显著提高小鼠自主活动;连续吸嗅精油3d,能显著缩短睡眠总时长(P0.01),具有提神醒脑的作用。ELISA结果表明,与对照组相比,复方精油显著提高小鼠血、脑内DA、G LU 的含量(P0.05,P0.05);Westernblot结果表明,复方精油均显著上调小鼠海马、下丘脑、前额皮层和其他脑组织D1R蛋白水平(P0.05)。单次高剂量吸实验
3、,复方精油对小鼠体重、血细胞相关指标、肝肾功能均无显著性影响,HE染色病理切片表明复方精油对脑、鼻、肺、肝、肾等组织无病理性损伤。GC-MS结果显示,复方精油中L-薄荷醇(2 4.54%)含量最高,其次为丁香酚(16.2 5%)、L-薄荷酮(7.7 8%)、冰片(7.30%)、L-石竹烯(5.2 9%)、1,8-桉叶素(3.40%)。复方精油对小鼠具有提神醒脑的功效,同时吸嗅安全性较高,其作用机制可能与提高血、脑内DA和GLU含量,上调不同脑区D1R蛋白水平有关。关键词:复方精油;提神醒脑;神经递质;多巴胺受体D1R;安全性中图分类号:R284.1;R285.5文献标识码:AD01:10.16
4、333/j.1001-6880.2023.9.013Efficacy,mechanism and preliminary safety of compound essential oil扬明,胡鹏翼*,李字棋,肖淑华文章编号:10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)9-159 1-11for refreshing the brain by nasal inhalationLIU Xiao-jin,LIU Ri-qun,ZHENG Qin,YANG Ming,HU Peng-yi*,LI Zi-qi,XIAO Shu-huaKey Laboratory of Modern Traditio
5、nal Chinese Medicine Preparation of Ministry of Education,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,ChinaAbstract:To evaluate the efficacy,mechanism and safety of compound essential oil sniffing on refreshing and alerting mice.The effects of compound essential oil on refresh
6、ing and alerting the brains of Kunming mice were comprehensively evaluatedthrough behavioral tests of autonomic activity and sleep induced by pentobarbital sodium.The contents of dopamine(DA)and glutamic acid(GLU)neurotransmitters in the blood and brain of mice were detected by enzyme-associated imm
7、unoassay(ELISA).The effects of compound essential oil on dopamine receptor DIR protein levels in different brain regions of micewere studied by Western blot,and the mechanism of alerting the brain was clarified.The safety of compound essential oil wasinvestigated by acute toxicology experiment of si
8、ngle high-dose inhalation administration,and the chemical constituents ofcompound essential oil were analyzed by gas chromatography and mass spectrometry(GC-MS).The results of animal experi-ments showed that compared with the control group,the mice in the low,medium and high dose groups of compound
9、essentialoil could significantly increase the exercise distance every day after three days of sniffing(P0.01),average velocity(P收稿日期:2 0 2 3-0 2-2 0基金项目:国家中医药多学科交叉创新团队项目(ZYYCXTD-D-202207);江西中医药大学重点领域科技创新团队(CXTD22006)*通信作者Tel:86-791-87118658;E-mail:接受日期:2 0 2 3-0 5-2 215920.01),shorten the rest time(
10、P0.01),significantly increase the autonomic activity of mice;Sniffing essential oils for threeconsecutive days significantly shortened the total sleep duration(P0.01),has the effect of refreshing and waking themind.ELISA results showed that compared with the control group,compound essential oil sign
11、ificantly increased DA and GLUlevels in the blood and brain of mice(P0.05,P0.05);Western blot results showed that compound essential oil signifi-cantly upregulated D1R protein levels in hippocampus,hypothalamus,prefrontal cortex and other brain tissues of mice(P0.05).In a single high-dose sniffing e
12、xperiment,compound essential oil had no significant effects on body weight,blood cell-related indexes,liver and kidney function in mice,and HE stained pathological sections showed that compound essential oilhad no pathological damage to brain,nose,lung,liver,kidney and other tissues.Results of GC-MS
13、 showed the highest contentof L-menthol(2 4.54%),f o l l o w e d b y e u g e n o l (16.2 5%),L-me n t h o l (7.7 8%),b o r n o l (7.30%),L-c a r y o p h y l l e n e(5.29%)and 1,8-eudesin(3.40%).Compound essential oils have the effect of refreshing and waking the brain in mice,and are safe for sniffi
14、ng.Its mechanism may be related to increased levels of DA and GLU in the blood and brain,and in-creased regulation of D1R protein levels in different brain regions.Key words:compound essential oil;refreshing the brain;neurotransmitter;dopamine receptor D1R;safety现代社会,繁重的工作和生活压力致使人们白天犯困、易疲劳的现象越发严重,警觉
15、度和认知功能下降是该症状的主要表现,短期服用兴奋剂类药物如咖啡因、莫达非尼等可缓解疲劳困倦,提高警觉性。但长期摄人咖啡因会引起抑郁、易怒、心律失常、焦虑、失眠等不良症状;此外,咖啡因的利尿作用也可导致运动间脱水,体温调节能力下降2 、心率加快和心脏负担3;而莫达非尼会引起头痛、恶心和血压升高等不良反应,也有潜在的成瘾性与依赖性4。因此研究开发效果好、不良反应少的提神醒脑产品显得尤为迫切。芳香疗法作为近年来兴起的一种补充替代疗法,是一种回归自然类似于整体治疗的方法。芳香疗法中所用的芳香物质或精油已有研究报道具有提神醒脑效果,如迷迭香精油、苏合香精油、薄荷精油、石菖蒲精油、冰片和柠檬精油等5。本文
16、基于芳香疗法理论为指导,选择芳香开窍的薄荷醇、丁香精油、青柠檬精油等植物精油进行组方,经鼻吸人研究自制复方精油对小鼠自主活动及睡眠的影响,评价其提神醒脑的药效。采用酶联免疫法(ELISA)、Westernblot技术检测兴奋性神经递质谷氨酸、多巴胺及其受体研究作用机制,并采用GC-MS分析复方精油化学成分,以期分析精油中可能产生兴奋作用的成分。另一方面,精油虽然具有较好的疗效,但有临床研究报道精油可能会引起不良反应6 ,为确保临床用药安全,本文还研究自制复方精油经鼻吸入对小鼠进行初步安全性研究,以期为其安全使用提供数据支撑。1材料与方法1.1动物昆明小鼠(KM,SPF),雄性,体重为2 0 2
17、 g,购天然产物研究与开发买于江西中医药大学动物科技中心,动物生产许可证号:SYXK(赣)2 0 2 2-0 0 0 2,本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准,审批号:JZLLSC20210043。动物饲养于江西中医药大学动物科技中心屏障级实验室内,昼夜12 h交替,恒温(2 22),相对湿度40%7 0%,动物统一适应性喂养1周。1.2药品及试剂复方精油,江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室提供,批号2 0 2 2 0 32 2,主要成分为薄荷醇、丁香精油、青柠檬精油等;咖啡因(批号PS11544,北京谱析科技有限公司);酒精消毒剂(南昌利康制药机械有限公司);PBS缓冲液(S
18、olarbio);多巴胺酶联免疫吸附测定试剂盒(批号H170-1-2,Andygene);谷氨酸酶联免疫吸附测定试剂盒(批号H168-1-2,Andygene);多巴胺受体D1R抗体(批号ab279713,Abcam)。1.3方法1.3.1复方精油对小鼠提神醒脑的作用研究1.3.1.1实验动物分组和给药40只昆明雄性小鼠,随机分成5组,每组8 只。实验由对照组、咖啡因组和复方精油低(2 10-7mL/cm)、中(510 mL/cm)、高剂量(8 10-7mL/cm)组,为增加精油雾化效率,采用蒸馏水对复方精油进行适当稀释。对照组每天雾化吸人等量蒸馏水,阳性药组灌胃咖啡因57 mg/kg,前期预
19、实验结果表明,复方精油雾化吸嗅给药15min后能显著提高小鼠自主活动能力,本研究选择复方精油雾化吸15min,实验时间每日8:0 0 16:0 0,1次/d。精油给药剂量=雾化器复方精油加入体积(mL)/动Vol.35Vol.35物香薰室空间体积(cm)。1.3.1.2复方精油对小鼠自主活动的影响连续给药3d,每天各给药组雾化吸人15min,休息15min后进行旷场实验。有研究表明,小鼠灌胃咖啡因后,在30 6 0 min 能达到最高血药浓度,小鼠灌胃咖啡因30 min后活动能力显著增强7 ,选择咖啡因组灌胃30 min后进行旷场实验。小鼠适应环境3min,检测5min内行为学参数:运动距离(
20、c m)、平均速度(cm/s)、休息时间占比(%)。1.3.1.3戊巴比妥钠闯上睡眠诱导实验另取30 只昆明雄性小鼠,随机分成5组,每组6 只。对照组和复方精油低、中、高剂量组小鼠均在实验第一天末次雾化吸人15min,休息15min,阳性药组灌胃咖啡因30 min后,均进行腹腔注射戊巴比妥钠阅上值55mg/kgl8。观察并记录各组小鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间,注射给药后,小鼠的翻正反射消失1 min,为人睡指标。从注射药物到翻正反射消失的时间为睡眠潜伏期,翻正反射消失至恢复的时间为睡眠持续时间,记录睡眠时间的潜伏期和睡眠时间。1.3.2复方精油对小鼠脑和血清GLU、D A 含量的影响吸嗅3d
21、,旷场实验结束后,各组小鼠摘眼球取血,后颈椎脱位处死,取出完整脑组织,PBS 缓冲液清洗,滤纸吸干。血液室温静置1h,3500r/min离心15min,取上清液血清、脑组织暂存于-8 0。按照ELISA试剂盒说明书步骤操作检测小鼠脑组织和血清中谷氨酸(glutamic acid,GLU)和多巴胺(do-pamine,DA)含量。1.3.3复方精油对小鼠脑内DA受体D1R的影响另取一批昆明小鼠按“1.3.1.2”方法重复实验,吸嗅给药第3d结束后,各组小鼠迅速颈椎脱位处死,取出全脑组织,用PBS缓冲液洗去血渍,在冰面上分离前额皮层、海马、下丘脑和其他脑组织,EP管分装存于-8 0 用于Weste
22、rnblot分析。将冷冻组织(2 0 mg)在 2 0 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH7.4、0.9%Na C l、0.5%No n id e t P40、1 m m o l/L ED-TA、12 9 m m o l/L 乙二醇四乙酸(EDTA)、1 m m o l/L苯基甲基磺酰氟、10 0 0 KIU/mL 抑肽酶和10 g/mL亮肽)中匀浆,并在冰上孵育 15 min。在12 0 0 0r/min和4下离心10 min后,使用BCA蛋白质测定试剂测量上清液的蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离上清液,然后转移到刘小金等:经鼻吸入复方精油提神醒脑的药效、作用
23、机制及初步安全性研究,接口温度为2 50。质谱条件:EI离子源,电子能量7 0 eV,离子源温度2 30,MS四极杆温度150;界面温度2 50,溶剂延迟3.0 min,质谱扫描模式全扫描,扫描范围(m/z)30650。标准谱库 NIST11 检索,采用峰面积归一化法计算各组分含量的相对百分比。1.3.55单次吸嗅复方精油对昆明小鼠安全性研究因受试药物浓度、体积和雾化效率的限制,无法测定受试药物的半数致死量,提示其安全性较高,为进一步评价其安全性,进行最大给药量试验。预实验结果显示,当复方精油浓度达到2.0 7 10 4mL/cm时,老鼠毛发湿润较严重,且该浓度下部分老鼠存在呼吸不适,可能是雾
24、气浓度过高影响老鼠正常呼吸,即以复方精油浓度2.0 7 10 mL/cm为最大给药浓度剂量。昆明小鼠雌雄各半,根据体重随机分成为雄鼠对照组(control of male mice,Con-M)、雌鼠对照组(c o n t r o l o f f e m a l e m i c e,Co n-F)、雄鼠复方精油剂量1 组(compound essential oil dose 1 of male mice,Dose1-M)、雌鼠复方精油剂量1组(compound essentialoil dose 1 of female mice,Dose 1-F)、雄鼠复方精油剂量 2 组(compound
25、 essential oil dose 2 of male mice,Dose 2-M)、雌鼠复方精油剂量2 组(compound es-sential oil dose 2 of female mice,Dose 1-F),每组 8只。复方精油剂量1和剂量2 的浓度为1.48 1593聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入一抗(D1R1:1000),然后将膜与辣根过氧化物酶缀合的次级抗体(1:2 0 0 0)孵育。转移的蛋白质用增强化学发光(ECL)底物溶液孵育,并用图像J程序(Bio-Rad,Richmond,CA,U SA)可视化。通过使用QuantityOne软件(BioRad Labora
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