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胶孢炭疽菌侵染秀丽隐杆线虫的特性研究.pdf
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1、doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.05.024胶孢炭疽菌侵染秀丽隐杆线虫的特性研究肖 月1,易杏盈1,张东华1,刘 丽1,闫晓慧1,伍建榕1,2(1.西南林业大学 生物多样性保护学院 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室,昆明 650224;2.西南林业大学 林学院 西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室,昆明 650224)摘 要 通过胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)共培养,探讨该植物病原菌对线虫基本生物学特性的影响。结果显示:胶孢炭疽菌对线虫存活率、
2、体长大小、繁殖能力等基本生物学特性产生显著影响,线虫接触胶孢炭疽菌孢子后存活率显著降低,且虫龄大小与其半数致死时间的长短直接相关,L1 期为 108 h,L4 期为 144 h;胶孢炭疽菌孢子浓度与线虫存活率呈负相关性;与胶孢炭疽菌共培养的线虫体长大小也明显变短,繁殖能力显著降低;然而,胶孢炭疽菌对线虫运动能力和咽泵速率并无显著影响。结果表明:胶孢炭疽菌对秀丽隐杆线虫可产生一定的伤害作用,具有激活线虫天然免疫系统的可能性,该炭疽菌与线虫互作体系可能成为研究天然免疫进化的有力工具。关键词 胶孢炭疽菌;秀丽隐杆线虫;存活率;体长大小;繁殖能力中图分类号 Q939.95;Q93-337文献标识码 A
3、文章编号 2095-1736(2023)05-0024-05Study on the infection of Caenorhabditis elegans by Colletotrichum gloeosporioidesXIAO Yue1 YI Xingying1 ZHANG Donghua1 LIU Li1 YAN Xiaohui1 WU Jianrong1 2 1.Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Universities of Yunnan College of Biodiversity Conserva
4、tion Southwest Forestry University Kunming 650224 China 2.Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China State Forestry Administration College of Biodiversity Forestry Southwest Forestry University Kunming 650224 China Abstract The effects of the plant pathogen on the basic biologica
5、l characteristics of Caenorhabditis elegans were studied by co-culture of C.elegans and C.gloeosporioides.The results showed that C.gloeosporioides had great impact on the survival body length and re-productive of C.elegans.The survival rate of C.elegans decreased obviously after exposing to C.gloeo
6、sporioides and the age of the worm was directly related to the half death time which was 108 h in L1 stage and 144 h in L4 stage respectively.The conidia concen-tration of C.gloeosporioides spores was negatively correlated with the survival of C.elegans.The body length of C.elegans in co-cul-ture wi
7、th C.gloeosporioides grew shorter evidently and the reproductive of C.elegans was significantly decreased.However C.gloeosporioides had no significant influence on C.elegans motility capacity and pharynx pump capacity.The results indicated that C.gloeosporioides could harm C.elegans to some extent a
8、nd might activate the innate immune system of C.elegans.The interaction sys-tem between C.gloeosporioides and C.elegans may be a powerful tool for studying the evolution of innate immunity.Keywords Colletotrichum gloeosporioides Caenorhabditis elegans survival body length reproductive 天然免疫是广泛存在于各类生物
9、体内用于对抗外来入侵物的重要防御体系,其进化地位古老且保守1。42第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.2023收稿日期:2022-08-04;最后修回日期:2022-09-23基金项目:国家重点研发计划项目(2019YFD100200X);国家自然科学基金项目(31860208);云南省教育厅项目(11070733)作者简介:肖月,硕士研究生,主要从事森林病理学研究,E-mail:1471564958 ;易杏盈,硕士研究生,主要从事森林病理学研究,E-mail:821995421 ;肖月和易杏盈为共同
10、第一作者通信作者:张东华,博士,讲师,主要从事资源微生物利用研究,E-mail:1391967127 相关膜受体、信号转导通路及下游效应物在植物、昆虫、脊椎动物和无脊椎动物中被认为是十分保守的。但哺乳动物、线虫和植物的膜受体接受信号刺激后也呈现一定的差异,哺乳动物通常会激活转录因子NF-B,而植物则激活转录因子 WRKY,线虫中未发现以上两种转录因子的同源类似物,这表明动物和植物的天然免疫可能起源于一个共同的祖先,但很早就各自独立进化2-3。油茶炭疽病是油茶种植产业中重要病害之一,引起该病的主要病原菌为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)4。胶孢炭疽菌还可
11、侵染核桃、苹果、橡胶等多种经济林树种,危害植物种类较多,严重威胁各国林业生产5。Yang 等6通过转录组分析揭示胶孢炭疽菌感染油茶在酪氨酸代谢、苯丙烷生物合成、黄酮类生物合成和异喹啉生物碱生物合成途径中显著富集。胶孢炭疽菌不是专性寄生菌,有学者已建立希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum)与拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)、胶孢炭疽菌与烟草(Nicotiana taba-cum)的互作模型7-8,由于拟南芥等植物培养周期长、实验条件控制难度大等因素制约,致病机制以及互作关系的深入研究难度较大。目前国内外对炭疽病的研究主要集中在化学防治、生物学特
12、性等方面,而关于炭疽病菌与寄主间互作关系及致病机制的分子水平研究较少,限制了该病防治技术的进一步发展9。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)具有身体透明易观察、生命周期短、已知全基因序列等优点,作为模式生物在病原致病机制等领域得到广泛应用10。其能被人类致病菌在内的大量动物病原菌以及植物病原菌感染11。因而,利用植物病原菌跨越其自然寄主作用于动物,很可能揭示出天然免疫中最保守和最古老的部分,而此部分可能成为防治该植物病原菌的广谱作用靶点。研究应用秀丽隐杆线虫评估胶孢炭疽菌对其基本生物学特性的影响,以此探寻胶孢炭疽菌诱导秀丽隐杆线虫天然免疫应答中最为保守和古老的机制。1
13、材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株及孢子菌悬液制备胶孢炭疽菌从西南林业大学病理实验室获得,经PDA 平板培养。孢子菌悬液以 PDA 液体培养基培养,接入胶孢炭疽菌后 25,180 r/min 培养 15 d,无菌纱布过滤菌丝,收集分生孢子,M9 缓冲液稀释获得相应孢子浓度,血球计数板进行孢子浓度计数12。1.1.2 线虫的培养及同步化线虫为野生型秀丽隐杆线虫(N2),采用固体线虫生长培养基(NGM),大肠杆菌 OP50 作为食物源,25 恒温培养13。M9 缓冲液收集产卵期成虫置于 15 mL 尖底离心管中,离心清洗 23 次。收集的成虫中加入 12 mL裂解液(0.5 mol/L 氢氧化
14、钠溶液和体积分数 2.5%次氯酸溶液),裂解约5 min,2 000 r/min 离心 2 min,弃上清液,M9 缓冲液反复清洗 56 次,收集管底虫卵,清洗后的虫卵置于无菌培养皿中,加入 M9 缓冲液,25 恒温孵化 1624 h,获得 L1 期幼虫,备用13。1.2 方法1.2.1 菌-虫共培养体系的建立炭疽菌与线虫培养的培养基差别较大,感染模型需兼顾二者均能较好生长,制定 4 种培养基:(1)NGM下-PDA 上双层板:培养皿底部倒一层 NGM 培养基,待凝固后再倒一薄层 PDA 培养基;(2)NGM 上-PDA 下双层板,方法同上;(3)NGM+PDA 混合平板:NGM 培养基中分别
15、加入 1/50、1/30 和 1/20 PDA 培养基;(4)NGM 平板。取相应浓度胶孢炭疽菌孢子悬浮液 200 L 均匀涂布于处理板上,超净台内吹干后加入 50 L 经离心浓缩的 OP50 菌液;以灭活的胶孢炭疽菌孢子悬浮液平板为对照组,将平板放置 25 培养箱培养2 d。对照板和处理板接入约 50 条 L1 期幼虫,每组设3 个平行,25 下恒温培养,每 12 h 进行线虫存活率测定14。1.2.2 线虫存活率测定分别将 L1 期、L4 期约 50 条线虫接种至对照组和处理组各板中,每组设 3 个平行,25 共培养,每 12 h测定线虫存活率。1.2.3 胶孢炭疽菌孢子浓度与线虫存活率关
16、系的测定分别设置 106、105、104孢子/mL 等 3 个不同浓度的孢子菌悬液,将约 50 条 L1 期线虫分别接于处理组和对照组培养板上,每组设3 个平行,每12 h 测定线虫存活率。1.2.4 胶孢炭疽菌对线虫体长大小影响的测定约 100 条 L1 期线虫置于对照组和处理组各培养板上,分别在 12、24、36、48 和 60 h 等 5 个时间点,随机挑取 15 条线虫,适量 10%福尔马林固定后,进行显微镜形态观察和体长大小的测量13。1.2.5 胶孢炭疽菌对线虫繁殖能力影响的测定线虫繁殖能力通过所产后代数目评价13。L1 期线虫在 NGM 板 25 下培养至 L4 末期,挑取一只
17、L4末期线虫放入新鲜处理板和对照板,每组处理设 3 个平行,48 h 后统计线虫后代数目15。52第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.20231.2.6 胶孢炭疽菌对线虫运动能力影响的测定将约 50 条 L1 期线虫分别接至处理组和对照组平板,25 培养 48 h,测定 1 min 内线虫头部摆动次数和身体弯曲次数,每组处理测定 15 条线虫16。1.2.7 胶孢炭疽菌对线虫咽泵速率影响的测定将 L1 期幼虫在处理板和对照板上培养,分别在48、72 和 96 h 统计线虫每分钟咽泵活动次数,每组处理测
18、定 15 条线虫17。1.3 统计学分析用 GraphPad Prism 5 进行统计分析,结果用平均值标准差表示。用 t 检验法分析组间差异,以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结果与分析2.1 菌-虫共培养体系的建立2.1.1 NGM-PDA 双层培养板无论 PDA 处于上层还是下层,胶孢炭疽菌菌丝均生长迅速,PDA 位于上层,36 h 时菌丝密布全板图 1(a);PDA 位于下层,菌丝在 48 h 时覆盖全板图 1(b),菌丝密度均过大,难以观察线虫。2.1.2 NGM+PDA 混合板在 NGM 中加入不同浓度 PDA(1/50、1/30、1/20)后,胶孢炭疽菌均处于快速生长状态,
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