酱香大曲中高温放线菌的筛选及基因组解析.pdf
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1、68 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程酱香大曲中高温放线菌的筛选及基因组解析田浩杰1,李豆南1,2,*,邱树毅1,周剑丽1,龙则河3,王珂佳1,4,刘茂强1,陈 杰1,程 度1,潘凤爽1(1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州 贵阳 550025;2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川 宜宾 644000;3.贵州省仁怀市天邦酿酒有限公司,贵州 仁怀 564500;4.贵州轻工职业技术学院轻工化工系,贵州 贵阳 550025)摘 要:通过筛菌方法的设计,从酱香型高温大曲中筛选到1 株具有嗜热特性的糖莱斯氏菌(Laceyella sa
2、cchari)FBKL4.014,并对其进行全基因组测序,测序和完成图组装结果表明L.sacchari FBKL4.014基因组序列全长3.35 Mb,GC含量48.67%,测序深度433,共预测到3 328 个蛋白编码基因。全基因组数据解析结果表明,该菌株具备进行完整的碳水化合物和氨基酸代谢潜力,进一步推断该菌株还可能具备生物合成四甲基吡嗪的潜能。本研究为高温放线菌代谢生成酱香型白酒风味物质机理提供了基因层面的数据支持,同时也为该菌株未知功能基因的挖掘和基因改造提供了数据参考。关键词:酱香型高温大曲;高温放线菌;全基因组测序;四甲基吡嗪Identification and Genome An
3、alysis of Laceyella sacchari FBKL4.014 Isolated from Moutai-Flavor DaquTIAN Haojie1,LI Dounan1,2,*,QIU Shuyi1,ZHOU Jianli1,LONG Zehe3,WANG Kejia1,4,LIU Maoqiang1,CHEN Jie1,CHENG Du1,PAN Fengshuang1(1.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy,School of Liquor and Foo
4、d Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Liquor Making Biological Technology and Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Yibin 644000,China;3.Guizhou Renhuai Tianbang Liquor Co.Ltd.,Renhuai 564500,China;4.Department of Light Industry and Chemical Engineering,Guizhou Light In
5、dustry Technical College,Guiyang 550025,China)Abstract:A thermophilic strain of Laceyella sacchari designated as FBKL4.014 was isolated from high-temperature Moutai-flavor Daqu,and its whole genome was sequenced.The results showed that the full genomic length of L.sacchari FBKL4.014 was 3.35 Mb,with
6、 a GC content of 48.67%.The sequencing depth was 433,and a total of 3 328 protein-coding genes were predicted.Strain FBKL4.014 had the potential for complete carbohydrate and amino acid metabolism,and it was further inferred that the strain may have the potential to biosynthesize tetramethylpyrazine
7、.This study provides genetic data for understanding the mechanism for the production of flavor substances in Maotai-flavor baijiu by Thermoactinomycetaceae metabolism,and also provides a reference for further research on the discovery of unknown functional genes of this strain and its genetic modifi
8、cation.Keywords:high-temperature Moutai-flavor Daqu;Thermoactinomycetaceae;whole genome sequencing;tetramethylpyrazineDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220928-319中图分类号:Q938.15 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)18-0068-09引文格式:田浩杰,李豆南,邱树毅,等.酱香大曲中高温放线菌的筛选及基因组解析J.食品科学,2023,44(18):68-76.DOI:10.7506/spkx1002-6630-202
9、20928-319.http:/收稿日期:2022-09-28基金项目:国家自然科学基金地区科学基金项目(32260581);贵州大学引进人才科研项目(贵大人基合字(2021)47号);贵州省发酵工程与白酒酿造人才基地项目(黔人领发20183号);酿酒生物技术及应用四川省重点实验室开放课题(NJ2022-06);贵州省科技支撑计划项目(黔科合支撑20202Y054);贵州省科技计划项目(黔科合基础-ZK2023一般088)第一作者简介:田浩杰(1998)(ORCID:0000-0002-2651-3627),男,硕士研究生,研究方向为食品加工与安全。E-mail:*通信作者简介:李豆南(199
10、1)(ORCID:0000-0002-9131-9783),男,讲师,博士,研究方向为酿酒工程、酿酒微生物学。E-mail:生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 69TIAN Haojie,LI Dounan,QIU Shuyi,et al.Identification and genome analysis of Laceyella sacchari FBKL4.014 isolated from Moutai-flavor DaquJ.Food Science,2023,44(18):68-76.(in Chinese with English abstract)DOI:
11、10.7506/spkx1002-6630-20220928-319.http:/“曲乃酒之骨”,酱香型高温大曲在发酵条件下富集了丰富的功能微生物,在生产过程中为整个酱酒酿造体系提供了微生物、酶系、风味及其前体物1-3。其独特的微生物群落结构对酱香型白酒的酒体风味形成有重要影响。研究表明,细菌类群在酱香大曲中具有举足轻重的作用4,诸如厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门为酱香大曲中的优势细菌类群5-6,其中,芽孢杆菌已经被证实与酱香风味产生密切相关,是乙酸乙酯、异戊醇、糠醇及吡嗪类物质等的重要来源7-9。高温放线菌是一类革兰氏阳性、化能异养的微生物类群,能够在极端环境下生存和繁殖10,能代谢
12、产生酯化酶、淀粉酶、磷酸酶等多种酶和风味及其前体物8。该菌在酱香型白酒酿造体系中属于一类具有重要应用潜力的微生物资源,其在白酒酿造体系中的功能尚不清楚,有待进一步研究确定。近年来,随着微生物多样性分析技术的发展,越来越多的研究表明高温放线菌为高温大曲中的优势细菌类群6,11-12,这也说明高温放线菌在酱香型白酒酿造体系中具有重要的潜在功能。随着可培养技术的进步,针对酿造体系内高温放线菌未培养菌种资源的开发也逐步开展。王芙蓉13和白成松14等分别从酱香大曲和酒糟中分离鉴定了高温放线菌,并对其功能特性进行了初步研究,证实其与淀粉、纤维素、蛋白质的降解存在关联。本课题组在前期研究中也成功建立了一种从
13、酱香大曲中分离、筛选高温放线菌的方法,从酱香型大曲中分离鉴定了多株高温放线菌,证实这些菌株具有良好的产吡嗪风味组分能力,并对其代谢产吡嗪的途径及机理进行解析15-16。这些工作的开展有助于发掘酱香大曲中高温放线菌的功能和应用价值,为后续高温放线菌功能特性的确定与挖掘奠定了基础。基于课题组前期的工作,本研究对酱香型高温大曲中的高温放线菌进行分离筛选,结合多相分类学技术进行菌株鉴定,并利用第二代Illumina和第三代PacBio结合的测序技术对所筛选菌株进行全基因组测序,从基因组层面解析其潜在的代谢功能特性,分析该菌株代谢典型风味组分的潜在机理,旨在为今后继续深入解析高温放线菌类群微生物产风味物
14、质,特别是四甲基吡嗪的生物合成代谢途径及机理提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂酱香大曲来源于贵州省茅台镇某酿酒企业。为保证样品的代表性,所有样品均在白酒酿造车间取粉碎后待投料的陈曲粉,并于曲堆中随机取20 个样品混匀包装,保存于4 冰箱备用。细菌基因组DNA提取试剂盒 美国Biomiga公司;制霉菌素、新生霉素、琼脂糖、Tris、EDTA-2Na 北京索莱宝科技有限公司;聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)引物 上海派森诺生物科技有限公司;D4030A dNTP、DRR20AM LA TaqTM聚合酶 宝生物工程(大连)有限公司;061180琼脂
15、糖 生工生物工程(上海)股份有限公司;其他化学试剂均为国产分析纯。分离筛选培养基17:葡萄糖1 g、蛋白胨0.5 g、胰蛋白胨0.3 g、氯化钠0.5 g、复合维生素2.75 mg(包括VB1、VB2、VB3、VB5、VB6各0.5 mg,VB7 0.25 mg)、琼脂 20.0 g、蒸馏水1 000 mL,pH 7.27.4,121 灭菌20 min。ISP2培养基(用于菌株纯化、保藏):酵母膏4 g、麦芽汁10.0 g、葡萄糖4.0 g、琼脂20.0 g、蒸馏水1 000 mL,pH 7.07.2,121 灭菌20 min。液体培养基:葡萄糖10 g、小麦浸出物20 mL、氯化钠5 g、磷
16、酸氢二钾4 g、磷酸二氢钾2 g、七水硫酸镁0.5 g、蛋白胨4 g、蒸馏水1 000 mL,pH 7.07.2,115 灭菌30 min。1.2 仪器与设备高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司;核酸凝胶电泳仪、凝胶成像仪 德国耶拿分析仪器股份公司;S-3400N型扫描电子显微镜 日本日立公司;旋涡振荡器 江苏省海门市麒麟医用仪器厂;超净工 作台 江苏净化设备有限公司;Illumina NovaSeq 5000测序平台、Pacbio Sequel第三代单分子实时测序系统 美国Thermo公司。1.3 方法1.3.1 高温放线菌的分离筛选参考李豆南等15的方法对酱香型高温大曲中的高温放线菌进
17、行分离筛选。1.3.2 菌种鉴定1.3.2.1 菌株形态学观察鉴定将分离到的菌株接种于ISP2固体培养基上,于45 恒温培养箱中倒置培养3 d后分别从菌落形态、基内菌丝、气生菌丝颜色及可溶性色素产生情况等方面观察并记录实验结果,同时经菌株插片培养后,制片于扫描电子显微镜下观察其菌丝体及孢子结构特征,并根据伯杰氏细菌鉴定手册完成菌株形态学鉴定。70 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程1.3.2.2 菌株温敏性分析将菌株分别置于30、37、45、50、55、60 培养箱中培养48 h,观察菌株生长状况。1.3.2.3 菌株生理生化鉴定分别设计明胶液化、碳源利用、牛奶凝固与胨化、
18、淀粉水解、硝酸盐还原和纤维素降解等生理生化实验,观察菌株的生理特性。1.3.2.4 菌株分子生物学鉴定参考李豆南等15方法对分离筛选出的菌株进行分子生物学鉴定。1.3.3 菌株全基因组测序及序列分析1.3.3.1 菌株基因组DNA提取及测序文库构建菌株FBKL4.014接种于100 mL液体培养基中,45 培养24 h后,使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,操作步骤参照试剂盒说明书,并对抽提的样品进行检测。使用紫外分光光度计,分别在260 nm和280 nm波长处测定DNA的吸光度,并通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量。1.3.3.2 全基因组测序完成图、组装及数据质控
19、分析菌株FBKL4.014的全基因组测序委托上海派森诺生物科技有限公司完成,提取的基因组经质检合格达到测序要求后,利用第二代Illumina NovaSeq和第三代PacBio Sequel结合的测序技术进行完成图测序。制备好的二代测序文库在Illumina HiSeq测序平台上进行双端测序(2150 bp),测序深度433,三代测序文库在PacBio Sequel测序平台上进行单分子测序。Illumina NovaSeq测序原始数据以双端(Paired-end)FASTQ格式保存,并对下机数据过滤,采用Adapter Removal去除3端接头污染,采用SOAPec基于Kmer频率对所有原始
20、reads进行质量校正。利用HGAP和Canu软件对PacBio下机数据进行拼装,并用二代的高质量数据通过pilon软件对三代contig结果进行校正,最终拼接得到完整序列。1.3.3.3 基因预测及功能注释分析利用Glimmer 3.02对基因组中的基因进行预测18。分别使用TRNAscan-SE19、Barrnap20、Rfam21等软件进行tRNA、rRNA和ncRNA预测。成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)通过CRISPR识别工具进行鉴定22。基因功能注释通过
21、BLAST将菌株预测的基因序列结果分别与非冗余(Non-Redundant,NR)蛋白质数据库23、基因本体论24(Gene Ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书25(Kyoto Encycolpedia of Gene and Genomes,KEGG)、直系同源聚类群26(Cluster of Orthologous Groups,COG)、欧洲蛋白质数据库Swiss-Prot27、碳水化合物活性酶28(Carbohydrate-Active Enzymes,CAZy)数据库进行比对,得到相应的基因功能注释结果,采用CGView(http:/stothard.afns.ual
22、berta.ca/cgview_server/)绘制基因组圈图。通过KEGG数据库对碳水化合物代谢和氨基酸代谢途径进行挖掘。2 结果与分析2.1 菌株分离筛选及鉴定2.1.1 菌株的形态学特征从 酱 香 高 温 大 曲 中 分 离 得 到 1 株 纯 种 菌 株FBKL4.014,根据菌落形态特征初步判断其可能归属于高温放线菌,并保藏于贵州省发酵工程与生物制药重点实验室。菌株宏观形态学观察结果显示(图1A),该菌株长势良好,在培养基正反两面表现出的生长趋势不同,菌落总体呈缺刻圆状、突起、有较多皱褶、质地干燥致密,基内菌丝呈浅黄色,气生菌丝呈乳白色且较为发达,无可溶性色素产生,该菌株的菌落形态具
23、有高温放线菌培养的典型特征。高温放线菌FBKL4.014的微观形态特征如图1B所示,结合伯杰氏细菌鉴定手册29分析,发现其菌丝体较短,形状不一且黏在一起呈簇状,呈圆球形的分生孢子直接着生于菌丝体上,分布于菌丝体两侧,其中有分支的孢子梗长度较短。10 mm10.0 m20.0 kV9.4 mm?5.00 kAB图 1 菌株FBKL4.014菌落形态学观察(A)及微观形态学特征(15 000)(B)Fig.1 Colonial morphology(A)and micromorphological characteristics(15 000)(B)of strain FBKL4.0142.1.2
24、 菌株的最适生长温度表1结果表明,菌株FBKL4.014在4550 条件下生长最旺盛,在5560 高温范围内仍能够缓慢生长,37 时该菌株能正常生长,但在30 时不生长。Wang Xueshan等30和颜林春31的研究表明高温放线菌属大多可以生长在最高温度可达6065 的高温发酵环境中,因此,菌株FBKL4.014在耐热性方面与高温放线菌具有很高的相似度,而这也与其分离环境酱香大曲的高温发酵环境密切相关。表 1 菌株FBKL4.014生长温度范围的确定Table 1 Determination of growth temperature range for strain FBKL4.014菌株
25、编号生长状况30 37 45 50 55 60 FBKL4.014注:.不生长;.生长缓慢;.生长良好;.生长旺盛。生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 712.1.3 菌株的生理生化特征生理生化分析(表2)表明,高温放线菌FBKL4.014为革兰氏阳性菌,该菌株可将硝酸盐还原为亚硝酸盐,并能使牛奶凝固但不胨化,使明胶产生液化现象,同时该菌株能水解淀粉和纤维素,由此推测该菌株能够代谢产生淀粉酶和纤维素酶,具备将大分子原料降解为可发酵性糖的潜能,有助于推动整个酿造过程的顺利进行。碳源利用实验结果显示,该菌株能够有效利用葡萄糖、海藻糖、D-棉子糖、D-甘露醇和D-山梨醇等碳源进行
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