姜黄素在冠心病中对血小板活性的影响.pdf

7018 Dsa B,Aya B,Csa B.Autonomous regulation of inducible ni-tric oxide synthase and cytochrome P450 2E1-mediated oxida-tive stress in maneb-and paraquat-treated rat polymorphsJ.Pestic BiochemPhysio,2021,28(11):810-816.19 Wu F,Ding J,Li HB,et al.Effects of Electroacupuncture onExpression of D1 Receptor(D1R),Phosphorylation of Extra-cellular-Regulated Protein Kinase 1/2(p-ERK1/2),and c-心血管康复医学杂志2 0 2 4年2 月第33卷第1期ChinJCardiovascRehabilMed,February2024，V o l.33No.1Fos in the Insular Cortex of Ketamine-Addicted Rats J.Med Sci Monit BasicRes,2019,25(9):1022-1028.2 0 陈宜锋，林璐，张厚静，等：达格列净联合常规心力衰竭治疗方案的药物经济学评价J：中国现代应用药学，2 0 2 2，39(16):2151-2155.（收稿日期：2 0 2 3-0 331)姜黄素在冠心病中对血小板活性的影响夏勇，陈春玲摘要：目的：研究姜黄素（Cur）在冠心病中对血小板活性的影响。方法：40 只Wistar雄性大鼠被随机均分为正常组、模型组（饲喂高脂饲料）、阿司匹林组（模型组基础上加用阿司匹林）与Cur组（模型组基础上加用Cur）。比较各组血小板聚集率，CD62p、PA C-1荧光强度及阳性率，血浆血小板球蛋白（-TG)、血小板因子4（PF4）水平，磷酸化p38MAPK（p-p 38 M A PK）、磷酸化JNK（p-JNK）蛋白表达水平。结果：与正常组比较，模型组使用AA、A D P诱导的血小板聚集率，CD62p、PA C-1荧光强度及阳性率，血浆-TG水平，P-p38MAPK、P-JNK 蛋白表达水平均显著升高（P0.05或 0.0 1）。与正常组、模型组比较，阿司匹林组、Cur组上述指标除CD62p阳性率外，Cur组CD26p阳性率均显著降低（P0.05或 0.0 1）。与模型组比较，阿司匹林、Cur组CD26p阳性率均显著降低（P均=0.0 0 1）。与阿司匹林组比较，Cur组使用AA（51.0 37.39%比（38.434.0 4)%、A D P（52.32 6.43）%比（40.8 15.52）%诱导的血小板聚集率，CD62p、PA C-1荧光强度CD62p：（53.8 7 7.42）比（43.92 5.45），PAC-1：（59.398.0 1）比（42.437.39)及阳性率CD62p：(49.675.93)%比(40.36 5.8 3)%，PAC-1:（50.37 5.8 3)%比（41.446.2 9)%，p-p38MAPK(1.0 10.05）比（0.7 90.0 1)】、P-JNK（1.0 7 0.0 3）比（0.7 40.0 2)蛋白表达水平均显著降低（P0.05或0.01）。结论：姜黄素可降低血小板活性，抑制p38MAPK和JNK信号活化。关键词：冠心病；姜黄素；血小板聚集文章编号：10 0 8-0 0 7 4（2 0 2 4）0 1-7 0-0 5Doi:10.3969/j.issn.1008-0074.2024.01.15Influence of curcumin on platelet activity in coronary heart disease/XIA Yong,CHEN Chun-ling/Departmentof Clinical Laboratory,Affiliated Hospital of Xiangnan University,Chenzhou,Hunan,423000,ChinaCorresponding author:CHEN Chun-ling,E-mail:Abstract:Objective:To study influence of curcumin(Cur)on platelet activity in coronary heart disease.Methods:Atotal of 40 Wistar male rats were randomly and equally divided into normal group,model group(high-fat diet),as-pirin group(received aspirin based on model group)and Cur group(received Cur based on model group).Plateletaggregation rate,fluorescence intensity and positive rate of CD62p and PAC-1,plasma levels of-thromboglobu-lin(-TG)and platelet factor 4(PF4),expression levels of p-p38MAPK and p-JNK were compared among allgroups.Results:Compared with normal group,there were significant rise in AA,ADP-induced platelet aggrega-tion rates,fluorescence intensity and positive rate of CD62p and PAC-1,plasma levels of-TG and PF4,proteinexpression levels of p-p38MAPK and p-JNK in model group(P0.05 or0.01).Compared with normal groupand model group,there were significant reductions in above indexes except CD62p positive rate in aspirin group andCur group and CD26p positive rate in Cur group(P0.05 or0.01).Compared with model group,there were sig-基金项目：郴州市科学技术局科技发展计划项目（zdyf201852）作者单位：湘南学院附属医院检验科，湖南郴州42 30 0 0通讯作者：陈春玲，E-mail：c c l12 0 2 0 12 0 12 6.c o m中图分类号：R541.4文献标识码：A心血管康复医学杂志2 0 2 4年2 月第33卷第1期ChinJCardiovascRehabil Med,February2024，V o l.33No.1nificant reductions in positive rates of CD26p in aspirin group and Cur group(P=0.001 both).Compared with as-pirin group,there were significant reductions in AA (51.0 3 7.39)%v s.(38.43 4.0 4)%,A D P-i n d u c e dplatelet aggregation rates (52.326.43)%vs.(40.81 5.52)%,fluorescence intensity CD62p:(53.877.42)vs.(43.925.45),PAC-1:(59.398.01)ys.(42.437.39)J and positive rate CD62p:(49.675.93)%vs.(40.365.83)%,PAC-1:(50.375.83)%vs.(41.44 6.29)%J of CD62p and PAC-1,protein expressionlevels of p-p38MAPK (1.01 0.05)vs.(0.79 0.01)and p-JNK (1.07 0.03)vs.(0.74 0.02)J in Curgroup(P0.05 or0.01).Conclusion:Cur can decrease platelet activity and inhibit p38MAPK and JNK signal ac-tivation.Key words:Coronary disease;Curcumin;Platelet AggregationSupported by fund project:Chenzhou Science and Technology Bureau science and technology development plan pro-ject(zdyf201852)血小板是最小的血细胞，其在维持血管壁的完整性、止血和伤口愈合等过程中起重要作用。血小板在一般情况下是处于静默状态，而血小板活化后可以产生大量的细胞因子和趋化因子，从而产生多种免疫效应及调节功能。此外，有研究显示，血小板不仅与肿瘤的进展密切相关2 ，也与肿瘤患者的预后息息相关3。生理条件下，血管损伤部位的血小板活化促进凝血，但血小板数量显著增加或血小板过度活化可导致血栓形成4，导致和促进多种疾病的发生和发展5。冠心病（CHD）是一种发病率和死亡率较高的临床常见的心血管疾病。血小板功能亢进在CHD的发生、进展、转归中具有重要作用。当血小板受到外界刺激时可发生聚集、黏附和释放反应，进而产生血栓，而后者则与CHD的发生、发展密切相关。抗血小板药物是临床上常用的抗血栓药6 ，但其在影响血小板功能的同时也会伴随出血时间延长等副作用。因此，寻找更安全的抗血小板物质从而抑制血小板过度活化对血栓的治疗具有重要意义。姜黄素（curcumin，Cu r）是姜黄属根茎的主要有效成分，其具有降血脂、抗凝、抗氧化以及抗炎等功效7 。已有研究证明 Cur 且有改善多种疾病的作用，包括过敏性鼻炎和哮喘8.91，但姜黄素对CHD中血小板功能的调节作用尚未有报道。因此，本研究主要探讨了 Cur 对 CHD大鼠血小板活化和聚集功能的影响及其相关机制研究。1资料与方法1.1材料与仪器Cur（纯度9 9%）、花生四烯酸（AA）和二磷酸腺苷（ADP）均购自美国Sigma公司，异硫氰酸荧光素（FITC）P选择素（CD62p）和藻红蛋白标记的血小板-1（Phycoerythrin-Platelet-ac-71tivating-factor-1，PE-PA C-1）荧光素标记的单克隆抗体及阴性对照试剂IgG1FI T C 和藻红蛋白标记的免疫球蛋白G（Im m u n o g l o b u l i n G-Ph y-coerythrin，Ig G PE）（美国SandCruz公司），血小板球蛋白（-TG）和血小板因子4（PF4）试剂盒（深圳欣博盛生物）；血小板聚集分析仪（中国南京桢宏通工贸），流式细胞仪（EPCICS ELITE，美国），荧光酶标仪（瑞士TECAN）。1.2方法1.2.1大鼠分组及饲养：将40 只清洁级Wistar雄性大鼠（2 50 30 0 g）分别分为正常组、模型组、Cur组和阿司匹林组。正常组大鼠每天饲喂基础饲料并按10 ml/kg体重标准以生理盐水灌胃，剩余各组饲喂高脂饲料，模型组大鼠按10 ml/kg体重标准以生理盐水灌胃，阿司匹林组和Cur组大鼠分别灌胃阿司匹林悬液和Cur悬液，标准均为2 5mg/kg体重。1.2.2分离血小板：麻醉上述4组成年Wistar大鼠，并通过心脏穿刺抽血，并以9：1的比率将其分别收集在含有肝素钠（10 0 0 单位/ml）作为抗凝剂的塑料管中。通过在室温下将血液以30 0 0 r/min离心8 min来获得富含血小板的血浆（PRP）。1.2.3测定血小板聚集率：使用血小板聚集分析仪测定血小板聚集率。使用计算机化双通道在37 进行PRP聚集。分别从上述制备好的4组血小板悬浮液中各取0.45ml（血小板浓度调整为1.510 ml）进行血小板聚集功能的检测。通过添加激动剂（0.7 5m m o l的AA或40.0 g/ml的ADP）来引发血小板聚集。数据表示为血小板的聚集率。1.2.4测定血小板活性：分别从上述制备好的4组血小板悬浮液中各取0.45ml（血小板浓度调整为1.510/ml）进行血小板活化功能的检测。将血小板悬液以30 0 0 r/min离心10 min；加人磷酸盐缓冲液（PBS）10 0 l；分别于各管加人CD62p、活化的72GPIIb/IIIa复合物（PAC1）抗体及阴性对照IgG1-FITC、I g G-PE各10 l，放置10 min；加人1%草酸胺溶液2 ml，以溶解血小板。放置10min。30 0 0 r/m in 离心10 min，去上清液。加人PBS后，上流式细胞仪检测。1.2.5检测血浆细胞因子（-TG和PF4)：分别从上述制备好的4组血小板悬浮液中各取少量血小板悬液进行离心，然后取上清液用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血浆-TG和PF4水平。操作步骤按说明书进行。1.2.6免疫印迹法：分别从上述制备好的4组血小板悬浮液中各取少量血小板悬液离心去上清液，沉淀的血小板回收用于提取血小板细胞总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）方法蛋白定量后，总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS一PAGE)，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭1.5h后，加相应一抗，4孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min，加人二抗，室温摇床孵育1.5h后TBST洗膜3次后化学发光自显影（ECL），最后放入成像系统完成显影。Western条带用ImageJ分析灰度。1.3统计学分析采用SPSS20.0软件，符合正态分布的计量资料以均数土标准差（x土s）表示，比较采用t检验，计数资料以百分率表示，比较采用检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组使用不同激动剂的血小板聚集率比较与正常组比较，模型组使用AA、A D P的血小板聚集率均显著升高，阿司匹林组、Cur组使用AA、A D P的血小板聚集率均显著降低；与模型组比较，阿司匹林组、Cur组使用AA、A D P的血小板聚集率均显著降低，且Cur组上述指标降低更显著（P0.05或 0.0 1)。见表1。2.2各组血小板活化指标比较与正常组比较，模型组CD62p、PA C-1荧光强度及阳性率均显著升高，阿司匹林组、Cur组PAC-1荧光强度及阳性率，阿司匹林组CD62p荧光强度，Cur组CD62p荧光强度及阳性率均显著降低；与模型组比较，阿司匹林组、Cur组CD62p、PAC-1荧光强度及阳性率均显著降低；且 Cur组上述指标降低更显著（P0.05或 0.0 1）。见表2、3。心血管康复医学杂志2 0 2 4年2 月第33卷第1期ChinJCardiovascRehabilMed,February2024，V o l.33No.1使用ADP的血小板组别聚集率（%）正常组63.43 6.63模型组78.43 9.324阿司匹林组51.03 7.3944Cur组38.43 4.04#F/P58.046/0.001P1:20.001P1:30.002P1:40.001P2:30.001P2:40.001P3:40.002注：Cur:姜黄素，AA：花生四烯酸，ADP：二磷酸腺苷。与正常组比较P0.05.P 0.0 1；与模型组比较AP0.05，A P0.01；与阿司匹林组比较#P0.05，#P 0.0 1。P1:2 表示正常组与模型组比较，余类推。表2 各组 CD62p、PA C-1荧光强度比较(xs)组别PAC-1正常组71.43 5.59模型组83.75 8.424阿司匹林组53.87 7.424A 4Cur 组43.92 5.45#F/P67.685/0.001P1:20.002P1:30.001P1:40.001P2:30.001P2:40.001P3:40.013注:Cur:姜黄素，CD62p:P选择素，PAC-1:活化的GPIIb/IIIa复合物。与正常组比较P0.05,P 0.0 1；与模型组比较 P0.05,P0.01;与阿司匹林组比较#P0.05，#P 0.0 1。P1:2表示正常组与模型组比较，余类推。2.3各组血浆细胞因子水平比较与正常组比较，模型组血浆-TG、PF4水平、阿司匹林组及Cur组血浆PF4水平均显著升高，阿司匹林组、Cur组血浆-TG水平均显著降低；与模型组比较，阿司匹林组、Cur组血浆-表1各组使用不同激动剂的血小板聚集率比较(x土s)使用AA的血小板聚集率（%）63.54 3.4472.13 7.83452.32 6.4340.81 5.524A#51.100/0.0010.0150.0010.0010.0010.0010.001CD62p70.43 6.3879.94 7.5459.39 8.0144442.437.3944#47.971/0.0010.0310.0100.0010.0010.0010.001心血管康复医学杂志2 0 2 4年2 月第33卷第1期ChinJCardiovascRehabil Med,February2024，V o l.33No.1TG水平均显著降低（P0.05或 0.0 1）。见表4。表3各组CD62p和PAC-1阳性率比较（xs）CD62p 阳性率PAC-1阳性率组别(%）正常组53.94 6.46模型组67.47 7.54阿司匹林组49.67 5.9344Cur组40.36 5.83#F/P30.289/0.001P1:20.001P1:30.463P1:40.001P2:30.001P2:40.001P3:40.014注：Cur：姜黄素，CD62p：P选择素，PAC-1：活化的GPIIb/IIIa复合物。与正常组比较P0.05,P 0.0 1；与模型组比较 PP0.01;与阿司匹林组比较#P0.05，#P 0.0 1。P1:2表示正常组与模型组比较，余类推。表4各组血浆细胞因子水平比较（x土s)组别-TG(ug/L)正常组5.78 1.01模型组7.34 1.324阿司匹林组4.01 1.294Cur组4.21 0.9744F/P17.983/0.001P1:20.023P1:30.008P1:40.022P2:30.001P2:40.001P3:40.980注：Cur：姜黄素，-TG：血小板球蛋白，PF4：血小板因子4。与正常组比较P0.05，P 0.0 1；与模型组比较 P0.05P0.01。P1:2 表示正常组与模型组比较，余类推。2.4各组信号活化指标比较与正常组比较，模型组磷酸化p38促分裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、磷酸化c-JUN末端激酶（JNK）蛋白表达水平均显著升高；与模型组比较，阿司匹林组、Cur组磷酸化p38MAPK、磷酸化JNK蛋白表达水平显著降低；且Cur组上述指标降低更显著（P均=0.0 0 1)。见图1、表5。73模型组正常组阿司匹林组Cur组p38MAPKP-p38MAPK(%)58.42 6.7369.34 7.17450.37 5.834441.44 6.29#33.095/0.0010.0030.0430.0010.0010.0010.021PF4(g/L)4.82 1.7316.29 3.9314.21 4.8713.93 3.82418.368/0.0010.0010.0010.0010.6090.5070.998JNKp-JNK-actin图1Cur对p38MAPK和JNK信号活化的影响注：Cur：姜黄素，p38MAPK：p 38 促分裂原活化蛋白激酶，JNK：-JU N末端激酶，P-p38MAPK：磷酸化p38MAPK，p-JNK：磷酸化JNK。表5各组p38MAPK和JNK信号活化比较（x土s）组别p-p38MAPK正常组1.320.02模型组1.63 0.1344阿司匹林组1.01 0.05444Cur 组0.79 0.0144#F/P269.933/0.001Pi:20.001Pi:30.001P1:40.001P2:30.001P2:40.001P3:40.001注：Cur：姜黄素，p38MAPK：p 38 促分裂原活化蛋白激酶，JNK：c-JUN末端激酶。与正常组比较P0.05,P 0.0 1;与模型组比较 P0.05P0.01；与阿司匹林组比较#P0.05，#P0.01。P1:2 表示正常组与模型组比较，余类推。3讨 论CHD是一种常见的血栓栓塞性疾病。血小板的过度活化、相互黏附以及聚集成团是血栓栓塞性心脑血管疾病发生发展过程中的重要环节。血小板聚集增加和过度活化是导致血栓形成的重要因素10 。因此，抑制血小板活性是预防血栓形成的重要方法。药物治疗是目前为止抑制血小板活性较为有效的方法。当前，最广泛使用的抗血小板治疗药物主要是阿司匹林和氯吡格雷（ADP受体拮抗剂），这两者主要抑制血栓素A的产生，从而抑制血小板的活性。然而，对这些药物的耐药性以及诸如胃肠道并P-JNK1.26 0.031.47 0.1741.07 0.034440.74 0.02A#123.516/0.0010.0010.0010.0010.0010.0010.00174发症、中性粒细胞减少和血小板减少性紫癜的副作用11-14，让其对许多患者的治疗效果欠佳。因此，寻找替代、天然和安全的血小板抑制物至关重要。姜黄是常用的活血化瘀中药之一，其发挥作用的有效成分为 Cur。目前对 Cur 的研究主要集中在抗炎、抗过氧化、抗自由基作用15.16 ，而对血小板的作用研究较少。本研究发现 Cur 和阿司匹林一样均能显著抑制由AA和ADP诱导的血小板聚集及血小板的活化，且其抑制作用在一定程度上要强于阿司匹林。该研究结果与Zhangl17和 Srzvastava18的研究结果相似。两人分别发现Cur 能对老鼠和兔子的血小板聚集功能起到抑制作用。-TG和PF4是存在于血小板颗粒中的特异性稳定蛋白，是体内血小板释放的特异性指标。两者的增高反映血小板释放功能增强，常见于各种血栓栓塞性疾病及血栓前状态。-TG可以使内皮细胞合成前列环素减少，而PF4可以使膜磷脂及AA代谢增强，产生血栓素A2，从而促进血小板聚集19。而本研究发现，与模型组相比，Cur组血浆-TG水平显著降低。血小板中有几条经典的信号转导通路，其中MAPK就是其中较为重要的一条。而JNK和p38MAPK通路又是MAPK通路中至关重要的2 条通路，其在不同的应激反应（例如血小板活化）中发挥重要的作用。有研究显示p38MAPK和JNK的磷酸化水平对血小板活化有调节作用2 0 。而在本研究中，Cur组磷酸化JNK和p38MAPK蛋白表达水平均显著低于模型组。这提示Cur可能通过下调p38MAPK和JNK的磷酸化水平而抑制血小板的活化。综上，Cur可以抑制血小板的活性，对其功能具有调节作用，主要表现为降低血浆-TG和 PF4水平，抑制血小板p38MAPK和JNK信号蛋白活化，这可能也是Cur预防和治疗血栓形成的重要机制之一。参考文献：1刘美描，黄林喜，余雪涛危重病人血小板水平与预后的研究J.海南医学，2 0 0 6，17（1)：9-10.2J Liu CH,Gong P,Yang J.Relationship between circulatingtumor cells and coagulation factors in primary lung cancer pa-tients J.Chinese JOncology,2016,38(5):368-371.3 Gonzalez Barcala FJ,Garcia Prim JM,Moldes Rodriguez M,etal.Platelet count:Association with prognosis in lung cancer心血管康复医学杂志2 0 2 4年2 月第33卷第1期ChinJCardiovascRehabilMed,February2024，V o l.33No.14 Michal B,Malgorzata D,Joanna R,et al.Platelets miRNA as aPrediction Marker of Thrombotic Episodes J.Dis Markers,2016,2016:2872507.5 Stalker TJ,Newman DK,Ma P,et al.Platelet Signaling J.Handb Exp Pharmacol,2012,3（2 10):59-8 5.6 Fintel DJ.Oral antiplatelet therapy for atherothrombotic dis-ease:overview of current and emerging treatment options J.Vasc Health Risk Manag,2012,8:77-89.7 Han T,Mi HM.Research 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