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纤维素科学与技术 2024,32(1):28-38 Journal of Cellulose Science and Technology E-mail: https:/ 功能化细菌纤维素纳米晶复合聚氨酯医用抗菌涂层的功能化细菌纤维素纳米晶复合聚氨酯医用抗菌涂层的 制备及性能研究制备及性能研究 杨惠仪1，张栗杨1，丁 蒙1，贺 玮1，谢亚杰2，乔 堃2，郑裕东1*（1.北京科技大学 材料科学与工程学院，北京 100083；2.北京中杰瑞康科技有限公司，北京 100094）摘 要：植入医疗器械的感染是临床治疗的难题之一，因此研究具有长效稳定抗菌效果的医用涂层对于医疗植入器械领域十分重要。本研究使用细菌纤维素膜片，通过粉碎氧化法制备氧化改性细菌纤维素纳米晶体，并化学接枝阳离子化合物双胍制备获得新型纳米抗菌材料 NBC-BG，最后与聚氨酯（PU）进行复合制备了 PU-NBC-BG 医用抗菌涂层。通过多种材料表征手段，研究了不同比例添加下涂层的结构性能变化，同时通过抗菌实验证明了 PU-NBC-BG 涂层具有优良且稳定的抗菌性能以及抗生物膜效果，在医疗器械领域具有很好的前景。关键词：细菌纤维素纳米晶；双胍；长效抗菌；医用涂层 中图分类号：TQ352.79 文献标识码：A 文章编号：1004-8405(2024)01-0028-11 DOI:10.16561/ki.xws.2024.01.12 器械相关感染（DRIs）1-3是指细菌在医疗器械以及医用植入体表面吸附并增殖从而引起的医学感染现象。DRIs 对于患者的生命健康安全存在巨大的隐患。通过大量预防手段如增加更换次数对短期使用的医疗器械以及医疗用具进行处理可以降低感染风险，但成本压力大幅增加。而对于医学植入物而言，这仍是巨大难题。虽然无菌手术以及手术室的改进降低了植入物早期感染的频率，但是手术后延迟感染无法减少，并且进一步发展引发严重的问题。研究认为这种后期感染是由血管系统中浮游的细菌引起的。细菌孢子落在未完全愈合的伤口中或附着在植入物的表面，繁殖并且进一步形成细菌生物膜，最终导致感染。游离细菌群落在植入物表面粘附并快速繁殖，会迅速分泌胞外多糖基质，保护它们抵御抗生素类药物以及宿主的免疫系统攻击2-4。因此抗生素类药物治疗难以彻底治愈与清除DRIs 相关的感染。防止细菌最初在医疗器械和医用植入物表面附着以及繁殖是减少 DRIs 现象发生的方法。在医疗器械以及医用植入物表面构建抗菌层一方面要求其能够减少细菌的附着以及对附着的细菌进行抑制或杀灭，另一方面抗菌层要尽量不影响原本医用器具的相关性能，同时具有优良的生物相容性，对人体细胞、血液等不产生不良影响。很 收稿日期：2024-02-29 基金项目：国家自然科学基金（52273119，51973018）；北京市科委项目（Z191100002019017）；北京市自然科学基金（2222067,L222035）；北京科技大学 2022 年度研究生教育教学改革面上项目（2023JGC004）。作者简介：杨惠仪（1997），女，博士研究生；研究方向：生物医用高分子材料。 张栗杨（2000），女，硕士研究生；研究方向：生物医用高分子材料。zly_ 丁 蒙（1996），男，硕士研究生；研究方向：生物医用高分子材料。 三位作者对本文同等贡献。*通讯作者：郑裕东（1966），女，教授，博士；研究方向：生物医用高分子材料制备、改性及应用。 少一部分已知的聚合物能够杀死细菌5-8以及防止细菌粘附9-12，但是由于材料自身的性质以及考虑应用因素，比如材料的强度以及韧性，这些聚合物通常不适合作为制造医用设备的原始材料，往往作为其他聚合物表面的抗菌涂层使用。低分子量的分子和一些无机离子已知在溶液中具有抗菌效果。与杀菌聚合物不同，这类抗菌成分不能够直接涂覆在医用器具的表面，因为这些成分往往与表面或者与内部网络结合力太弱，在使用过程中会迅速释放消失。因此低分子量的抗菌物质想要用于抗菌涂层的组建往往采用的策略有两种，一是构建释放型的载抗菌成分涂层结构，当细菌准备侵染医疗器具表面时释放、拦截、抑制细菌的滋生；二则是通过化学作用，将抗菌成分共价接枝在涂层表面或者内部结构中，用来防止细菌在医疗器具表面粘附增殖。这种方法从理论上能够更长久，更高效。对于抗菌涂层的构建中，需要考虑的因素众多，包括抗菌成分的性质、涂层基体性质、涂层内部作用以及涂层与外部医用器具的作用。胍类化合物作为另外一种常用的阳离子抗菌化合物，在生物医药中具有广泛的研究以及应用。聚六甲基双胍（PHMB）是胍类化合物作为抗菌聚合物的典型物质，发挥其抗菌性能的关键在于其所杨惠仪等：功能化细菌纤维素纳米晶复合聚氨酯医用抗菌涂层的制备及性能研究 29 包含的胍基基团，因此小分子胍化合物、胍类衍生物以及其聚合物都可以被用来作为抗菌的有效成分。胍类化合物具有广谱抗菌的性能，能够有效的对抗革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌，一些真菌和原生生物13。在 PHMB 以及其他胍类化合物的研究中，其经常被作为抗菌成分与其它材料基体进行复合，在使用的过程中释放从而实现抑菌。XIN 以及其他研究者14使用静电纺丝的方式将醋酸纤维素与聚酯纤维以及 PHMB 进行复合制备获得具有抗菌性能的医用敷料。通过控制醋酸纤维素与聚酯纤维的比例调节 PHMB 从材料基体中释放的速率，避免突释现象产生。Sibbald RG 以及其研究团队15，通过将 PHMB 加入到治疗慢性伤口的发泡材料中进行抗菌研究，其实验的结果表明，相对于没有添加 PHMB 的发泡材料，抗菌效果显著提高，抗菌稳定性高。通过改性方法或改变基体材料结构能够降低抗菌成分的释放，但是针对长期抗菌需求存在缺陷。例如在复杂的水溶液环境中长期交换下，其抗菌性能是否能够保持稳定等等问题。而如何将胍类化合物与材料基体通过化学改性方法，使用更加稳定的结合方式，而非物理吸附、物理掺杂以及氢键效应的结合方面的研究还不甚深入。细菌纤维素具有非常一致的分子取向，以单一纤维的形式存在，并且形成了天然三维网络结构，因此作为一种生物医用材料具有许多天然优异的性能16。细菌纤维素纳米晶来源于通过微生物法合成的细菌纤维素。不同于纤维素纤维，细菌纤维素纳米晶体具有独特的尺度以及结晶度，其自身为高度结晶状态。其表面羟基基团为化学改性方法提供了天然的模板，一般可以将此类基团转化成羧酸、胺、醛或硫醇等其他的化学基团。而这种化学处理可以被用来接枝小分子化学物质，例如生物小分子、金属纳米粒子以及高分子片段和蛋白类物质。通过合适的抗菌改性策略，赋予细菌纤维素纳米晶优异的抗菌性能，使其作为一种新型的纳米抗菌材料得到应用。现有研究中通过在细菌纤维素纳米晶体的表面修饰纳米银粒子、抗菌高分子、松香、卟啉、凝集素以及特定抗菌病毒用于抗菌以及抗病毒感染17。细菌纤维素纳米晶体能够与众多常见的生物医用高分子例如聚酯类、聚醇类通过强烈的氢键或其他化学作用复合，其作为抗菌物质载体，能够提高抗菌物质在高分子材料基体内的稳定性，增长抗菌时效，避免抗菌物质通过浸渍等其他方法与材料基体结合后，在使用过程中产生的突释行为。同时细菌纤维素纳米晶本身易于被化学修饰，因此制备工艺的成本较低且方便，能够降低成本损耗。本研究将细菌纤维素膜片通过粉碎氧化法制备氧化改性细菌纤维素纳米晶体（NBC），将原本细菌纤维素中非结晶相去除，同时将活跃羟基氧化为羧基。并通过水热反应，在氧化细菌纤维素纳米晶体表面通过化学反应接枝双胍化合物（BG）制备获得新型纳米抗菌复合材料 NBC-BG。通过与双胍的共价的接枝改性，氧化细菌纤维素纳米晶体能够获得优异的抗菌性能，且可以解决双胍易溶水释放与使用时易突释的问题。再将不同比例的 NBC-BG与医用聚氨酯涂层（PU）复合制备PU-NBC-BG 抗菌涂层。对 NBC-BG 以及 PU-NBC-BG 抗菌涂层的材料性能、抗菌性能以及生物相容性进行测试与分析。本工作在解决医疗器械抗菌问题中具有很好前景。1 实验 1.1 试剂 氢氧化钠（NaOH,AR），Sigma-Aldrich；细菌纤维素（BC），海南亿德食品有限公司；溴化钠（NaBr,AR），上海麦克林生化试剂有限公司；溴化钾（KBr），国药集团化学试剂有限公司；次氯酸钠（NaClO,AR），国药集团化学试剂有限公司；盐酸（HCl,AR），国药集团化学试剂有限公司；双胍盐酸盐（BG,AR,97%），上海毕得医药科技有限公司；甲醇（AR），国药集团化学试剂有限公司；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶酮（TEMPO,AR），上海源叶生物科技有限公司。无水乙醇（AR），北京化工厂；聚氨酯水分散液，北京科技大学；聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）片，北京润佳宏达绝缘材料责任有限公司；LB 肉汤培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；营养琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司；青霉素链霉素（PS），美国 GIBCO 公司；胰酶，美国 GIBCO 公司。胎牛血清（FBS），美国 Life Technologies 公司；磷酸盐缓冲液（PBS），美国 Life Technologies 公司；2%结晶紫染液，北京库来博科技有限公司。1.2 仪器 精密电子天平（BS210,d0.1 mg），satorius 科学仪器（北京）有限公司；真空冷冻干燥机（FD-1），北京博医康实验仪器有限公司；电热恒温水浴锅（HW-SY21 KP4），北京市长风仪器仪表公司；傅里叶红外光谱仪（ATR FTIR SpectriumOne），美国PerkinElmer 公司；场发射扫描电子显微镜（SEM,SU8020），日本 Hitachi 公司；热重分析仪（Tg 309FI），美国 Netesch 公司；纳米压痕仪（Hysitron TI 950），30 纤维素科学与技术 第32卷第1期（2024年3月）美国海思创公司；接触角测试仪（OCA20），德国Dataphysics 公司；精密鼓风干燥箱（BPG-9040A），上海一恒科学仪器有限公司。二氧化碳恒温箱（MCO-15AC），日本三洋公司；真空干燥箱（DZF-6020），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；酶标仪（Envision），美国 PerkinElmer 公司；倒置荧光显微镜（DFC420C），德国 Leica 公司；超声波分散仪（KQ5200DE），昆山舒美超声仪器有限公司；恒温恒湿培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；紫外可见光分光光度计，美国 Perkin-Elmer 公司。1.3 NBC-BG 抗菌纳米材料的制备 在电子天平上称量约 50.0 g 的细菌纤维素与500 mL 去离子水共同加入到搅拌机中搅拌至均匀的糊状之后，使用超声波细胞粉碎机中机械粉碎 90 min，待样品温度降至室温后，取出样品通过磁力搅拌机进行搅拌直至均匀。TEMPO 氧化剂14.75 mg，NaBr 粉末 162 mg 使用研钵研磨粉碎，混合后加入样品中，将 2.82 mL NaClO 溶液缓慢滴加进样品中，使用 0.5 M 的 NaOH 溶液调节样品 pH 值 10 左右，室温条件下反应 4560 min。滴加 12 滴无水甲醇终止氧化反应，调节 pH 值 7 左右。使用离心机进行离心，（1 500 r/min，10 min）。将底部沉淀部分倒入抽滤装置之中进行抽滤洗涤，将样品中的酸碱以及盐杂质洗涤去除。最后所得到固体部分加到500 mL 去离子水中搅拌至均匀。即可得到均匀分散的氧化细菌纤维素纳米晶体水分散液。取氧化细菌纤维素纳米晶体溶液 50 mL，盐酸双胍 1 125 mg 加入至纳米晶溶液中。所得的双胍浓度 225 mg/mL。置于恒温水浴锅，60酰胺化反应24 h 获得 NBC-BG 水溶胶。1.4 PU-NBC-BG 抗菌层的制备 将聚氨酯/NBC-BG 水溶胶以体积比 201、101 以及 51 的比例进行共混后并分别命名样品为 PU-NBC-BG-20、PU-NBC-BG-10、PU-NBC-BG-5。此外取用 BG 水溶液（双胍浓度为 225 mg/mL）与聚氨酯水分散液进行混合，聚氨酯/BG 水溶液体积比为 51，制备 PU-BG 对照组以及不进行混合的PU对照组。将各组样品充分震荡并超声30 min，离心管中密封静置过夜。取用大小合适的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）透明片，将混合均匀后的样品一部分使用移液枪滴涂在 PMMA 透明片的表面，之后放于鼓风干燥箱中 60风干成膜。另一部分样品滴涂于聚四氟乙烯基底片上，放在冰箱中冷藏，随后在冷冻干燥机中冻干，将冻干后的样品片取下，在干净的研钵中研碎，分装于小试管中密封保存。1.5 红外光谱（ATR-FTIR）测试 将样品进行冷冻干燥，冷冻干燥后的样品分别使用纯净溴化钾（KBr）压片法制备出压片进行测试。分别取各个样品 10 mg 与 200 mg KBr 混合，放入研钵中研磨均匀，然后将粉末放入压片模具中制备获得压片，放入红外光谱仪中测量。收集数据，使用作图软件画出数据图。1.6 光电子能谱（XPS）测试 取氧化细菌纤维素纳米晶体分散液与NBC-BG样品分散液，分别均匀滴加至大小合适的硅片的表面。将带有样品的硅片冷冻干燥，在硅片表面形成固体样品层。对 N 和 O 进行精细谱扫描观察 N 和O 含量变化。所有结合能数据通过 C1s284.8 eV进行校准。1.7 X-射线衍射仪（XRD）测试 取细菌纤维素粉碎液，氧化细菌纤维素纳米晶体分散液与 NBC-BG 样品分散液，分别均匀滴加至大小合适的硅片表面。将带有样品的硅片冷冻干燥，在硅片表面形成固体样品层。对样品进行广角衍射测试，测试角度范围 370，测试时长 10 min。1.8 扫描电镜（SEM）形貌测试 取在 PMMA 表面成膜的 PU 对照组，PU-NBC-BG-20、PU-NBC-BG-10、PU-NBC-BG-5 样品组。喷金时长设定约为 250 s，喷金电流 12 mA。将喷金完成的样品放入扫描电镜样品仓中进行微观形貌观察。每一类样品设置 4 组平行样品，选取 4 个不同的点进行拍摄。1.9 X-射线能谱（EDS）分析测试 实验操作同 SEM 测试仪器以及操作，测试样品为 PU 对照组，PU-NBC-BG-20、PU-NBC-BG-10、PU-NBC-BG-5 样品组。测试模式调为 EDS 模式。1.10 抗菌层纳米压痕测试 通过使用纳米压痕仪对PMMA表面成膜的PU对照组，PU-NBC-BG-20、PU-NBC-BG-10、PU-NBC-BG-5 样品组进行测试。测试深度为 200 nm，在表面上各取 10 个点进行测试。通过收集纳米压痕的数据可以绘制仪器进行压痕测试时的深度-应力曲线，并通过仪器平均计算获得样品的等效弹性模量以及表面硬度数据。1.11 表面接触角测试 通过对 PMMA 表面成膜的 PU 对照组，PU-NBC-BG-20、PU-NBC-BG-10、PU-NBC-BG-5 样品组进行表面接触角测试，可以探究 NBC-BG 抗菌复杨惠仪等：功能化细菌纤维素纳米晶复合聚氨酯医用抗菌涂层的制备及性能研究 31 合材料的引入对 PU 基体结构亲疏水性能的影响。通过其亲疏水性评价 PU-NBC-BG 作为抗菌层的涂层应用性能。1.12 生物相容性测试 通过 CCK-8 法来评价 PU-NBC-BG 的生物相容性，其中设置的实验组为 PU 组、PU-NBC-BG20组、PU-NBC-BG10 组、PU-NBC-BG5 组以及 PBS溶液作为空白对照组。取用无菌的 24 孔细胞培养板，取各组样品置于到孔板中，每种样品平行设置3 个孔，同时取用 3 个培养板以用来分别测定 1、3、5 天的数据。待染色完成后，将培养板放在酶标仪中，设置波长为 450 nm，观察样品孔区域的吸光度值（OD 值）。根据所得数据进行计算，其中细胞活性的数值通过公式（1）进行计算。细胞活性/%(实验组 OD 值空白孔 OD 值)(对照组 OD 值空白孔 OD 值)100 （1）1.13 抗菌活性和稳定性 使用共培养菌落计数法评价 PU-NBC-BG 涂层的抗菌活性，制备金黄色葡萄球菌（S.aurues）和大肠杆菌（E.coli）的标准菌液，恒温恒湿培养后涂布，计算菌落数和抑菌率。抗菌稳定性通过循环浸洗的方法实现。以无菌 PBS 和无菌水浸洗反复 3 次为一个浸洗周期，分别进行个 5 和 10 个的周期，每次浸洗后对样品进行共培养抗菌性能测试，计算菌落数和抑菌率。1.14 抗生物膜性和稳定性 使用结晶紫染色法评价 PU-NBC-BG 涂层的抗生物膜性能，制备 S.aurues 和铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的标准菌液，经培养后染色，利用酶标仪在 595 nm 处测定吸光度，根据公式（2）计算生物膜抑制率。稳定性同样利用结晶紫染色完成，循环浸洗过程与“1.13”相同。生物膜抑制率/%1(实验组 OD 值空白组 OD 值)(对照组 OD 值空白组 OD 值)100 （2）2 结果与讨论 2.1 PU-NBC-BG 医用涂层的成分表征 利用 TEMPO 氧化法将细菌纤维素羟基氧化为羧基，将双胍盐酸盐接枝到氧化细菌纤维素纳米晶的羧基中（图 1a）。通过对红外图像的分析可知：根据标准细菌纤维素纳米晶的红外图谱，细菌纤维素在 3380 cm-1、2900 cm-1、1640 cm-1、1050 cm-1有对应的峰强度。而在通过机械精制粉碎的细菌纤维素中观察到了对应的峰，符合正常预期（图 1a）。而对比氧化细菌纤维素纳米晶（BC-COOH）与细菌纤维素（BC）之间进行比较发现，1620 cm-1波数附近 BC-COOH 出现了远超于 BC 的震动吸收峰，该处吸收峰为羧酸基团中 C=O 键的震动吸收峰，而该峰峰强的明显增强说明 BC-COOH 中产生了大量的羧基基团，符合 TEMPO 氧化法对细菌纤维素羟基氧化为羧基实验的预期。进一步比较 NBC-BG 抗菌纳米材料与 BC-COOH 以及 BC 材料之间吸收峰的差异，在 3395 cm-1以及 3158 cm-1波数附近出现了明显的双峰，而这是-NH2基团存在的震动吸收峰，而 1650 cm-1以及 1600 cm-1波数附近出现的明显双峰，是-CO-NH-酰胺键结构中-NH-结构的特征吸收峰。因此从这些红外吸收峰的信号可以看出：对 BC-COOH 进行双胍的接枝改性之后，NBC-BG 抗菌纳米材料出现了丰富的-NH2结构以及 BG 与 BC-COOH 之间成功通过酰胺键进行了化学接枝，符合了实验的预期。图 1 PU-NBC-BG 医用涂层的制备及原理（a.NBC-BG 的制备；b.PU-NBC-BG 的制备及机理）32 纤维素科学与技术 第32卷第1期（2024年3月）从红外图谱的整体吸收峰的趋势来看，各组之间在化学结构上没有十分明显的差异。但同时 35703450 cm-1附近为分子间氢键的主要吸收峰，从图谱上可以看出，该处的吸收峰有向尖锐增强的趋势（图 2c）。这一点可以表明材料内部形成了氢键作用，与理论预期相同。氢键的存在可以使 NBC-BG 更加均匀且稳定地在 PU 内部结合。此外可以观察到 16501600 cm-1波数附近的酰胺键-NH-振动峰有增强的趋势，这一点可能是 NBC-BG 上存在的-NH2基团与 PU 中部分端口羧基结构形成一定的键合作用所造成的。总体上来看，NBC-BG 的加入没有改变 PU 的主要化学结构，有氢键作用形成，在 PU 内部成功复合。图2 PU-NBC-BG 医用涂层的成分表征（a.NBC-BG 的红外表征；b.NBC-BG 的XRD 测试；c.PU-NBC-BG 的红外表征）；BC-COOH 以及 NBC-BG XPS 窄扫峰图（d.BC-COOH N1s 窄扫峰图；e.BC-COOH O1s 窄扫峰图；f.BC-COOH C1s 窄扫峰图；g.NBC-BG N1s 窄扫峰图；h.NBC-BG O1s 窄扫峰图；i.NBC-BG C1s 窄扫峰图）可以看出，BC 在 214.5 以及 222.4 附近具有明显的衍射峰，所对应的是(-110)与(200)晶面，这符合天然纤维素 I 型的结晶结构（图 2b）。比较 BC-COOH 与 BC 的结构可以发现，BC-COOH中在 214.5 以及 222.4 附近依然存在衍射峰，但衍射峰的强度明显降低，这对应了氧化过程中，氧化完全破坏了非结晶的部分，但同时对于样品中的结晶部分也会存在破坏作用。因此工艺中要严格控制氧化剂的用量以及氧化的时间，从而避免晶体结构的过度破坏。使用 TEMPO 法对纤维素纳米晶体进行氧化，虽然对晶体结构有所影响，但不会造成晶体结构的完全破坏。从整体的曲线趋势中可以看到纤维素纳米晶的大致线型，但同时引入的双胍化合物是一种强结晶盐，具有较强的晶体衍射峰信号，会将原本的纤维素纳米晶的信号掩盖。但这些衍生峰信号能够说明在接枝之后双胍化合物的存在。针对样品进行了 O1s、N1s、C1s 结合能附近的精细扫描（图 2d2i），首先从 N1s 的峰图中进行分析，可以看到 BC-COOH 样品中 N1s 几乎没有峰强度，说明了 BC-COOH 本身的化学结构中没有 -NH2结构的存在，而 NBC-BG 抗菌纳米材料中，N1s 的峰具有相当强的信号，说明材料表面的 N 元素大量存在，阳离子基团被成功接枝，从这一点上证明了其完成了阳离子化改性。从 O1s 的精细扫描数据进行分析，在未进行接枝改性时，BC-COOH 样杨惠仪等：功能化细菌纤维素纳米晶复合聚氨酯医用抗菌涂层的制备及性能研究 33 品表面 O 元素结合能很强，反应出了 BC-COOH 表面存在的丰富羟基与羧基结构，而在接枝之后，N峰明显增强，而 O 峰出现了明显的下降，这一现象说明了双胍与 BC-COOH 表面上的羧基进行了反应，将原本表面上 O 作为主导元素替换为 N，形成了酰胺键。从 C1s 的精细扫描数据进行分析，改性前后的样品都存在 286 eV 的标准 C1s 峰，但相对改性前、改性后的 NBC-BG 抗菌纳米材料在 288.2 eV 附近出现了明显的峰，而该峰是C在酯键中的特征峰。从而说明了 NBC-BG 改性接枝过程中 NBC 与 BG之间形成了酯键。2.2 PU-NBC-BG 医用涂层的表面结构及性能表征 2.2.1 PU-NBC-BG 医用涂层的结构及元素分布 图 3A 显示 PMMA 基板表面 PU 涂层以及各实验组涂层的扫描电镜图像，其中 PU 涂层以及 PU-NBC-BG20 以及 PU-NBC-BG10 呈现的是表面光滑致密的状态，这与这两个样品组 NBC-BG 添加的含量较低有关，且大多分别于 PU 分子链结构内部，在表面上不产生明显的团聚行为，因此与 PU 涂层的结构基本一致。而 PU-NBC-BG5 涂层光滑程度降低，出现一定的纹理，这可能是 NBC-BG 添加量进一步提高造成的。但总体可以看出，NBC-BG 抗菌纳米材料的引入对 PU 整体的结构形貌没有引起较大的变化，也说明了 NBC-BG 更倾向在 PU 内部结构分散。使用 EDS 测试分析了 PU-NBC-BG 抗菌层化学元素的分布以及比重变化（图 3B）。在 PU 中引入一定量的 NBC-BG 抗菌纳米材料，对于材料本身的 N 和 O 元素的比重会发生相应的变化，而其变化可以证明两者实现复合。如图中分别显示了 PU对照组，PU-NBC-BG-20、PU-NBC-BG-10、PU-NBC-BG-5 样品组的 N 和 O 元素分布。由于 PU 本身化学结构中也具有丰富的 N 和 O 元素，为了分析评定 NBC-BG 抗菌纳米材料的引入的影响，应当对于样品的 N 和 O 占比变化进行测试分析。NBC-BG 抗菌纳米材料由于接枝双胍的化学结构中具有较多的 N 元素比重，因此应当随着 NBC-BG 抗菌纳米材料引入的量的增加，N 的含量比重会有一定的增加。通过对 EDS 各组中 N 和 O 激发跃迁信号的收集，样品的 N 和 O 成分比重变化如表 1，对各个样品取 4 个平行点的平均计算。其中以 N 和 O 元素总比为 100%进行统计，其中 PU 样品的 O 元素比重为 94.00%，N 元素比重为 6.00%；PU-NBC-BG20 样品的 O 元素比重为 92.38%，N 元素比重为 7.62%；PU-NBC-BG10 样品的 O 元素比重为91.25%，N 元素比重为 8.75%；PU-NBC-BG5 样品的 O 元素比重为 90.07%，N 元素比重为 9.93%。随着 NBC-BG 抗菌纳米材料在共混时的所占体积的比的增加，PU-NBC-BG 样品中 N 元素和 O 元素比重也随之增加，由于 NBC-BG 本身不在表面团聚，因此 N 元素的比重增加相对平缓，但能够说明其在PU 中成功分散复合。图3 PU-NBC-BG 医用涂层的结构及元素分布（A）SEM 图像（a.PU；b.PU-NBC-BG20；c.PU-NBC-BG10；d.PU-NBC-BG5）；（B）EDS 元素分布（O-左侧红色，N-右侧绿色）（a.PU；b.PU-NBC-BG20；c.PU-NBC-BG10；d.PU-NBC-BG5）34 纤维素科学与技术 第32卷第1期（2024年3月）表 1 表面 N 和 O 元素占比变化 名称 O 元素比重/%N 元素比重/%PU 94.00 6.00 PU-NBC-BG20 92.38 7.62 PU-NBC-BG10 91.25 8.75 PU-NBC-BG5 90.07 9.93 2.2.2 PU-NBC-BG 医用涂层的表面硬度 PMMA 表面成膜的 PU 对照组，PU-NBC-BG20、PU-NBC-BG10、PU NBC-BG5 样品组进行的纳米压痕实验，实验通过选取 10 个点进行平均计算。图 4a为实验中样品的等效弹性模量性能，其中 PU 组弹性模量为 202.774.36 kPa，PU-NBC-BG20 组的弹性模量为 203.361.03 kPa，PU-NBC-BG10 组的弹性模量为 204.211.40 kPa，PU-NBC-BG5 组的弹性模量为 204.461.37 kPa。图 4b 为实验中纳米压痕实验中样品的膜表面硬度，其中 PU 组表面硬度为 200.840.95 kPa，PU-NBC-BG20 组表面硬度为201.291.45 kPa，PU-NBC-BG10 组的表面硬度为202.812.15 kPa，PU-NBC-BG 组的表面硬度为203.643.41 kPa。从这些数据分析可以得出，NBC-BG 抗菌纳米材料的引入对于 PU 而言，并没有影响 PU 原本的力学性能，并且随着抗菌纳米材料加入的量的增加材料整体的力学性能有轻微的增加。而其中可能的原因是由于 NBC-BG 抗菌纳米材料能够均匀的分散在 PU 基体内部，同时与 PU 分子链上的-NH-等基团形成氢键作用，并且由于 NBC-BG 抗菌纳米材料自身的力学性能比较优异，其结晶部分具有高模量、高强度。从而在分子结构的角度上，NBC-BG 在 PU 内部形成轻微的增强结构，其均匀的分散没有破坏 PU 原本的内部链段结构，同时又通过氢键作用使分子链段之间的联系更加牢固紧密，同时没有发生因纳米材料结构引起的纳米材料团聚现象，因而没有降低 PU 原本的力学性能。从这一点上可以看出将 NBC-BG 材料引入在分子链内部形成氢键或者其他键合作用的高分子基体而言，不会降低原本高分子聚合物的力学性能。图 4 纳米压痕测试结果（a.PU 以及 PU-NBC-BG 各组等效弹性模量；b.PU 以及 PU-NBC-BG 各组表面硬度）2.2.3 PU-NBC-BG 医用涂层的表面接触角 图 5 所示的是 PU 对照组、PU-NBC-BG-20、PU-NBC-BG-10、PU-NBC-BG-5 样品组接触角形貌，表2 为 PMMA、PU 以及 PU-NBC-BG 各组接触角数据。可以观察到 PMMA 基体材料的左接触角为92.573.04，右接触角为 92.34.60，疏水性能明显。PMMA 基体表面覆盖 PU 涂层后，PU 组的左接触角为 51.435.56，右接触角为 50.200.43。PU-NBC-BG20 的左接触角为 50.301.70，右接触角为 50.731.69。PU-NBC-BG10 组的左接触角为46.533.55，右接触角为 46.033.55。PU-NBC-BG5 组的左接触角为 39.534.38，右接触角为39.134.97。从数据中可以得出，PU 基体涂层是较为亲水的涂层结构，同时随着 NBC-BG 材料引入量的增加，涂层向更加亲水的方向变化。这是由于NBC-BG 中，纤维素纳米晶存在丰富的羟基结构，具有亲水性的特质。而对于 NBC-BG 作为抗菌成分，合适的亲水性能能够增加其与游离细菌相互作用的程度，较大程度的发挥其抗菌性质。图 5 PMMA、PU 及 PU-NBC-BG 各组接触角图像 杨惠仪等：功能化细菌纤维素纳米晶复合聚氨酯医用抗菌涂层的制备及性能研究 35 表 2 PMMA、PU 以及 PU-NBC-BG 各组接触角数据 名称 左接触角/（）右接触角/（）PMMA 92.573.04 92.34.60 PU 51.435.56 50.200.43 PU-NBC-BG20 50.301.7 50.731.69 PU-NBC-BG10 46.533.55 46.033.55 PU-NBC-BG5 39.534.38 39.134.97 2.3 PU-NBC-BG 医用涂层的生物相容性 从吸光度的数据来看，所有组都在 1、3、5 天保持正常的细胞增殖状态，没有出现生长停滞甚至抑制的状态。这表明 PU-NBC-BG 对于 rADSCs 细胞增殖作用没有明显的抑制作用，具有比较良好的生物相容性。PU 本身是一类常用的生物医用高分子材料，生物相容性良好。而 NBC-BG 通过控制双胍接枝浓度也不会影响基体材料的生物相容性，因此这一结果与预期相符合。从细胞活性的数据来看，在第 5 天的数据中，PU-NBC-BG20 样品组的细胞活性为 92.06%8.85%，PU-NBC-BG10 样品组的细胞活性为 85.16%4.27%，PU-NBC-BG5 样品组的细胞活性为 84.54%1.08%，以及 PU 组的细胞活性为 94.56%5.10%。所有组的细胞活性均高于 80%，说明样品对于细胞没有抑制与毒性作用。各组具有良好的生物相容性。图 6 PU-NBC-BG 抗菌层 CCK-8 实验结果（a.rADSCs 培养液 1、3、5 天吸光度；b.rADSCs 1、3、5 天细胞活性）2.4 PU-NBC-BG 医用涂层的抗菌活性和稳定性 医用抗菌涂层应当具有广谱抗菌性能，对革兰氏阳性菌和阴性菌都具有优异的抑制或杀灭作用；同时涂层还应具有合适的抗菌周期和抗菌稳定性，避免抗菌成分的突然释放，保证使用期内的有效性。采用平板涂布法模拟使用环境下，游离细菌对于材料的浸染过程（图 7a），以 S.aurues 和 E.coli 分别为研究对象，初步评价材料的广谱抗菌性。研究发现，无论是 S.aurues 还是 E.coli，在纯 PU 涂层上均出现密集的细菌菌落，而双胍改性细菌纤维素纳米晶（NBC-BG）表现出对细菌的明显抑制作用。这是因为双胍中含胺类阳离子，能够有效结合细菌的电负性细胞膜，使细胞内质泄露死亡18。通过改变PU 和纳米晶的复合比例，可有效调节涂层的抗菌性能。随着改性纳米晶含量的提高，涂层的抗菌效果提高，对 S.aurues 的抑菌率由 72.38%2.02%提高至 99.52%0.21%（图 7c），对 E.coli 的抑菌率由85.49%3.00%提高至 99.44%0.42%（图 7d）。相比之下，将双胍化合物直接复合于 PU 中（PU-BG）的抗菌能力不及 PU-NBC-BG5，这可能是因为在没有纳米晶的中介作用时，BG 会团聚导致分布不均。图 7 医用抗菌涂层 PU-NBC-BG 的抗菌活性（a.抗菌涂层的菌落计数宏观实验图；b.抗菌涂层的菌落数目；c.抗菌涂层对金黄色葡萄球菌的抑菌率；d.抗菌涂层对大肠杆菌的抑菌率）36 纤维素科学与技术 第32卷第1期（2024年3月）进一步探究涂层的抗菌稳定性。由于胍类化合物良好的水溶性，这一类抗菌材料在单独使用时极易流失失效，通过复合改性控制其释放至关重要。利用水浸洗循环模拟实验测试（图 8a8d）。在水浸洗过程中，PU-BG 的抗菌性能下降最为明显，证明缺乏强结构约束时，BG 会随浸洗大量流失。PU-NBC-BG20 中少量的双胍首先在与 PU 共混的过程中相容性较差，因此造成可能分布不均等结构缺陷，而进一步在水浸洗循环的过程中，由于缺乏较强的结构约束，因此随水溶解，造成抗菌成分的大量流失，出现抗菌性能大幅下降。复合量增加后，抗菌成分得到有效保存，即使 10 次循环浸洗后，PU-NBC-BG5的抑菌率仍维持在96.73%0.84%（S.aurues）和 97.45%0.46%（E.coli），这得益于 BG 与纳米晶的化学结合以及 PU 与纳米晶间的强氢键作用。尽管PU-NBC-BG5的表面形貌较PU-NBC-BG20的样品粗糙（图 3A），但在 PU 内部分布高含量的改性纳米晶能够通过化学方式和氢键作用锚定在 PU基体上，保证其抗菌稳定性。因此，以体积比 51复合 PU 基体和 NBC-BG 纳米晶，获得了具有良好广谱抗菌活性和抗菌稳定性的医用涂层。图 8 医用抗菌涂层 PU-NBC-BG 的抗菌稳定性（a.抗菌涂层浸洗循环前后金黄色葡萄糖球菌菌落计数宏观实验图；b.抗菌涂层浸洗循环前后大肠杆菌菌落计数宏观实验图；c.抗菌涂层循环浸洗前后对金黄色葡萄糖球菌的抑菌率；d.抗菌涂层循环浸洗前后对大肠杆菌的抑菌率）2.5 PU-NBC-BG 医用涂层的抗生物膜性能和稳 定性 除对细菌的抑制或杀灭作用外，医用涂层还应当尽量抑制生物膜的形成。因为细菌生物膜起到保护膜内的细菌菌落不受影响的作用，导致抗菌药物或材料不能完全发挥作用，进而发生慢性或反复性感染19。通过结晶紫染色法测定涂层对 S.aurues 和 P.aeruginosa 这两种能够快速滋生生物膜的细菌的抑制程度。以空白组和 PU 涂层作为对照，由图 9a，随着复合 BG 含量的提高，PU-NBC-BG5 的抑菌率最大达到 80.6%2.41%（S.aurues）和 83.4%2.98%（P.aeruginosa）。PU-BG 的效果不及 PU-NBC-BG5仍可归咎于双胍的良好水溶性和不均匀分布。同理证明，通过反复浸洗后（10 次），由于结合力弱且水溶性好，PU-BG 对生物膜的抑制效果大幅下降，而 PU-NBC-BG5 在反复浸洗前后，仍能维持大于 70%的抑菌率（图 9b）。考虑到纳米材料表面能高而易团聚的特性，若继续提高 NBC-BG 的含量，可能会出现浸洗后纳米材料的大量脱落，导致稳定性下降，这也是后续值得探究的内容。生物膜是细菌菌落构建的胞外多糖结构，会阻碍抗菌成分对菌落的杀灭，而本研究中设计的 PU-NBC-BG5 能够有效杀菌并保持抗细菌生物膜的稳定性，这对于降低细菌感染风险具有重要意义。杨惠仪等：功能化细菌纤维素纳米晶复合聚氨酯医用抗菌涂层的制备及性能研究 37 图 9 医用抗菌涂层 PU-NBC-BG 的抗生物膜性能和稳定性（a.抗菌涂层对生物膜的抑制率；b.抗菌涂层循环浸洗前后对生物膜的抑制率）3 结论 以高结晶度的细菌纤维素为原料通过粉碎氧化法制备获得氧化细菌纤维素纳米晶材料，将其与双胍盐酸盐通过水热反应进行化学接枝，最终成功获得了阳离子改性抗菌细菌纤维素纳米晶材料。在 PU 中以不同比例引入 NBC-BG 抗菌纳米材料，制备获得 PU-NBC-BG 抗菌涂层。1）通过红外等多种材料表征手段，证明了复合过程中酰胺键的形成以及游离氨基的存在，通过粉碎氧化法制备不会过度破坏细菌纤维素原有的晶体结构。随着 NBC-BG 引入的比重增加，氢键以及酰胺键信号的增强，EDS 数据中 N 和 O 比逐渐增加。这些证明了 N