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葛根素对过氧化氢诱导人心肌细胞损伤的影响.pdf
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1、172024,14(1)医师在线 第 14 卷 第 1 期论著葛根素对过氧化氢诱导人心肌细胞损伤的影响韩冰仪1,王震航1,薛姣姣1,顾晶1,张棋1,孙妍1,曾妙1,张靖唯2,金嘉康1,张璐3*(1 沈阳医学院基础医学院,沈阳 110034;2 沈阳医学院口腔医学院,沈阳 110034;3 沈阳医学院科学实验中心,沈阳 110034)【摘要】目的 观察葛根素对过氧化氢(H2O2)诱导的人心肌细胞的线粒体功能的影响,并探求其机制。方法 培养人心肌细胞系AC16,高糖完全培养基培养内加入与 H2O2等体积的磷酸缓冲盐溶液作为对照组;通过 H2O2(200 mol/L)诱导建立心肌细胞损伤模型(模型组
2、);并采用低、中、高剂量(50 mol/L、100 mol/L、200 mol/L)葛根素处理心肌细胞,给药 48 h 后,采用 MTT法检测细胞活力;以 Western blot 检测 Mzb1、磷酸化-Drp1/Drp1 的蛋白表达;以一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况;以 ATP 检测试剂盒检测细胞内 ATP 的水平;通过脂质体转染 siRNA 沉默细胞内 Mzb1 的表达水平。结果 与对照组相比,模型组细胞活力显著下降,细胞凋亡率明显升高,Mzb1 表达量显著降低,ATP 含量显著降低,磷酸化-Drp1/Drp1 表达升高;与模型组相比,葛根素低剂量组、中剂量组和高
3、剂量组 AC16 细胞中 Mzb1 及细胞活力有所恢复,细胞凋亡率显著降低,Mzb1 表达明显升高,ATP 含量显著升高,磷酸化-Drp1/Drp1 表达明显下降;沉默 Mzb1 后,葛根素对细胞活力及磷酸化-Drp1/Drp1 表达的影响均被阻断。结论 葛根素通过 Mzb1/Drp1 通路恢复线粒体功能,改善 H2O2诱导的心肌细胞损伤。【关键词】葛根素;心肌细胞;凋亡;线粒体功能Effect of puerarin on human cardiomyocytes injury induced by H2O2HAN Bing-yi*,WANG Zhen-hang,XUE Jiao-jiao,
4、et al.*School of Basic Medical Sciences,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China.【Abstract】Objective To detect the effect and mechanism of puerarin on mitochondrial function of human cardiomyocytes induced by H2O2.Methods AC16 human cardiomyocytes were cultured,the equal volume of PBS with H2O
5、2 was added into the high glucose complete medium as the control group,cells were induced by H2O2(200 mol/L)to establish a model of cardiomyocytes injury(model group),and treated with puerarin at low,medium and high doses(50 mol/L,100 mol/L,200 mol/L).After 48 h administration,the cell viability was
6、 detected by MTT assay.The protein expression of Mzb1 and phosphorylation-Drp1/Drp1 were detected by Western Blot.One step TUNEL apoptosis assay kit was used to measure apoptosis level.The content of intracellular ATP was detected by ATP detection kit.siRNA was transfected with lipofectamine to sile
7、nce the expression of Mzb1.Results Compared with the control group,the cell viability of the model group was significantly decreased,the apoptosis rate was significantly increased,the expression of Mzb1 was significantly decreased,the ATP content was significantly decreased,and the expression of pho
8、sphorylation-Drp1/Drp1 was increased.Compared with the model group,Mzb1 and cell viability of AC16 cells in the low dose,middle dose,and high dose puerarin groups were recovered,the apoptosis rate was significantly decreased,the expression of Mzb1 was significantly increased,the ATP content was sign
9、ificantly increased,and the expression of phosphorylation-Drp1/Drp1 was significantly decreased.After silencing Mzb1,puerarin affected the cell vitality and phosphorylation-Drp1/Drp1 expression were blocked.Conclusion Puerarin ameliorates H2O2-induced cardiomyocyte injury and mitochondrial function
10、through Mzb1/Drp1 signal pathway.【Key words】Puerarin;Cardiomyocyte;Apoptosis;Mitochondrial function急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)易导致严重的心力衰竭,且发病人群有年轻化趋势1-2。在心肌梗死发生期间,血液供应的减少或血流突然中断会诱发心肌细胞死亡或功能障碍,最终可导致心力衰竭3。尽管目前的介入治疗和药物治疗为心肌梗死患者带来了较好的临床结果,然而心肌梗死带来的风险仍然很高。因此,寻求更有效的治疗手段,并阐明其机制至关重要。葛根素是一种从葛根中分离出
11、来的异黄酮,具有广泛的药理特性,基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目 (82100316);辽宁省教育厅科学技术研究(面上项目)(LJKZ1135);辽宁省博士科研启动基金计划项目(2022-BS-342);沈阳医学院大学生科研课题(20219036)*通信作者:张璐,Email:182024,14(1)医师在线 第 14 卷 第 1 期论著如舒张血管、保护心脏、抗氧化、抗细胞凋亡和降低胰岛素抵抗等4-7。葛根素可以通过调节线粒体动力相关蛋白(Dynamin-related protein 1,Drp1)的表达改善线粒体功能,但其机制仍需深入探究。前期研究发现,边缘区B 和 B1 细胞特
12、异性蛋白(Marginal zone B and B1 cell specific protein,Mzb1)作为线粒体保护因子在心肌梗死中发挥重要作用8,本实验基于 Mzb1/线粒体信号通路探讨葛根素对过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)诱导的心肌细胞损伤的影响。1 材料与方法1.1 材料人永生化心肌细胞 AC16 由哈尔滨医科大学提供。葛根素购于美国 Sigma 公司;高糖培养基(Dulbeccos modified eagle medium,DMEM)购于美国 Cytiva 公司;胎牛血清购于武汉优试生物技术有限公司;牛血清白 蛋 白(Bovine Serum Alb
13、umin,BSA)、青 链 霉 素混合液、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司;胰蛋白酶/EDTA 消化液购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;ATP 检测试剂盒、超敏化学发光底物(Enhanced chemiluminescent,ECL)以 及 一 步法检测脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick
14、end labeling,TUNEL)试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司;Mzb1 及 Drp1 一抗抗体购于美国 Abcam公司;3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司;磷酸化-Drp1(p-Drp1)一抗抗体购于江苏亲科生物研究中心有限公司;Mzb1 沉默序列(si-Mzb1)及阴性对照序列(si-NC)购于广州锐博生物技术有限公司;RNA 提取、逆转录及 PCR 试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养选择含有 10%的胎牛血清及 1%青链
15、霉素混合液的高糖完全培养基,置于温度 37、含有 5%CO2和 95%空气的细胞培养箱中培养AC16细胞;细胞汇合度达90%以上,弃掉培养基后加入 2 ml 胰蛋白酶消化细胞,待细胞缩呈球状,加入完全培养基,中止消化;将细胞完全从瓶壁吹打下来,加入适宜体积的完全培养基后,将混悬细胞按照不同密度分别接种于 6 孔板、12 孔板、24 孔板及 96 孔板,用于后续实验研究。细胞分组如下:对照组:高糖完全培养基培养内加入与 H2O2等体积的磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline,PBS);模型组:高糖完全培养基培养加入终浓度为 200 mol/L 的 H2O2培养 12
16、h;葛根素低、中、高剂量组:采用葛根素(终浓度分别为 50 mol/L、100 mol/L、200 mol/L)以及等体积的溶剂培养细胞 36 h,随后加入终浓度为 200 mol/L 的 H2O2继续培养12 h。收集细胞用于进一步的检测。1.2.2 细胞转染将 AC16 细胞按照 1.0105/孔的密度接种于 6 孔板,培养 12 h;弃掉完全培养基,加入不含血清的 DMEM 进行 siRNA 转染:si-Mzb1 及 si-NC;按说明书,每孔依次加入 12 L riboFECT CP Buffer(10)、108 L DMEM、3 L si-NC 或 si-Mzb1 以及 12 L r
17、iboFECT CP Reagent,用 DMEM 补足至 2 ml/孔,放入细胞培养箱中培养48 h后,收集对照组、si-NC组及si-Mzb1组细胞,检测 siRNA 敲减效率。Mzb1 参与葛根素调控作用的研究细胞分组:对照组和模型组处理方法同“1.2.1 细胞培养”;高剂量组:AC16细胞采用葛根素(终浓度 200 mol/L)处理,36 h 后加入终浓度为 200 mol/L 的 H2O2继续培养 12 h;高剂量+si-Mzb1 组:AC16 细胞采用葛根素(终浓度 200 mol/L)处理,同时转染 si-Mzb1,36 h 后加入终浓度为 200 mol/L 的 H2O2继续培
18、养 12 h;高剂量+si-NC 组:AC16 细胞采用葛根素(终浓度 200 mol/L)处理,同时转染 si-NC,36 h后加入终浓度为 200 mol/L 的 H2O2继续培养 12 h。1.2.3 MTT 实验将AC16细胞按照3.0103/孔的密度接种于96孔板,培养 12 h;按照细胞分组处理细胞;用 5 mg/mL MTT(20 L/孔)处理细胞4 h。小心地吸出DMEM保留结晶,加入二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(150 L孔),室温状态下放置水平摇床 10 min;使用荧光酶标仪检测 490 nm 波长的吸光度值。1.2.4 TUNEL 实验将
19、细胞接种于 24 孔板,培养 12 h;按照细胞分组处理细胞;使用 4%多聚甲醛固定细胞 30 min,使用 PBS 洗涤 1 次;加入含 0.3%聚乙二醇辛基苯基醚(p-iso-Octyl phenoxy polyethoxyethanol,Triton X-100)的 PBS 室温孵育 5 min,用 PBS 洗涤 3 次;每孔加入 50 L 的 TUNEL 检测液,37避光孵育 1 h,用 PBS 洗涤 3 次;采用 5 g/mL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,192024,14(1)医师在线 第 14 卷 第 1 期论著DAPI
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